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    基于計(jì)算機(jī)模擬技術(shù)分析去氫樅酸作為PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路抑制劑的潛力

    2021-05-11 13:26:14李翠萍陳乃源李昕宇盧國(guó)棟
    關(guān)鍵詞:藥代殘基氫鍵

    李翠萍,陳乃源,李昕宇,盧國(guó)棟

    1廣西醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院;2廣西醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院;3廣西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院;4廣西高校高發(fā)疾病預(yù)防與控制研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,南寧 530021

    PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路對(duì)細(xì)胞的增殖、分化和凋亡等過(guò)程起著重要作用,在許多腫瘤細(xì)胞中存在過(guò)度激活的現(xiàn)象,并被發(fā)現(xiàn)可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞耐藥性的產(chǎn)生[1,2]。而抑制該信號(hào)通路的激活能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡,也能恢復(fù)腫瘤細(xì)胞對(duì)藥物的敏感性[3]。因此,開(kāi)發(fā)小分子PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路抑制劑成為抗腫瘤藥物的研究熱點(diǎn)之一[4]。去氫樅酸(DHA)是一種重要的三環(huán)二萜類天然樹(shù)脂酸,也是傳統(tǒng)中藥松香的成分之一,主要由松香經(jīng)歧化反應(yīng)后分離獲得。其性質(zhì)穩(wěn)定且具有與甾類分子類似的結(jié)構(gòu),目前已被廣泛用于熒光試劑和藥物中間體的合成與開(kāi)發(fā)。去氫樅酸及許多它的衍生物表現(xiàn)出良好的抗腫瘤活性[5-7]。近期報(bào)道顯示,去氫樅酸的1H苯并[d]咪唑類衍生物對(duì)PI3Kα有抑制效果,能夠下調(diào)磷酸化AKT的表達(dá)[8]。我們的研究也發(fā)現(xiàn),部分B環(huán)改性的去氫樅酸衍生物能夠降低磷酸化的PI3K、AKT、mTOR表達(dá)水平,同樣也能降低其下游效應(yīng)器S6和4EBP1的磷酸化水平[9]。雖然不同去氫樅酸衍生物對(duì)PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路蛋白表現(xiàn)出了一定的抑制作用,但去氫樅酸本身是否具有相應(yīng)的抑制能力,目前尚不清楚,有待進(jìn)一步的研究。

    大多數(shù)化合物通過(guò)與蛋白分子的結(jié)合產(chǎn)生效應(yīng)作用,其結(jié)合模式和結(jié)合能力可通過(guò)蛋白晶體解析和蛋白熒光猝滅等手段來(lái)驗(yàn)證,但實(shí)驗(yàn)周期較長(zhǎng),成本較高。分子對(duì)接技術(shù)是一種利用計(jì)算機(jī)進(jìn)行理論計(jì)算預(yù)測(cè)化合物與受體蛋白結(jié)合情況的手段,可根據(jù)對(duì)接結(jié)合能的大小判斷化合物與蛋白的結(jié)合能力,篩選出潛在的蛋白調(diào)節(jié)劑;也可通過(guò)所得的對(duì)接構(gòu)像和其他的對(duì)接評(píng)分進(jìn)行初步的機(jī)理研究[10-12]。此外,了解化合物在人體的吸收、分布、代謝、排泄和毒性等類藥性和藥代動(dòng)力學(xué)特性可以判斷其是否可作為臨床治療的候選化合物。為了降低研究成本,計(jì)算機(jī)輔助程序已逐漸被用于類藥性和藥代動(dòng)力學(xué)的初步研究[13,14]。

    因此,本研究利用分子對(duì)接技術(shù)預(yù)測(cè)去氫樅酸與該通路關(guān)鍵蛋白的結(jié)合能力和結(jié)合方式,并用蛋白免疫印跡法驗(yàn)證去氫樅酸的實(shí)際抑制情況,進(jìn)一步利用網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器進(jìn)行類藥性與藥代動(dòng)力學(xué)的模擬,以初步了解去氫樅酸作為PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路抑制劑的潛力,為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)去氫樅酸提供理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 分子對(duì)接

    1.1.1 蛋白數(shù)據(jù)獲取

    本研究選取人癌細(xì)胞中過(guò)度激活的Ⅰ類PI3K催化亞基p110的四個(gè)亞型α、β、γ、δ[15],AKT的3種亞型AKT1、AKT2、AKT3、以及mTOR[16]進(jìn)行研究。蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)主要從RCSB Protein Data Bank(PDB)數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.rcsb.org/)中獲取,蛋白文件ID分別為:PI3Kα(4ZOP)、PI3Kβ(4J6I)、PI3Kγ(3L54)、PI3Kδ(4GB9)、AKT1(3MVH)、AKT2(3D0E)和mTOR(4JT6),配體均為ATP-競(jìng)爭(zhēng)抑制劑。AKT3結(jié)構(gòu)的PDB文件通過(guò)Phyre2網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器預(yù)測(cè)得到[17]。

    1.1.2 配體文件的準(zhǔn)備

    蛋白文件中的配體分子經(jīng)PyMOL Molecular Graphics System(Version 2.0 Schr?dinger,LLC)提取后保留為“.pdb”格式備用。去氫樅酸(圖1)和前期研究中的去氫樅酸基PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路抑制分子(含吡啶-3-甲基胺結(jié)構(gòu)的去氫樅酸衍生物,DBDA)[9]由ChemOffice 2019繪制成3D格式,經(jīng)MM-2能量?jī)?yōu)化后保存為“.pdb”格式備用。所有“.pdb”格式文件的分子,經(jīng)AutoDock 4.2.6軟件(AutoDock)自動(dòng)選擇可扭轉(zhuǎn)鍵后保存為PDBQT文件備用。

    圖1 去氫樅酸的結(jié)構(gòu)

    1.1.3 蛋白文件的準(zhǔn)備

    利用PyMOL Molecular Graphics System刪除蛋白文件中的配體、水和金屬等小分子,刪除相似性極高的重復(fù)蛋白鏈,以保留A鏈為主。利用AutoDock對(duì)蛋白進(jìn)行“加氫”、自動(dòng)計(jì)算“Gasteiger charges”、設(shè)置原子類型為“Assign AD4 type”后保存為PDBQT文件備用。

    1.1.4 對(duì)接的執(zhí)行

    “GridBox”的“grid map”設(shè)置為60×60×60以涵蓋ATP位點(diǎn)(中心分別為:PI3Kα,x=-2.4、y=12.3、z=-17.3;PI3Kβ,x=19.0、y=60.0、z=22.0;PI3Kγ,x=22.0、y=15.0、z=22.0;PI3Kδ,x=17.0、y=-5.0、z=21.0;ATK1,x=19.0、y=-3.0、z=28.0;AKT2,x=23.0、y=-18.0、z=7.0;AKT3,x=3.0、y=15.0、z=-42.0;mTOR,x=52.0、y=1.0、z=-47.0)。對(duì)接程序使用默認(rèn)參數(shù)進(jìn)行,選取結(jié)合能最低的構(gòu)像作為預(yù)測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析。當(dāng)各蛋白原配體重新對(duì)接的構(gòu)像均方根偏差(root mean square deviation,RMSD或refRMS)差小于2?時(shí),則認(rèn)為此對(duì)接方法有較好的準(zhǔn)確性[18]。

    1.1.5 對(duì)接結(jié)果分析

    配體-蛋白相互作用的3D構(gòu)像使用PyMOL制作,配體-蛋白相互作用的2D構(gòu)像使用LigPlot+2.1制作。去氫樅酸與原配體重疊的相互作用殘基用紅圈指示。相互作用殘基是否參與配體-蛋白的結(jié)合通過(guò)可接觸表面積(accessible surface area,ASA)的損失(ΔASA)來(lái)衡量,配體與殘基的相互作用越緊密ΔASA越大,一般ΔASA大于10?2可認(rèn)為該相互作用參與了配體-蛋白的結(jié)合[19]。各殘基的ASA通過(guò)Accessible Surface Area and Accessibility Calculation for Protein(ver.1.2)(http://cib.cf.ocha.ac.jp/bitool/ASA/)系統(tǒng)進(jìn)行計(jì)算。各殘基的ΔASA=ASA對(duì)接前﹣ASA對(duì)接后。

    1.2 蛋白免疫印跡測(cè)試

    取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SCC9細(xì)胞,向細(xì)胞培養(yǎng)皿中加入含有不同濃度藥物(0、13和26 μM的去氫樅酸)的培養(yǎng)基,置37 ℃、5%CO2培養(yǎng)后,用冷PBS洗,進(jìn)一步用0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞并收集,加入200 μL裂解液(196 μL裂解液加2 μL PMSF和2 μL蛋白磷酸酶抑制劑混合物)(Solarbio)裂解,置于冰上研碎至勻漿后,4 ℃放置30 min,用BCA試劑盒檢測(cè)(Beyotime)蛋白濃度,用SDS-PAGE凝膠電泳(Beyotime)對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行電泳并轉(zhuǎn)膜。在室溫下用5%脫脂乳封閉膜1 h,并在4 ℃下與一抗孵育過(guò)夜。次日洗膜后,在室溫下用相應(yīng)的二抗孵育1 h,最后用化學(xué)發(fā)光試劑盒顯影(Merck,德國(guó))。使用全能成像系統(tǒng)顯示蛋白條帶(ChemiDoc MP,Bio-Rad,USA)。一抗為:PI3K p110、PI3K p85、p-AKT、AKT、mTOR、p-mTOR、p-4EBP1、p-S6,GAPDH作為內(nèi)參(Cell Signaling Technology,Boston,USA)。

    1.3 類藥性與藥代動(dòng)力學(xué)預(yù)測(cè)

    利用網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器“pkCSM-pharmacokinetics”(http://biosig.unimelb.edu.au/pkcsm/)對(duì)去氫樅酸的類藥性(利賓斯基五法則)和藥代動(dòng)力學(xué)(吸收、分布、代謝、排泄和毒性)進(jìn)行預(yù)測(cè)[19]。該預(yù)測(cè)方法是將已知藥代動(dòng)力學(xué)特性的分子進(jìn)行圖形建模,轉(zhuǎn)化成原子間距離參數(shù)的識(shí)別標(biāo)志,再用這些識(shí)別標(biāo)志和分子的特性建立藥代動(dòng)力學(xué)的回歸與分類模型。待測(cè)分子也轉(zhuǎn)換成識(shí)別標(biāo)志后代入模型并進(jìn)行預(yù)測(cè)。

    2 結(jié)果

    2.1 對(duì)接結(jié)合能

    對(duì)接結(jié)果顯示(表1),原配體重新對(duì)接的RMSD值均小于2 ?,最大值為0.48 ?,說(shuō)明對(duì)接程序的預(yù)測(cè)結(jié)果能夠很好的重復(fù)原配體在蛋白中的構(gòu)像,對(duì)接方法較為可靠。DHA與通路蛋白的最低對(duì)接結(jié)合能均為負(fù)值,最大值為-6.16 kcal/mol,說(shuō)明DHA可能對(duì)這些蛋白的ATP位點(diǎn)均有一定的結(jié)合能力。雖然最低對(duì)接結(jié)合能均高于作為抑制劑的原配體,但與對(duì)該通路有抑制作用的DBDA接近。這預(yù)示著去氫樅酸可能對(duì)該通路也可以表現(xiàn)出抑制能力。

    表1 PDB文件信息和最低對(duì)接結(jié)合能

    2.2 去氫樅酸與各PI3K蛋白的對(duì)接結(jié)果

    對(duì)PI3Kα的分子對(duì)接結(jié)果顯示(圖2),去氫樅酸在PI3Kα的ATP結(jié)合位點(diǎn)共與12個(gè)殘基發(fā)生非鍵相互作用,其中9個(gè)殘基Val851、Trp780、Met922、Met772、Ile932、Ile848、Ser854、Gln859和Arg770對(duì)配體-蛋白的結(jié)合起著重要作用(ΔASA>10 ?2),殘基Trp780的ΔASA(38.99 ?2)最大,可視為關(guān)鍵殘基(表2)。有10個(gè)殘基與PI3Kα原配體的相互作用殘基重疊,這說(shuō)明去氫樅酸和原配體對(duì)PI3Kα的ATP結(jié)合位點(diǎn)有著較為相似的結(jié)合方式。

    圖2 去氫樅酸與PI3Kα對(duì)接的構(gòu)像

    對(duì)PI3Kβ的分子對(duì)接結(jié)果顯示(圖3),去氫樅酸在PI3Kβ的ATP結(jié)合位點(diǎn)與13個(gè)殘基發(fā)生相互作用,其中氫鍵相互作用殘基2個(gè)(Ala885和Lys890)、非鍵相互作用殘基11個(gè)。有9個(gè)殘基Val882、Trp812、Ala885H、Met953、Ile963、Ile831、Lys890、Ile879和Asp964對(duì)配體-蛋白的結(jié)合起著重要作用(ΔASA>10 ?2),殘基Ile963的ΔASA (30.642 ?2)最大,可視為關(guān)鍵殘基(表2)。此外,有10個(gè)殘基與PI3Kβ原配體的相互作用殘基重疊,這說(shuō)明去氫樅酸和原配體對(duì)PI3Kβ的ATP結(jié)合位點(diǎn)有著較為相似的結(jié)合方式。

    圖3 去氫樅酸與PI3Kβ對(duì)接的構(gòu)像

    對(duì)PI3Kγ的分子對(duì)接預(yù)測(cè)顯示(圖4),去氫樅酸在PI3Kγ的ATP結(jié)合位點(diǎn)共與12個(gè)殘基發(fā)生相互作用,其中與氫鍵相互作用殘基1個(gè)(Lys890)、非鍵相互作用殘基11個(gè)。有8個(gè)殘基Met804、Asp964、Met953、Ile963、Ile831、Ser806、Ile879和Lys890對(duì)配體-蛋白的結(jié)合起著重要作用(ΔASA>10 ?2),殘基Met804的ΔASA(49.215 ?2)最大,可視為關(guān)鍵殘基(表2)。有9個(gè)殘基與PI3Kγ原配體的相互作用殘基重疊,這說(shuō)明去氫樅酸和原配體對(duì)PI3Kγ的ATP結(jié)合位點(diǎn)有著較為相似的結(jié)合方式。

    圖4 去氫樅酸與PI3Kγ對(duì)接的構(gòu)像

    對(duì)PI3Kδ的分子對(duì)接結(jié)果顯示(圖5),去氫樅酸在PI3Kδ的ATP結(jié)合位點(diǎn)與13個(gè)殘基發(fā)生相互作用,其中氫鍵相互作用殘基1個(gè)(Lys890)、非鍵相互作用殘基12個(gè)。有7個(gè)殘基Met953、Lys890、Ile963、Met804、Ile879、Ile831和Ser806對(duì)配體-蛋白的結(jié)合起著重要作用(ΔASA>10 ?2),殘基Lys890的ΔASA(43.805 ?2)最大,可視為關(guān)鍵殘基(表2)。有11個(gè)殘基與PI3Kδ原配體的相互作用殘基重疊,這說(shuō)明去氫樅酸和原配體對(duì)PI3Kδ的ATP結(jié)合位點(diǎn)有著較為相似的結(jié)合方式。

    圖5 去氫樅酸與PI3Kδ對(duì)接的構(gòu)像

    表2 去氫樅酸與PI3K相互作用殘基信息

    續(xù)表2(Continued Tab.2)

    2.3 去氫樅酸與各AKT蛋白的對(duì)接結(jié)果

    對(duì)AKT1的分子對(duì)接結(jié)果顯示(圖6),去氫樅酸在AKT1的ATP結(jié)合位點(diǎn)與15個(gè)殘基發(fā)生相互作用,其中氫鍵相互作用殘基2個(gè)(Thr211和Ala230)、非鍵相互作用殘基13個(gè)。有10個(gè)殘基Glu234、Asp292、Val164、Leu156、Arg4 (B)、Met281、Met227、Gly157、Ala177和Thr291對(duì)配體-蛋白的結(jié)合起著重要作用(ΔASA>10?2),殘基Val164的ΔASA (40.176?2)最大,可視為關(guān)鍵殘基(表3)。有12個(gè)殘基與AKT1原配體的相互作用殘基重疊,這說(shuō)明去氫樅酸和原配體對(duì)AKT1的ATP結(jié)合位點(diǎn)有著較為相似的結(jié)合方式。

    圖6 去氫樅酸與AKT1對(duì)接的構(gòu)像

    對(duì)AKT2的分子對(duì)接結(jié)果顯示(圖7),去氫樅酸在AKT2的ATP結(jié)合位點(diǎn)與13個(gè)殘基發(fā)生非鍵相互作用,其中8個(gè)殘基Lys181、Asp293、Val166、Glu236、Met229、Gly159、Thr292和Met282對(duì)配體-蛋白的結(jié)合起著重要作用(ΔASA>10?2),殘基Val166的ΔASA (30.756?2)最大,可視為關(guān)鍵殘基(表3)。有11個(gè)殘基與AKT2原配體的相互作用殘基重疊,這說(shuō)明去氫樅酸和原配體對(duì)AKT2的ATP結(jié)合位點(diǎn)有著較為相似的結(jié)合方式。

    圖7 去氫樅酸與AKT2對(duì)接的構(gòu)像

    對(duì)AKT3的分子對(duì)接結(jié)果顯示(圖8),去氫樅酸在AKT3的ATP結(jié)合位點(diǎn)與14個(gè)殘基發(fā)生非鍵相互作用,其中9個(gè)殘基Leu154、Val228、Val162、Met278、Gly155、Met225、Asp289、Lys177和Gly157對(duì)配體-蛋白的結(jié)合起著重要作用(ΔASA>10?2),殘基Met278的ΔASA(41.586?2)最大,可視為關(guān)鍵殘基(表3)。近半數(shù)的殘基與AKT1原配體的相互作用殘基重疊,說(shuō)明去氫樅酸與AKT1配體在一定程度上對(duì)AKT3的ATP結(jié)合位點(diǎn)有著相似的結(jié)合方式。

    圖8 去氫樅酸與AKT3對(duì)接的構(gòu)像

    表3 去氫樅酸與AKT相互作用殘基信息

    2.4 去氫樅酸與mTOR蛋白的對(duì)接結(jié)果

    對(duì)mTOR的分子對(duì)接結(jié)果顯示(圖9),去氫樅酸在mTOR的ATP結(jié)合位點(diǎn)與13個(gè)殘基發(fā)生相互作用,其中氫鍵相互作用殘基1個(gè)(Val2240)、非鍵相互作用殘基12個(gè)。有9個(gè)殘基Trp2239、Ile2356、Ile2237、Met2345、Leu2185、Cys2243、Thr2245、Ala2248和Asp2244對(duì)配體-蛋白的結(jié)合起著重要作用(ΔASA>10 ?2),殘基Trp2239的ΔASA(50.969 ?2)最大,可視為關(guān)鍵殘基(表4)。近半數(shù)的殘基與mTOR原配體的相互作用殘基重疊,這說(shuō)明去氫樅酸與原配體可能在一定程度上對(duì)mTOR的ATP結(jié)合位點(diǎn)有著相似的結(jié)合方式。

    圖9 去氫樅酸與mTOR對(duì)接的構(gòu)像

    表4 去氫樅酸與mTOR相互作用殘基信息

    2.5 蛋白免疫印跡結(jié)果

    蛋白免疫印跡結(jié)果顯示(圖10),在去氫樅酸的作用下,SCC9的PI3K催化亞基p110的表達(dá)略有下調(diào),調(diào)控亞基p85的表達(dá)明顯下調(diào);PI3K下游蛋白AKT和mTOR的磷酸化明顯被抑制,但其總蛋白的表達(dá)基本不受影響;通路下游的效應(yīng)蛋白4EBP1的磷酸化略受抑制,S6的磷酸化明顯減少。這說(shuō)明PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路受到去氫樅酸的抑制。

    圖10 去氫樅酸對(duì)蛋白表達(dá)的影響

    2.6 類藥性與藥代動(dòng)力學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果

    類藥性預(yù)測(cè)結(jié)果經(jīng)“五倍率法則(Lipinski rule of five)”比較(表5):去氫樅酸的分子量、油水分配系數(shù)(LogP)、可旋轉(zhuǎn)鍵(rotatable bonds)、氫鍵受體(acceptors)、氫鍵供體(donors)和總極化表面積(surface area)均在可接受值域內(nèi)。

    表5 去氫樅酸類藥性預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)

    藥代動(dòng)力學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示(表6):去氫樅酸有較好的脂溶性和口服作用,容易通過(guò)腸道吸收,且不作為P-糖蛋白的底物;較易分布于血液,易穿透血腦屏障、穿透中樞神經(jīng);對(duì)機(jī)體的代謝能力沒(méi)有影響;可以被正常排泄;不致突變,毒性較小。總的來(lái)說(shuō)去氫樅酸通過(guò)了大多數(shù)的預(yù)測(cè),成為安全藥物的可能性較大,可考慮作為治療使用的候選化合物[19]。

    表6 去氫樅酸藥代動(dòng)力學(xué)預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)

    續(xù)表6(Continued Tab.6)

    3 討論

    PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路對(duì)細(xì)胞的增殖、分化和凋亡等過(guò)程起著重要作用,也是癌癥治療的靶點(diǎn)之一。PI3K主要由催化亞基p110和調(diào)控亞基p85構(gòu)成,經(jīng)磷酸化激活后,可將其底物3,4-二磷酸磷脂酰肌醇(PIP2)轉(zhuǎn)化成3,4,5-三磷酸磷脂酰肌醇(PIP3)。PIP3能夠與AKT結(jié)合后通過(guò)磷酸肌醇依賴性蛋白激酶1(PDK1)促使AKT磷酸化。經(jīng)磷酸化激活的AKT能夠直接或間接的使mTOR磷酸化,從而進(jìn)一步促進(jìn)下游效應(yīng)蛋白4EBP1和S6的磷酸化以調(diào)控細(xì)胞內(nèi)生化活動(dòng)[20,21]。

    本研究基于近年來(lái)去氫樅酸抗癌衍生物不斷被開(kāi)發(fā),部分衍生物被報(bào)道對(duì)PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路的部分關(guān)鍵蛋白有抑制作用[8,9,22]。為了研究作為原料的去氫樅酸對(duì)PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路的影響,為去氫樅酸抗癌衍生物的開(kāi)發(fā)提供依據(jù)。利用分子對(duì)接技術(shù)預(yù)測(cè)了去氫樅酸對(duì)通路關(guān)鍵蛋白PI3K,AKT和mTOR的ATP結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合能力和結(jié)合方式,利用蛋白免疫印跡法檢驗(yàn)去氫樅酸對(duì)通路的抑制效果,通過(guò)初步的類藥性和藥代動(dòng)力學(xué)模擬預(yù)測(cè)去氫樅酸成為口服藥物的潛力。

    分子對(duì)接結(jié)果表明,去氫樅酸對(duì)各關(guān)鍵蛋白的ATP結(jié)合位點(diǎn)均有一定的結(jié)合能力,與AKT3的結(jié)合最弱,最低結(jié)合能為-6.16 kcal/mol,與AKT1結(jié)合最強(qiáng),最低結(jié)合能為-8.04 kcal/mol。去氫樅酸對(duì)通路蛋白的結(jié)合能力弱于作為高效抑制劑的原配體,與我們已合成得到的去氫樅酸基PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路抑制分子DBDA相近。在ATP結(jié)合位點(diǎn)中,去氫樅酸與蛋白的相互作用殘基多為含疏水性殘基。除了PI3Kδ的Lys890,其他對(duì)配體-蛋白結(jié)合起最重要作用的關(guān)鍵殘基也均為疏水性殘基。說(shuō)明去氫樅酸可能通過(guò)與ATP結(jié)合位點(diǎn)的腺嘌呤區(qū)結(jié)合從而產(chǎn)生抑制作用[23]。各蛋白與去氫樅酸的相互作用殘基跟原配體的有著大量的重疊,這表明去氫樅酸可能是以和原配體相近的方式與ATP展開(kāi)競(jìng)爭(zhēng)以抑制蛋白作用。此外,沒(méi)有氫鍵存在的構(gòu)像,如去氫樅酸與PI3Kα、AKT2和AKT3,它們的結(jié)合能均高于其他存在氫鍵的構(gòu)像,這表明氫鍵對(duì)去氫樅酸與蛋白的穩(wěn)定結(jié)合發(fā)揮著重要作用。在去氫樅酸結(jié)合的構(gòu)像中,氫鍵全部在羧基位置產(chǎn)生。但是,異丙基和苯環(huán)附近存在多個(gè)在原配體中為氫鍵相互作用的重疊殘基。這一特征提示,在設(shè)計(jì)新的去氫樅酸基PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路抑制劑時(shí),可加強(qiáng)羧基位置的親水能力,并在異丙基和苯環(huán)位置引入親水基團(tuán),可能可以提高新化合物與蛋白的結(jié)合能力。

    蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)顯示,SCC9細(xì)胞經(jīng)去氫樅酸處理后,PI3K調(diào)控亞基p85的表達(dá)明顯降低。p85含量的減少可能使PI3K的生成受阻,并成為減少PI3K下游蛋白AKT磷酸化表達(dá)的因素之一。AKT和mTOR的總蛋白在不同濃度的去氫樅酸作用下與空白組相比沒(méi)有明顯的變化,但其磷酸化蛋白表達(dá)均明顯減少,說(shuō)明AKT和mTOR的磷酸化進(jìn)程受到抑制。處于mTOR下游的4EBP1的磷酸化表達(dá)下降較少,可能是因?yàn)?EBP1還可經(jīng)MEK/Erk信號(hào)通路激活的原因[24]。而受mTOR調(diào)控的另一效應(yīng)蛋白S6K1下游的S6磷酸化表達(dá)明顯減少,可能是因?yàn)閙TOR的磷酸化受阻,導(dǎo)致S6K1激活減少,從而減少了S6的磷酸化反應(yīng)??偟膩?lái)說(shuō)在SCC9細(xì)胞內(nèi),PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路的表達(dá)受到了去氫樅酸的抑制,這與分子對(duì)接中預(yù)測(cè)的結(jié)果一致。

    類藥性和藥代動(dòng)力學(xué)預(yù)測(cè)中,去氫樅酸的五倍率法則(Lipinski rule of five)分析顯示,其分子量、LogP、旋轉(zhuǎn)鍵、氫鍵受體、氫鍵供體的值均在該經(jīng)驗(yàn)性規(guī)則要求的范圍內(nèi)[25]。藥代動(dòng)力學(xué)預(yù)測(cè)對(duì)去氫樅酸在體內(nèi)的吸收、分布、代謝、排泄和毒性等性能進(jìn)行模擬,去氫樅酸通過(guò)了大部分的測(cè)試,說(shuō)明它可能可以較好的在體內(nèi)發(fā)揮藥物作用[19]。

    總之,本研究通過(guò)分子對(duì)接預(yù)測(cè)、蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)、類藥性檢驗(yàn)和藥代動(dòng)力學(xué)預(yù)測(cè),發(fā)現(xiàn)去氫樅酸本身可能成為一種候選的治療藥劑,用于抑制PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路,以達(dá)到緩解腫瘤細(xì)胞耐藥和抗腫瘤的目的。也可以進(jìn)一步對(duì)去氫樅酸的結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾,以開(kāi)發(fā)出更有效的去氫樅酸基PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路抑制劑。

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