CYP3A5基因多態(tài)性對(duì)腎移植受者他克莫司代謝的影響

張異蕊 郭予和 陳 正

1 引言

目前，他克莫司（Tacrolimus，F(xiàn)K506）是腎移植術(shù)后應(yīng)用最廣泛的免疫抑制劑，有效降低了術(shù)后排斥發(fā)生率［1-2］。然而，他克莫司治療窗窄、個(gè)體間藥物代謝動(dòng)力學(xué)差異大，按照“標(biāo)準(zhǔn)劑量”給藥，個(gè)體間藥物濃度明顯不同，臨床上經(jīng)常出現(xiàn)偏離目標(biāo)濃度的現(xiàn)象。因此，他克莫司用藥劑量必須根據(jù)治療藥物監(jiān)測(cè)（Therapeutic drug monitoring，TDM）結(jié)果不斷進(jìn)行調(diào)整。

細(xì)胞色素P450（cytochrome P450，CYP）是一種人體內(nèi)重要的藥物代謝酶［3-5］，其亞家族CYP3A5主要在腸道和肝表達(dá)，是他克莫司在人體內(nèi)的主要代謝酶。CYP3A5的活性很大程度上取決于CYP3A5×3單核苷酸多態(tài)性，該基因6989（A/G）位點(diǎn)的突變可導(dǎo)致其翻譯出無功能的蛋白質(zhì)，使得CYP3A5 GG基因型攜帶者不能表達(dá)有酶活性的CYP3A5蛋白質(zhì)，影響他克莫司在體內(nèi)代謝。本研究以我院腎移植受者為對(duì)象，探討CYP3A5基因多態(tài)性對(duì)他克莫司標(biāo)準(zhǔn)化血藥濃度（Dose adjusted blood concentration，C0/D）的影響，分析 CYP3A5×3基因多態(tài)性與腎移植受者術(shù)后急性排斥反應(yīng)和感染的相關(guān)性，為腎移植受者術(shù)后個(gè)體化用藥提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2016年1月—2017年12月在廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院接受初次腎移植的受者為研究對(duì)象。

納入標(biāo)準(zhǔn)：①18周歲以上；②術(shù)后免疫抑制劑方案采用他克莫司+霉酚酸酯+激素，且維持該方案至少2年。

排除標(biāo)準(zhǔn)：①術(shù)后1個(gè)月內(nèi)腎功能不全；②因手術(shù)原因移植物失功；③服用利福平、紅霉素等影響CYP酶活性藥物；④術(shù)后發(fā)生移植腎功能延遲恢復(fù)（DGF）和失訪的受者；⑤術(shù)后肝功能異常的受者；⑥患有貧血、低蛋白血癥和精神性厭食癥或胃腸切除術(shù)后等影響藥物吸收的受者；⑦多器官聯(lián)合移植受者。本研究共納入受者190例，隨訪期為2年。

1.2 CYP3A5基因型分析

采用天根基因組提取試劑盒（DP318-02）提取全血的基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）。采用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)DNA的純度及濃度，確保DNA濃度在30 ng/μl左右。采用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長(zhǎng)度（Poly merase chain reaction-restriction fragement length polymorphism，PCR-RFLP）方 法 檢 測(cè)CYP3A5×3基因多態(tài)性（試劑盒來自于天津市秀鵬生物技術(shù)開發(fā)有限公司）。PCR反應(yīng)程序如表1所示，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色，于紫外凝膠成像系統(tǒng)下觀察并判讀結(jié)果。

表1 PCR循環(huán)參數(shù)

1.3 C0的測(cè)定

采集受者術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)（7天、1個(gè)月、3個(gè)月、6個(gè)月、1年和2年）清晨空腹靜脈血2～4 mL，采用酶聯(lián)免疫放大法（Enzyme linked immunoamplification，試劑盒來自珠海麗珠試劑有限公司）檢測(cè)C0，并進(jìn)行校正。以競(jìng)爭(zhēng)藥物（他克莫司代謝物）抗體結(jié)合位點(diǎn)為基礎(chǔ)，樣品中的他克莫司代謝物與用葡萄糖6磷酸脫氫酶標(biāo)記的藥物競(jìng)爭(zhēng)抗體結(jié)合位點(diǎn)，未結(jié)合的酶可將輔助因子NAD轉(zhuǎn)化為還原性的NADH，從而造成吸光度改變。通過分光光度計(jì)340 nm進(jìn)行測(cè)量。計(jì)算3組受者術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)有效的血他克莫司濃度/劑量（C0/D）值。C0為他克莫司谷濃度（ng·ml-1），D為受者每日每公斤體質(zhì)量所服用他克莫司毫克數(shù)（mg·kg-1·d-1），C0/D值單位為 ng·mL-1·d·kg。

1.4 急性排斥反應(yīng)（AR）診斷

依據(jù)以下臨床癥狀診斷排斥反應(yīng)：①尿量減少、血壓升高、發(fā)熱、體重增加；②移植腎區(qū)變硬、脹痛、腫大；③伴有乏力、肌肉關(guān)節(jié)酸痛、納差、腹脹、心動(dòng)過速甚至精神異常等全身癥狀；④檢查指標(biāo)血清肌酐（SCr）或內(nèi)生肌酐清除率（Ccr）升高；⑤移植腎多普勒彩超檢查符合急性排斥反應(yīng)影像學(xué)特征；⑥必要時(shí)行移植腎穿刺活檢。

1.5 感染

為減少不同類型感染的影響，本研究?jī)H納入有明顯影像學(xué)依據(jù)的肺部感染作為統(tǒng)計(jì)的唯一指標(biāo)。包括：細(xì)菌性肺炎、病毒性肺炎、真菌性肺炎、結(jié)核感染、混合性感染、不明病原菌肺部感染（具備明確臨床癥狀及影像學(xué)特征，但未檢出任何病原菌者）。當(dāng)患者出現(xiàn)發(fā)熱及咳嗽等癥狀時(shí)，進(jìn)行肺部CT檢測(cè)、病原學(xué)檢查診斷肺部感染。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS（19.0版）統(tǒng)計(jì)軟件處理。各組患者年齡、BMI、HLA錯(cuò)配、術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)受者的他克莫司C0/D值均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，不同基因型患者性別構(gòu)成比比較采用χ2檢驗(yàn)，不同基因型受者年齡、BMI、HLA錯(cuò)配及術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)受者的他克莫司C0/D值比較采用單因素方差分析（不滿足方差分析則用Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn)）。三組間排斥反應(yīng)發(fā)生率和感染發(fā)生率的比較采用行×列表的卡方檢驗(yàn)，對(duì)于理論頻數(shù)＜1的采用fisher’s確切概率法，以P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 受者一般資料及CYP3A5基因多態(tài)性檢測(cè)結(jié)果

190例受者中，男117例，女73例，年齡為43.25±13.81歲，BMI為22.14±3.31 kg/m2、HLA錯(cuò)配為3.55±1.21個(gè)。其中，CYP3A5×1/×1型24例（12.7%），CYP3A5×1/×3型66例（34.7%），CYP3A5×3/×3型100例（52.6%）。3組受者年齡、性別構(gòu)成比、BMI和HLA錯(cuò)配數(shù)比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），3組受者一般資料具有可比性，見表2。

表2 CYP3A5不同基因組受者一般資料

2.2 各組受者不同時(shí)間點(diǎn)他克莫司C0/D值

術(shù)后7天、1個(gè)月、3個(gè)月、6個(gè)月、1年和2年時(shí)，CYP3A5×3/×3組受者的 C0/D值分別為123.21±23.84 ng·mL-1·d.kg、139.41±19.77 ng·mL-1·d·kg、131.54±21.35 ng·mL-1·d·kg、134.21±20.18 ng·mL-1·d·kg、125.36±17.70 ng·mL-1·d.kg、134.24±26.17 ng·mL-1·d·kg；CYP3A5×1/×1組受者各時(shí)間點(diǎn)為：46.71±17.99 ng.mL-1·d·kg、56.67±18.71 ng·mL-1·d·kg、55.33±17.72 ng·mL-1·d·kg、54.21±18.21 ng·mL-1·d·kg、48.13±15.25 ng·mL-1·d·kg、54.14±19.13 ng·mL-1·d·kg；CYP3A5×1/×3組受者各時(shí)間點(diǎn)為：54.25±17.82 ng·mL-1·d.kg、59.41±15.96 ng·mL-1·d·kg、61.22±16.93 ng·mL-1·d·kg、64.13±16.85 ng·mL-1·d·kg、61.32±14.75 ng·mL-1·d.kg、59.11±17.27 ng·mL-1·d·kg。CYP3A5×3/×3組受者的C0/D值各時(shí)間點(diǎn)均高于明顯高于CYP3A5×1/×1組受者和CYP3A5×1/×3組受者，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），CYP3A5×1/×1組和CYP3A5×1/×3組患者各時(shí)間點(diǎn)C0/D值無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（表3和圖1）。

表3 CYP3A5基因多態(tài)性與劑量和濃度劑量比的關(guān)系

圖1 CYP3A5不同基因型組C0/D比較

2.3 CYP3A5基因多態(tài)性與急性排斥反應(yīng)的關(guān)系

3組術(shù)后2年內(nèi)發(fā)生急性排斥反應(yīng)共有20例，其中，CYP3A5×1/×1組7例，CYP3A5×1/×3組7例，CYP3A5×3/×3組6例。如表3顯示，CYP3A5×1/×1組6例急性排斥反應(yīng)發(fā)生時(shí)間為：術(shù)后7天至術(shù)后1月間1例，術(shù)后1月至術(shù)后3個(gè)月間3例，術(shù)后6月至1年間1例，術(shù)后1年至2年間2例。CYP3A5×1/×3組14例急性排斥反應(yīng)發(fā)生時(shí)間為：術(shù)后1月至術(shù)后3個(gè)月間3例，術(shù)后6月至1年間2例，術(shù)后1年至2年間2例。CYP3A5×3/×3組6例急性排斥反應(yīng)發(fā)生時(shí)間為：術(shù)后7天至術(shù)后1月間1例，術(shù)后1月至術(shù)后3個(gè)月間2例，術(shù)后半年至1年間1例，術(shù)后1年至2年間2例，見表4。3組急性排斥反應(yīng)通過甲基等藥物沖擊治療后均得到逆轉(zhuǎn)，移植腎功能得到恢復(fù)。術(shù)后2年內(nèi)CYP3A5×1/×1組急性排斥反應(yīng)發(fā)生率高于 CYP3A5×1/×3組和CYP3A5×3/×3組（P=0.032，P＜0.001），而術(shù)后2年內(nèi)CYP3A5×1/×3組和CYP3A5×1/×3組急性排斥反應(yīng)發(fā)生率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.28）。

2.4 CYP3A5基因多態(tài)性與感染的關(guān)系

術(shù)后2年內(nèi)發(fā)生感染共有47例，其中，CYP3A5×1/×1組6例，CYP3A5×1/×3組14例，CYP3A5×3/×3組27例。CYP3A5×1/×1組6例感染發(fā)生時(shí)間為：術(shù)后1月內(nèi)1例，術(shù)后1月至術(shù)后3個(gè)月間3例，術(shù)后半年至1年間1例，術(shù)后1年至2年間1例。CYP3A5×1/×3組14例感染發(fā)生時(shí)間為：術(shù)后1月至術(shù)后3個(gè)月間9例，術(shù)后半年至1年間3例，術(shù)后1年至2年間2例。CYP3A5×3/×3組27例感染發(fā)生時(shí)間為：術(shù)后1月內(nèi)3例，術(shù)后1月至術(shù)后3個(gè)月間12例，術(shù)后半年至1年間8例，術(shù)后1年至2年間4例。術(shù)后2年內(nèi)各組感染總發(fā)生率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。

表4 不同CYP3A5基因組急性排斥反應(yīng)發(fā)生時(shí)間

3 討論

他克莫司（Tacrolimus，F(xiàn)K506）是鈣調(diào)磷酸酶抑制劑，作為一種有效的免疫抑制藥物，是腎移植術(shù)后免疫維持方案的基礎(chǔ)用藥之一。目前，臨床上常規(guī)給予相同體重劑量的藥物，并根據(jù)TDM結(jié)果對(duì)初始劑量進(jìn)行調(diào)整［6］。但由于他克莫司治療窗窄、藥動(dòng)學(xué)差異大，使得移植術(shù)后的受者需要較大劑量范圍和較長(zhǎng)時(shí)間的調(diào)整，部分受者由于給藥劑量過低造成移植物的急性排斥導(dǎo)致移植失敗，或者給藥劑量過高導(dǎo)致感染及肝、腎毒性等不良反應(yīng)發(fā)生急性排斥反應(yīng)［7］，嚴(yán)重影響移植手術(shù)治療效果及受者的生存質(zhì)量。因此，如何針對(duì)腎移植受者制定個(gè)體化的免疫抑制方案是目前研究的熱點(diǎn)。

學(xué)者們通過藥物基因組學(xué)研究遺傳因素對(duì)藥物反應(yīng)的影響，發(fā)現(xiàn)CYP3A5蛋白是影響他克莫司代謝的關(guān)鍵酶，該酶活性主要受CYP3A5×3基因多態(tài)性影響［8］。CYP3A5×3（6986A＞G）堿基突變可導(dǎo)致翻譯出無功能的CYP3A5蛋白［9］。CYP3A5的表達(dá)與活性呈高度多態(tài)性，個(gè)體及種族間差異性較大。有研究［9-10］報(bào)道指出：CYP3A5×3等位基因突變頻率在中國(guó)漢族、維吾爾族、哈薩克族和高加索人群中分別為72.17%、84.18%、86.16% 和91.17%。柳東夫［11］等在65例腎移植受者中發(fā)現(xiàn)，CYP3A5×1/×3型29例（44.62%），CYP3A5×3/×3型26例（40.0%），突變率為84.62%。本研究納入190例受者均為漢族人群，結(jié)果顯示：CYP3A5×1/×3型66例（34.7%），CYP3A5×3/×3型100例（52.6%），CYP3A5×3的突變率為87.3%，與上述報(bào)道基本一致，較高的CYP3A5×3突變率提示了CYP3A5×3基因檢測(cè)的重要性。

無功能的 CYP3A5蛋白將影響藥物代謝［8］，攜帶CYP3A5×3等位基因的腎移植受者CYP3A5酶的活性低于攜帶CYP3A5×1等位基因的受者。研究［12］指出：攜帶CYP3A5×3/×3組基因的受者較攜帶CYP3A5×1/×1組和CYP3A5×1/×3組受者易于達(dá)到目標(biāo)濃度。本研究結(jié)果顯示：術(shù)后7天、1個(gè)月、3個(gè)月、6個(gè)月、1年和2年時(shí)，CYP3A5×3/×3組患者的C0/D值均明顯高于CYP3A5×1/×1組和 CYP3A5×1/×3組，而 CYP3A5×1/×1組和CYP3A5×1/×3組患者各時(shí)間點(diǎn)C0/D值無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。上述結(jié)果提示攜帶CYP3A5×1等位基因者需要更高劑量的他克莫司才能達(dá)到目標(biāo)濃度，特別在腎移植早期，濃度尚未穩(wěn)定時(shí)，更需要根據(jù)CYP3A5基因分型選擇不同的初始劑量。

由于CYP3A5×1等位基因攜帶者CYP3A5表達(dá)水平較高，該酶的活性較強(qiáng)，導(dǎo)致他克莫司體內(nèi)代謝速度較快，生物利用度較低［13］。因此，CYP3A5×1等位基因攜帶者他克莫司血藥濃度常常較低，容易引起免疫抑制不足，發(fā)生急性排斥反應(yīng)［14］。然而，關(guān)于CYP3A5基因多態(tài)性與急性排斥反應(yīng)的相關(guān)性，國(guó)內(nèi)不同報(bào)道結(jié)果并不一致：有研究［15］指出：CYP3A5×1/×1組、CYP3A5×1/×3組和CYP3A5×3/×3組各組間術(shù)后2年內(nèi)急性排斥反應(yīng)發(fā)生率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。另有報(bào)道［16］指出3個(gè)月內(nèi)CYP3A5×1/×1組急性排斥反應(yīng)的比例顯著高于CYP3A5×1/×3組和 CYP3A5×3/×3組（P＜0.05）。本研究結(jié)果顯示：術(shù)后2年內(nèi)CYP3A5×1/×1組急性排斥反應(yīng)發(fā)生率高于CYP3A5×1/×3組和CYP3A5×3/×3組（P=0.032，P＜0.001），CYP3A5×1/×3組和CYP3A5×1/×3組急性排斥反應(yīng)發(fā)生率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.28），提示CYP3A5×1/×1組受者容易因?yàn)槊庖咭种撇蛔愣l(fā)生急性排斥反應(yīng)。由于CYP3A5×1/×1組受者需要更大的劑量才能達(dá)到目標(biāo)濃度，增加了發(fā)生急性排斥反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)［13］，故 CYP3A5×1/×1受者在腎移植術(shù)后要加強(qiáng)急性排斥反應(yīng)的監(jiān)測(cè)。

感染是腎移植術(shù)后常見的并發(fā)癥［17］，腎移植術(shù)后預(yù)防感染與急性排斥反應(yīng)影響移植受者/器官長(zhǎng)期存活的重要因素。國(guó)外研究顯示［18-19］：攜帶不同CYP3A5基因腎移植受者感染發(fā)生率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。國(guó)內(nèi)龐路新等［20］也有相似的研究結(jié)果。為減少不同類型感染的影響，本研究納入有明顯影像學(xué)依據(jù)的肺部感染作為統(tǒng)計(jì)的唯一指標(biāo)。本研究結(jié)果顯示：術(shù)后2年內(nèi)發(fā)生感染共有47例，其中，CYP3A5×1/×1組6例，CYP3A5×1/×3組14例，CYP3A5×3/×3組27例。術(shù)后2年內(nèi)各組間感染發(fā)生率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），與文獻(xiàn)報(bào)道一致。從結(jié)果可以看出，腎移植受者感染在3個(gè)月內(nèi)居多，CYP3A5×1/×1組術(shù)后3個(gè)月內(nèi)發(fā)生4例，CYP3A5×1/×3組術(shù)后3個(gè)月內(nèi)發(fā)生9例，CYP3A5×3/×3組術(shù)后3個(gè)月內(nèi)15例，這與前期免疫抑制劑藥物濃度調(diào)整有關(guān)。

綜上所述，本研究結(jié)果提示：CYP3A5基因多態(tài)性對(duì)腎移植術(shù)后受者他克莫司藥物代謝有顯著影響，可作為腎移植受者他克莫司個(gè)體化用藥的指導(dǎo)依據(jù)。