磷霉素、多粘菌素B等抗菌藥物對(duì)兒童感染NDM-1肺炎克雷伯菌的體外藥敏研究

麥榮嘉 馬丹娟 鄧文喻 劉 倩 鄭華儀 林鑫源 林雨詩(shī)

肺炎克雷伯桿菌（Klebsiella pneumoniae，KP）屬革蘭陰性桿菌，是人體上呼吸道和腸道的常見(jiàn)菌，可引起局部或全身性的感染性疾病。近年來(lái)肺炎克雷伯菌對(duì)碳青霉烯類抗菌藥物的耐藥率不斷攀升，呈現(xiàn)世界性流行趨勢(shì)［1-3］；耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌（Carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae，CRKP），在我國(guó)流行情況也日益嚴(yán)重。碳青霉烯酶是一類可以水解碳青霉烯類活性的酶，按照氨基酸序列分為A、B、D類［4］。B類碳青霉烯酶又稱金屬β內(nèi)酰胺酶，可以水解含有β內(nèi)酰胺環(huán)的抗菌藥物并且不被酶抑制劑所抑制，但可以被乙二胺四乙酸（EDTA）及巰基化合物等金屬離子螯合劑所抑制［4-5］。根據(jù)基因序列的差異，肺炎克雷伯菌中檢測(cè)到的金屬酶主要有IMP、VIM和NDM等類型［4］。在國(guó)內(nèi)，CRKP的流行主要以A類的產(chǎn)絲氨酸酶（KPC）和B類的產(chǎn)新德里金屬β-內(nèi)酰胺酶1型（NDM-1）多見(jiàn)，占全國(guó)CRKP的90%以上［3］。根據(jù)2019中國(guó)耐藥網(wǎng)報(bào)道［3］，兒童醫(yī)院分離的CRKP中，產(chǎn)NDM金屬酶的肺炎克雷伯菌（NDM-KP）比綜合性醫(yī)院多見(jiàn)。現(xiàn)有臨床研究結(jié)果顯示，頭孢他啶阿維巴坦能對(duì)KPC-KP有良好的抗菌活性，但是不能抑制NDM的水解活性對(duì)NDMKP感染治療效果不佳［6］。目前，抗菌藥物的聯(lián)合使用是治療NDM-KP感染的有效措施之一，而根據(jù)聯(lián)合藥敏試驗(yàn)結(jié)果選擇治療藥物，對(duì)臨床有效治療NDM-KP具有重大的意義。因此，本研究使用濃度梯度擴(kuò)散法藥敏試劑對(duì)磷霉素、多粘菌素B、美羅培南和氨曲南以及聯(lián)合對(duì)NDM-KP的作用，并探索方便、實(shí)用的濃度梯度擴(kuò)散法聯(lián)合藥敏方法協(xié)助臨床更好地防治NDM-KP感染。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 臨床菌株的來(lái)源 2019年1—12月收集廣東省婦幼保健院兒科PICU耐碳青酶烯類肺炎克雷伯桿菌（carbapenem resistant Klebsiella pneumoniae，CRKP）。菌株鑒定以及藥敏試驗(yàn)由梅里埃VITEK2 Compact全自動(dòng)分析系統(tǒng)完成。質(zhì)控菌為ATCC700603肺炎克雷伯菌，由本院保存。

1.1.2 藥敏試紙條 磷霉素藥敏試紙條，多粘菌素B藥敏試紙條，美羅培南藥敏試紙條和氨曲南藥敏試紙條（以上均來(lái)自溫州市康泰生物科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 產(chǎn)金屬酶肺炎克雷伯菌的耐藥表型的驗(yàn)證 采用改良碳青霉烯類滅活試驗(yàn)（modified carbapenem inactivation method，mCIM）聯(lián)合乙二胺四乙酸改良碳青霉烯滅活法（eCIM）篩查產(chǎn)金屬酶的碳青霉烯酶菌株，結(jié)果判斷參照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（the Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）M100-S30文件要求。

1.2.2 PCR驗(yàn)證 NDM有NDM-1～NDM-12等不同亞型，本實(shí)驗(yàn)參考文獻(xiàn)［7］設(shè)計(jì)NDM基因的通用引物可以擴(kuò)增含有NDM-1～NDM-12在內(nèi)的NDM亞型的序列。參考文獻(xiàn)［8-9］，設(shè)計(jì)磷霉素耐藥基因FosA和多粘菌素B耐藥基因mcr-1的特異性引物，引物序列及PCR反應(yīng)條件見(jiàn)表1。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后由上海生工有限公司測(cè)序，應(yīng)用Genebank進(jìn)行比對(duì)分析。

1.2.3 藥敏試驗(yàn) 采用濃度梯度擴(kuò)散法法測(cè)定單藥的MIC值濃度梯度擴(kuò)散法試驗(yàn)按說(shuō)明書(shū)操作測(cè)定MIC?；贑LSI 2020判讀藥敏結(jié)果。

1.2.4 聯(lián)合藥敏試驗(yàn) 試驗(yàn)組合如下，A組：磷霉素+多粘菌素B；B組：磷霉素+氨曲南；C組：磷霉素+美羅培南；D組：多粘菌素+氨曲南；E組：美羅培南+氨曲南。

1.2.5 分級(jí)抑菌濃度（fractional inhibitory concentration，F(xiàn)IC）計(jì)算 FIC的計(jì)算主要采用了MICA藥聯(lián)合和MIC B 藥 聯(lián) 合，F(xiàn)IC=MICA藥聯(lián)用/MICA藥單用+MICB藥聯(lián)用/MICB藥單用。在FIC≤0.5的情況下，此時(shí)就可以判斷為存在著協(xié)同作用；在FIC在0.5～1.0的情況下，此時(shí)就可以判斷為存在著部分協(xié)同作用；若存在著 FIC在1.0～4.0的情況，此時(shí)就可以判斷為不存在相關(guān)作用；若存在著FIC＞4.0的情況下，此時(shí)就可以判斷為存在著拮抗作用［10］。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和處理，計(jì)量資料采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 NDM和FosA的引物

2 結(jié)果

2.1 NDM-KP耐藥表型驗(yàn)證和PCR驗(yàn)證

根據(jù)mCIM以及eCIM試驗(yàn)結(jié)果，收集9株NDMKP菌株。運(yùn)用NDM特異性引物，擴(kuò)增以上9株肺炎克雷伯菌菌株，結(jié)果顯示，其中8株肺炎克雷伯菌擴(kuò)增出NDM特異性條帶，見(jiàn)圖1A。根據(jù)測(cè)序以及Genebank比對(duì)結(jié)果，均與NDM-1序列100%同源。而8株NDMKP均未擴(kuò)增出磷霉素耐藥基因FosA和多粘菌素B耐藥基因mcr-1的特異性條帶。

2.2 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

8株NDM-KP對(duì)美羅培南和氨曲南均耐藥，MIC分別是8～32μg/mL和＞256μg/mL；而8株NDM-KP對(duì)多粘菌素B和磷霉素均敏感，MIC分別是0.25～1 μg/mL和4～32μg/mL（如圖1B）。4種藥物對(duì)NDMKP的MIC結(jié)果見(jiàn)表2。

2.3 聯(lián)合藥敏結(jié)果

聯(lián)合藥敏試驗(yàn)（如圖1B-E）的FIC根據(jù)公式計(jì)算，A組FIC值范圍在0.5～1.5，僅1株FIC為1.5，這種情況下就可以判定磷霉素聯(lián)合多粘菌素B有部分協(xié)同作用，如圖1C；C組聯(lián)合用藥 FIC值0.25～1，僅2株 FIC大于0.5，這種情況下就可以判定磷霉素聯(lián)合美羅培南存在協(xié)同作用（如圖1D），與其它組FIC值均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖1F。而B(niǎo)組聯(lián)合用藥的FIC值為0.25～1.5，1株存在協(xié)同作用，3株有部分協(xié)同，其余均無(wú)相關(guān)。D組和E組聯(lián)合用藥的FIC值分別為1～2以及0.5～3，屬無(wú)相關(guān)作用。

圖1 NDM PCR鑒定、磷霉素聯(lián)合藥敏以及5組的FIC值

3 討論

隨著碳青霉烯類抗菌藥物的廣泛使用，以CRKP為主的多重耐藥菌被篩選出來(lái)［1-2］。根據(jù)報(bào)道，全球兒童感染攜帶NDM耐藥基因的腸桿菌是以肺炎克雷伯菌為主，并呈明顯上升趨勢(shì)，這使得控制NDM-KP的感染迫在眉睫［1］。根據(jù)全國(guó)耐藥監(jiān)測(cè)網(wǎng)顯示［3］，全國(guó)流行的CRKP主要分為KPC-KP和NDM-KP兩種。與綜合性醫(yī)院相比，兒童醫(yī)院分離的CRKP以NDM-KP較為多見(jiàn)［3］。在治療NDM-KP引起的感染性疾病時(shí)，兒童的抗菌藥物就具有較大的限制，給臨床治療帶來(lái)了極大的困擾。NDM酶屬于一種新型金屬酶，可水解除氨曲南外的幾乎所有β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物。本研究期間從兒科PICU患者臨床標(biāo)本中分離到8株NDM-KP均為NDM-1亞型，而上海地區(qū)的兒童醫(yī)院分離的NDM-KP以NDM-5為主［11］，這可能與NDM地區(qū)流行差異有關(guān)。

NDM-KP的出現(xiàn)給人類健康造成了更加復(fù)雜和困難的挑戰(zhàn)，對(duì)公共衛(wèi)生安全構(gòu)成越來(lái)越嚴(yán)重的威脅［12］。目前，針對(duì)NDM-KP的研究已經(jīng)不少，但在臨床上仍然缺乏有效的治療藥物和手段?，F(xiàn)階段臨床主要采取聯(lián)合用藥方案治療NDM-KP引起的感染，首選氨曲南聯(lián)合頭孢他啶阿維巴坦［13］，然而頭孢他啶阿維巴坦在治療兒童或新生兒的CRE的用藥劑量以及療效仍需進(jìn)一步的探索。在大量臨床研究基礎(chǔ)下，國(guó)內(nèi)專家共識(shí)推薦多粘菌素B藥敏試驗(yàn)使用微量肉湯稀釋法，而濃度梯度擴(kuò)散法檢測(cè)肺炎克雷伯菌時(shí)由于容易造成MIC值的下降，對(duì)攜帶mcr-1的肺炎克雷伯菌鑒定為假陰性［14］。本實(shí)驗(yàn)試驗(yàn)對(duì)耐藥基因mcr-1的檢測(cè)均陰性前提下，濃度梯度擴(kuò)散法檢測(cè)多粘菌素B的MIC發(fā)現(xiàn)多粘菌素B的MIC值在0.25～1μg/mL之間。然而多粘菌素B給藥劑量需要達(dá)到負(fù)荷劑量和最大推薦劑量，并且對(duì)于肺炎的病患的全身給藥亦可能無(wú)效［15］；副作用腎功能損傷以及神經(jīng)阻滯等都限制了其在兒童的使用。

磷霉素作為一種廣譜抗菌藥物，主要以治療大腸埃希菌和糞腸球菌所致非復(fù)雜性下尿路感染為醫(yī)生所熟知。磷霉素主要有口服制劑和靜脈制劑，除了常用于非復(fù)雜性下尿路感染的口服制劑磷霉素鈣和口服制劑磷霉素氨丁三醇以外，靜脈制劑磷霉素鈉可以治療如呼吸道感染、血流感染和中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染等系統(tǒng)性感染［16］。當(dāng)前主要的爭(zhēng)議在于，歐盟藥敏試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)（European Committee on Animicrobial Susceptibility Testing，EUCAST）與美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（Clinical and Laboratory Standard Institute，CLSI）在磷霉素的折點(diǎn)上存在較大的差異。如治療大腸埃希菌所致的尿路感染的磷霉素耐藥標(biāo)準(zhǔn)，EUCAST標(biāo)準(zhǔn)和CLSI標(biāo)準(zhǔn)分別為MIC＞32 mg/L和MIC＞256mg/L；而CLSI甚至缺乏磷霉素對(duì)非尿路細(xì)菌感染的折點(diǎn)，這些都制約了磷霉素的應(yīng)用。有研究顯示，F(xiàn)osA3是介導(dǎo)KPC-KP對(duì)磷霉素耐藥的主要機(jī)制，然而NDM-KP對(duì)磷霉素耐藥機(jī)制報(bào)道甚少［17］。本研究結(jié)果顯示，8株NDM-KP均未攜帶磷霉素FosA耐藥基因，而且濃度梯度擴(kuò)散法藥敏結(jié)果MIC在4～32 mg/L之內(nèi)，符合CLSI和EUCAST的對(duì)磷霉素敏感標(biāo)準(zhǔn)；同時(shí)C組的FIC在0.25～1范圍內(nèi)，結(jié)果顯示磷霉素聯(lián)合美羅培南存在協(xié)同作用，可以有效的抑制試驗(yàn)的8株NDM-KP。而聯(lián)合多粘菌素B的FIC（A組）僅1株FIC大于1，可判斷為有部分協(xié)同作用。過(guò)去，F(xiàn)IC的計(jì)算主要使用微量稀釋法，但是該方法操作繁瑣以及成本貴等原因，未能應(yīng)用于普通臨床實(shí)驗(yàn)室。本研究運(yùn)用濃度梯度擴(kuò)散法試驗(yàn)方法，其操作方便以及試劑的國(guó)產(chǎn)化降低的成本，能有效為臨床提供聯(lián)合用藥的依據(jù)。

綜上所述，如攜帶NDM或/和KPC等多重耐藥的肺炎克雷伯菌不斷增長(zhǎng)、新抗菌藥物研發(fā)無(wú)法滿足需要的形勢(shì)下，磷霉素和多粘菌素B或許成為臨床抵抗耐藥菌株的突破口。本研究發(fā)現(xiàn)磷霉素聯(lián)合美羅培南或者多粘菌素B都對(duì)NDM-KP有良好抗菌活性，這提示其可能具有更廣泛的臨床應(yīng)用范圍。