LncRNA ZEB1‐AS1對(duì)B細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤增殖和凋亡的影響及其下游調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的分析

廖成成 鄧木英 莫國(guó)君 雷丹青 夏愛(ài)軍 榮超 譚曉虹 岑洪 盧盛娟

B細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤（B?cell non?Hodgkin's lymphoma，B?NHL）是一種淋巴造血系統(tǒng)惡性腫瘤，其中彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤（diffuse large B?cell lymphoma，DLBCL）是最常見(jiàn)的類(lèi)型，占非霍奇金淋巴瘤的30%～58%［1］?；熀兔庖呋熓荁?NHL常用的治療手段，但部分患者一線治療后耐藥或復(fù)發(fā)難治，療效并不理想［2?3］。目前在臨床實(shí)踐中，淋巴瘤一線方案均以蒽環(huán)類(lèi)藥物為主，如多柔比星（doxorubicin，Dox）。因此，探討Dox耐藥機(jī)制，尋找B?NHL診斷和治療新型生物標(biāo)志物及治療靶點(diǎn)尤為重要。

淋巴瘤發(fā)生發(fā)展與轉(zhuǎn)錄異常有關(guān)，除mRNA水平異常外，還包括基因組中ncRNAs調(diào)控能力異常（lncRNAs、miRNAs等）［4］。近年來(lái)SALMENA等提出細(xì)胞內(nèi)有一類(lèi)競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源性RNA（competing endoge?nous RNA，ceRNA）假說(shuō)［5］，認(rèn)為 lncRNAs可通過(guò)miRNA反應(yīng)原件（miRNA response elements，MREs）吸附miRNA，抑制miRNA作用，間接調(diào)控蛋白編碼基因的表達(dá)，從而調(diào)節(jié)腫瘤進(jìn)程?？梢?jiàn)miRNA在該調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中起關(guān)鍵作用［6?7］。本研究通過(guò)GEO數(shù)據(jù)集預(yù)測(cè)與DLBCL預(yù)后相關(guān)的lncRNAs，探討lncRNA ZEB1?AS1及其與Dox協(xié)同對(duì)B?NHL細(xì)胞增殖和凋亡的影響，并構(gòu)建lncRNA?miRNA?mRNA ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，預(yù)測(cè)下游核心基因，為B?NHL診斷和治療提供新的靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來(lái)源及分析

數(shù)據(jù)集1來(lái)源于GEO數(shù)據(jù)集（GSE31312）中DLBCL表達(dá)譜數(shù)據(jù)及患者樣本信息（498例）。納入標(biāo)準(zhǔn)：⑴病理確診為DLBCL；⑵可獲得患者的總體生存時(shí)間；⑶可獲得標(biāo)準(zhǔn)化lncRNA及mRNA的表達(dá)數(shù)據(jù)。表達(dá)譜數(shù)據(jù)用R語(yǔ)言limma包進(jìn)行差異基因的篩選；構(gòu)建Cox回歸模型，按照HR＞1.5，調(diào)整后的P值＜0.05，挑選出前20個(gè)高風(fēng)險(xiǎn)lncRNA。數(shù)據(jù)集2為從UCSC XENA數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//xenabrowser.net/datapages/）［8］中選取444例正常組織與47例DLBCL組織的表達(dá)數(shù)據(jù)集，比較HR較高的前8個(gè)基因在正常組織和腫瘤組織中的表達(dá)量。通過(guò)文獻(xiàn)查閱，篩選出在數(shù)據(jù)集1中HR較高同時(shí)在數(shù)據(jù)集2腫瘤組織中顯著高表達(dá)，且未被文獻(xiàn)報(bào)道過(guò)的lncRNAs，并采用qPCR驗(yàn)證其在正常組織（外周血單個(gè)核細(xì)胞）和B?NHL細(xì)胞系中的表達(dá)量，最終確定lncRNA ZEB1?AS1為本研究的目的lncRNA。

根據(jù)ZEB1?AS1表達(dá)的中位數(shù)將數(shù)據(jù)集1中的患者分為高、低表達(dá)組，運(yùn)用limma數(shù)據(jù)包對(duì)數(shù)據(jù)集進(jìn)行mRNA的共表達(dá)分析，若表達(dá)趨勢(shì)一致則定義為共表達(dá)基因。同時(shí)利用DIANA tools查詢經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的編碼和非編碼RNA上的miRNA靶標(biāo)數(shù)據(jù)庫(kù)（TarBase v7.0和LncBase）。通過(guò)DIANA?miRPath（http：//diana.imis.athena?innovation.gr/）算法預(yù)測(cè)與lncRNA ZEB1?AS1相結(jié)合的miRNA及其結(jié)合位點(diǎn)，并運(yùn)用Targetscan網(wǎng)站（http：//www.targetscan.org/vert_71/）預(yù)測(cè)miRNA的靶基因。將與lncRNA ZEB1?AS1共表達(dá)的mRNA與Targetscan預(yù)測(cè)的靶基因取交集得到ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)下游基因，再將lncRNA?miRNA?mRNA調(diào)控軸導(dǎo)入Cytoscape 3.6.0并進(jìn)行可視化輸出，接著采用R語(yǔ)言的clusterProfiler包對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行基因本體GO功能富集分析和KEGG信號(hào)通路分析，最后利用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//string?db.org/）對(duì)差異基因的編碼蛋白進(jìn)行分析并構(gòu)建蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)（PPI）。

1.2 細(xì)胞系及主要試劑

B?NHL細(xì)胞系Raji、Ramos、Farage和293T購(gòu)自上海富衡生物科技有限公司。外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）為健康供者外周血經(jīng)梯度離心獲得；Gibco胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Life公司；DMEM高糖培養(yǎng)基、RPMI 1640培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司；慢病毒載體SV40及目的質(zhì)粒sh?NC、sh?ZEB1?AS1購(gòu)自VectorBuilder Inc，美國(guó)芝加哥；慢病毒包裝質(zhì)粒PMD2.G、PSPAX2購(gòu)自Addgene公司；Lipofectamine 3000購(gòu)自美國(guó)Thermofisher公司，Polybrene購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，Dox購(gòu)自深圳萬(wàn)樂(lè)藥業(yè)有限公司；CCK?8試劑盒購(gòu)自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司；Annexin V?FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)BD公司；TRIzol試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR RT?qPCR試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組

將Raji和Ramos細(xì)胞接種至含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，293T細(xì)胞接種至含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基，并置于37℃、5% CO2、95%濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。按照試劑盒說(shuō)明書(shū)的操作，使用Lipofectamine 3000在293T細(xì)胞轉(zhuǎn)染目的質(zhì)粒生產(chǎn)病毒后，予Polybrene輔助感染Raji或Ramos細(xì)胞，構(gòu)建 ZEB1?AS1敲降細(xì)胞。采用RT?qPCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染情況，嘌呤霉素篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株，然后以不同濃度（50 ng/mL、100 ng/mL、200 ng/mL、400 ng/mL）Dox處理 Raji和Ramos細(xì)胞，設(shè)未經(jīng)處理的相應(yīng)對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)分為4組：⑴慢病毒對(duì)照組：sh?NC+DMSO；⑵ZEB1?AS1敲低組：sh?ZEB1?AS1+DMSO；⑶Dox組：sh?NC+Dox；⑷ZEB1?AS1敲低+Dox組：sh?ZEB1?AS1+Dox。

1.4 RT?qPCR法檢測(cè)B?NHL細(xì)胞中ZEB1?AS1 mRNA的表達(dá)情況

采用Trizol提取法提取各組細(xì)胞的總RNA。根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)，分別取各組細(xì)胞總RNA 1 μg進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，再按照定量PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)，以cDNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)條件：95℃、15s；60℃、1min，40個(gè)循環(huán)。引物序列：ZEB1?AS1的上游引物為 5'?GTGGGCACTGCTGAATTTGA?3'，下游引物為5'?GCGGAACTTCTAGCCTCTCT?3'；GAPDH的上游引物為5'?GCACCGTCAAGGCTGAGAAC?3'，下游引物為5'?TGGTGAAGACGCCAGTGGA?3'。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。以GAPDH作為內(nèi)參，使用2?△△Ct法進(jìn)行相對(duì)定量的數(shù)據(jù)分析。

1.5 CCK?8法檢測(cè)B?NHL細(xì)胞的增殖活力

取穩(wěn)定轉(zhuǎn)染且經(jīng)不同濃度Dox處理后的Raji和Ramos細(xì)胞接種到96孔板（4×103/孔）中培養(yǎng)，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)48 h后，向各孔分別加入20 μL CCK?8溶液，恒溫孵育2 h，于酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔在450 nm波長(zhǎng)處的吸光度（A）。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。細(xì)胞增殖活力（%）=［（實(shí)驗(yàn)組A值?對(duì)照組A值）/（空白組A值?對(duì)照組A值）］×100%。

1.6 Annexin V?FITC/PI流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)B?NHL細(xì)胞的凋亡

取穩(wěn)定轉(zhuǎn)染且經(jīng)Dox（0 ng/mL和100 ng/mL）處理后的Raji和Ramos細(xì)胞接種到24孔板（1×105/孔）中，置于5% CO2、37℃、飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h。收集細(xì)胞培養(yǎng)液于1.5 mL離心管，并洗滌2次，取500 μL Binding Buffer重懸細(xì)胞。按照 Annexin V?FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒的操作步驟，每管依次加入5 μL Annexin V?FITC和5 μL PI，充分混勻，室溫避光孵育15 min，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用R語(yǔ)言（version 3.6.0）對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。差異表達(dá)基因的篩選標(biāo)準(zhǔn)均為：截?cái)嘀祃ogFC＞1.5，Bonferroni法調(diào)整后的P值＜0.05［9］，并對(duì)差異基因進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理。多組均數(shù)比較采用單因素方差分析，若組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，則需進(jìn)行多重比較。多個(gè)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較的多重比較采用Dunnett，兩兩比較采用Tukey檢驗(yàn)。兩組均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。采用R軟件的survival軟件包應(yīng)用Kaplan?Meier法計(jì)算總生存率并繪制生存曲線，組間差異比較采用log?rank檢驗(yàn)法。以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 目標(biāo)lncRNAs的篩選

通過(guò)GEO數(shù)據(jù)集（GSE31312）篩選前20個(gè)可預(yù)測(cè) DLBCL 不良預(yù)后的高風(fēng)險(xiǎn) lncRNAs（HR：4.46～15.56），見(jiàn)圖1A。采用UCSC XENA數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)RNAseq數(shù)據(jù)進(jìn)行l(wèi)og2轉(zhuǎn)化后的正常組織與DLBCL組織的lncRNAs表達(dá)量進(jìn)行比較，8個(gè)高風(fēng)險(xiǎn)lncRNAs中，除SPATA13（P≥0.05）外，ZFAS1、NNT?AS1、LINC01578、RPARP?AS1、ZEB1?AS1、EBLN3P、OTUD6B?AS1等在DLBCL組織中的表達(dá)均高于正常組織（均P＜0.01），見(jiàn)圖1B。RT?qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示，ZEB1?AS1在淋巴瘤細(xì)胞系Raji、Ramos、Farage的表達(dá)倍數(shù)分別是PBMC的（4.67±0.21）倍、（3.13±0.15）倍、（5.33±0.25）倍（均P＜0.05），見(jiàn)圖1C。GSE31312數(shù)據(jù)集分析顯示，ZEB1?AS1高表達(dá)組DLBCL患者（249例）中位生存時(shí)間低于低表達(dá)組（249例）（45個(gè)月vs57個(gè)月，P＜0.001），見(jiàn)圖1D。選擇ZEB1?AS1進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 目標(biāo)lncRNAs的篩選Fig.1 Screening of target lncRNAs

2.2慢病毒感染B?NHL細(xì)胞后ZEB1?AS1的表達(dá)情況

RT?qPCR 檢測(cè)結(jié)果顯示，與 sh?NC 組相比，sh?ZEB1?AS1#1組和sh?ZEB1?AS1#2組細(xì)胞中 ZEB1?AS1表達(dá)量均降低（均P＜0.05），其中 sh?ZEB1?AS1#1敲降效果最好，見(jiàn)圖2。表明成功構(gòu)建ZEB1?AS1敲低的 B?NHL細(xì)胞，用sh?ZEB1?AS1#1組細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖2 RT‐qPCR檢測(cè)慢病毒感染B‐NHL細(xì)胞后ZEB1‐AS1的表達(dá)情況Fig.2 The expression of sh‐ZEB1‐AS1 in B‐NHL cells after lentivi‐rus infection detected by RT‐qPCR

2.3 ZEB1?AS1敲低及聯(lián)合Dox對(duì)B?NHL細(xì)胞增殖活力的影響

CCK?8檢測(cè)結(jié)果顯示，敲低ZEB1?AS1后，Raji和Ramos 細(xì) 胞增殖活力均較相應(yīng)對(duì)照組降低（P＜ 0.05）；與不同濃度（50 ng/mL、100 ng/mL、200 ng/mL、400 ng/mL）Dox聯(lián)合處理后，細(xì)胞增殖活力明顯受抑制（均P＜0.05），且細(xì)胞殺傷作用呈濃度依賴性，其中100 ng/mL和50 ng/mL濃度Dox作用下細(xì)胞活性抑制作用最大，協(xié)同分?jǐn)?shù)分別為15.008和13.249，見(jiàn)圖3。

圖3 ZEB1‐AS1敲低及聯(lián)合不同濃度多柔比星對(duì)Raji和Ramos細(xì)胞活力的影響Fig.3 The effect of ZEB1‐AS1 knockdown and combined with different concentrations of doxorubicin on the viability of Raji and Ramos cells

2.4 ZEB1?AS1敲低及聯(lián)合Dox對(duì)B?NHL細(xì)胞凋亡的影響

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，與sh?NC+DMSO組相比，sh?ZEB1?AS1+DMSO組、sh?NC+Dox組、sh?ZEB1?AS1+Dox組細(xì)胞凋亡率均顯著升高（均P＜0.05），且sh?ZEB1?AS1+Dox 組細(xì)胞凋亡率明顯高于sh?NC+Dox組（P＜0.05），見(jiàn)圖4。

圖4 ZEB1‐AS1敲低及聯(lián)合多柔比星對(duì)Raji和Ramos細(xì)胞凋亡的影響Fig.4 TheeffectofZEB1‐AS1knockdownandcombineddoxorubicin on the apoptosis of Raji and Ramos cells

2.5 LncRNA?miRNA?mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的篩選與構(gòu)建

通過(guò)DIANA數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)出4個(gè)與lncRNA高度結(jié)合的miRNA，即miR?33?5p、miR?222?3p、miR?499a?5p、miR?4742?3p，結(jié)合位點(diǎn)見(jiàn)圖5A。利用R語(yǔ)言對(duì)芯片表達(dá)量進(jìn)行預(yù)處理，并按照l(shuí)ncRNA ZEB1?AS1表達(dá)量的中位數(shù)分為高表達(dá)組和低表達(dá)組后進(jìn)行mRNA共表達(dá)分析，結(jié)果共篩選出1 208個(gè)上調(diào)mRNA（與lncRNA ZEB1?AS1呈現(xiàn)共表達(dá)關(guān)系），以前50個(gè)差異基因繪制的熱圖見(jiàn)圖5B。通過(guò)R語(yǔ)言limma包和Targetscan數(shù)據(jù)庫(kù)，預(yù)測(cè)既與ZEB1?AS1呈共表達(dá)關(guān)系又與miRNA結(jié)合的差異表達(dá)mRNA，結(jié)果顯示可能存在261個(gè)靶基因受以上4個(gè)miRNAs調(diào)控，其中miR?33?5p、miR?221?3p、miR?499a?5p 和 miR?4742?3p 的靶基因分別有38個(gè)、27個(gè)、16個(gè)、180個(gè)。結(jié)合以上lncRNA?miRNA?mRNA的調(diào)控機(jī)制，最終建立ZEB1?AS1在DLBCL中的lncRNA?miRNA?mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，包括284個(gè)節(jié)點(diǎn)和291條邊。其中，284個(gè)節(jié)點(diǎn)代表1個(gè)ZEB1?AS1、4個(gè)miRNAs和232個(gè)mRNAs，291條邊表示它們之間存在291種相互作用關(guān)系，見(jiàn)圖5C；ZEB1?AS1位于該網(wǎng)絡(luò)中心，調(diào)節(jié)與之結(jié)合的miR?33?5p、miR?221?3p和miR?499a?5p、miR?4742?3p，進(jìn)而調(diào)控下游232個(gè)靶基因。

圖5 LncRNA‐miRNA‐mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的篩選與構(gòu)建Fig.5 Screening and construction of lncRNA‐miRNA‐mRNA regu‐latory network

2.6 下游基因功能及信號(hào)通路分析

GO分析共發(fā)現(xiàn)18個(gè)細(xì)胞成分、20個(gè)生物過(guò)程、3個(gè)分子功能相關(guān)富集，主要參與中心體、線粒體基質(zhì)、蛋白酶體蛋白質(zhì)分解代謝、D N A代謝調(diào)控、蛋白酶體介導(dǎo)的泛素依賴性蛋白分解代謝、泛素樣蛋白轉(zhuǎn)移酶活性等功能；KEGG分析發(fā)現(xiàn)6條相關(guān)通路，包括泛素介導(dǎo)的蛋白水解、細(xì)胞周期、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中蛋白加工過(guò)程、丙酸代謝等通路，見(jiàn)圖6。在PPI網(wǎng)絡(luò)預(yù)測(cè)中發(fā)現(xiàn)，R C HY1是擁有最高連接度的核心基因，與多種蛋白質(zhì)存在相互作用。

圖6 LncRNA靶基因KEGG、GO分析Fig.6 KEGG and GO analysis of lncRNA target genes

3 討論

近年來(lái)，越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)lncRNA可能是腫瘤發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中的生物標(biāo)志物［10］，如在直腸癌中發(fā)現(xiàn)lncRNAs有良好的診斷和預(yù)后價(jià)值［11］。更重要的是，lncRNA還能通過(guò)參與調(diào)控腫瘤生物過(guò)程，結(jié)合下游靶基因并且調(diào)節(jié)其功能，進(jìn)而影響增殖、凋亡以及分化等生物過(guò)程，在腫瘤發(fā)生發(fā)展、預(yù)后和治療中發(fā)揮重要的生物調(diào)控作用。例如，在肝癌中發(fā)現(xiàn)lncRNA WT1?AS通過(guò)上調(diào)WT1蛋白含量抑制細(xì)胞凋亡［12］。但是目前大多數(shù)lncRNAs功能尚不明確，其中l(wèi)ncRNA ZEB1?AS1與淋巴瘤也未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。本研究通過(guò)GEO數(shù)據(jù)集和qPCR驗(yàn)證lncRNA ZEB1?AS1在B?NHL細(xì)胞中高表達(dá)，且高表達(dá)預(yù)示不良生存結(jié)局。該基因的轉(zhuǎn)錄本從具有鋅指結(jié)構(gòu)E?box?結(jié)合同源框1（zinc finger E?box binding homeobox 1，ZEB1）的共享雙向啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄，其轉(zhuǎn)錄物可結(jié)合賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶2A，并促進(jìn)組蛋白修飾，而該修飾被認(rèn)為可促進(jìn)ZEB1表達(dá)。已有研究發(fā)現(xiàn)ZEB1?AS1可誘導(dǎo)肝細(xì)胞癌上皮?間充質(zhì)轉(zhuǎn)化和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移［13］；上調(diào)ZEB1?AS1表達(dá)可促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞增殖和遷移［14］。本研究在體外實(shí)驗(yàn)通過(guò)基因敲降聯(lián)合Dox處理進(jìn)一步驗(yàn)證ZEB1?AS1功能。細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，敲低ZEB1?AS1能抑制B?NHL細(xì)胞增殖，且相較單獨(dú)Dox及單獨(dú)敲低ZEB1?AS1，Dox同時(shí)處理ZEB1?AS1敲降細(xì)胞后的增殖抑制效果更明顯，提示敲低ZEB1?AS1能減弱B?NHL細(xì)胞系增殖能力，且可能對(duì)Dox的化療殺傷起協(xié)同作用。流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)也證實(shí)敲低ZEB1?AS1能促進(jìn)B?NHL細(xì)胞凋亡，敲低ZEB1?AS1可以協(xié)同Dox減少淋巴瘤對(duì)Dox的抵抗和耐受。機(jī)制可能與lncRNA能通過(guò)多種調(diào)節(jié)機(jī)制在細(xì)胞轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后水平以及染色體修飾等方面發(fā)揮調(diào)節(jié)作用有關(guān)［15］。

ceRNAs是一種lncRNA調(diào)控模式，在基因表達(dá)調(diào)節(jié)中具有重要作用，參與腫瘤發(fā)生及進(jìn)展［16?18］。在ceRNAs網(wǎng)絡(luò)中l(wèi)ncRNA以miRNA作為橋梁間接調(diào)控蛋白編碼基因表達(dá)［5］。已有研究報(bào)道lncRNA ZEB1?AS1為節(jié)點(diǎn)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，如靶向miR?365a?3p抑制肝癌細(xì)胞增殖［19］；通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合 miR?141?3p促進(jìn)肺纖維化［17］。本研究結(jié)果也顯示lncRNA ZEB1?AS1是B?NHL ceRNA網(wǎng)絡(luò)的上游信號(hào)分子，且發(fā)揮類(lèi)似海綿作用，其中miR?33?5p、miR?221?3p、miR?499a?5p和miR?4742?3p可能與下游261個(gè)靶基因形成調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的miRNA，但是lncRNA ZEB1?AS1與以上4個(gè)miRNA的調(diào)控關(guān)系有待深入研究。

本研究進(jìn)一步進(jìn)行信號(hào)通路分析及分子功能預(yù)測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)lncRNA的靶基因與中心體、線粒體基質(zhì)、蛋白酶體蛋白質(zhì)分解代謝、DNA代謝調(diào)控、泛素樣蛋白轉(zhuǎn)移酶活性等通路顯著相關(guān)。將這些在信號(hào)通路中富集的分子導(dǎo)入PPI網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)RCHY1具有最高的連接度且與多種蛋白質(zhì)存在相互作用，為尋找下游調(diào)控靶點(diǎn)提供基礎(chǔ)。

綜上所述，ZEB1?AS1敲低可抑制B?NHL細(xì)胞增殖和促進(jìn)細(xì)胞凋亡，ZEB1?AS1敲低協(xié)同Dox作用后的殺傷作用更明顯，lncRNA ZEB1?AS1可能作為DLBCL潛在的生物標(biāo)志物，以ZEB1?AS1為節(jié)點(diǎn)構(gòu)建的ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，可能是DLBCL重要的調(diào)控機(jī)制和診療靶點(diǎn)。