沉默IGFBP‐1對(duì)人胃腸道間質(zhì)瘤GIST882細(xì)胞生長(zhǎng)的影響及其作用機(jī)制

朱賢章 田偉力 田培力 李濤

胃腸道間質(zhì)瘤（gastrointe stinalstromal tumor，GIST）是最常見(jiàn)的消化道間質(zhì)腫瘤［1］，起源于胃腸道壁第四層的Cajal間質(zhì)細(xì)胞，50%～70%發(fā)生在胃部，20%～30%發(fā)生于小腸［2?4］。手術(shù)是實(shí)現(xiàn)臨床治愈的最佳療法，然而，無(wú)論是大范圍切除術(shù)還是局限性切除術(shù)，術(shù)后均有復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)，且GIST從良性轉(zhuǎn)變?yōu)閻盒赃^(guò)程較快［5?6］。此外，GIST的基因突變復(fù)雜多樣，隨著新突變位點(diǎn)的出現(xiàn)和化療耐藥性產(chǎn)生［7］，迫切需要新的特異性生物標(biāo)志物進(jìn)行臨床病理鑒定，建立有效的預(yù)防、早期診斷和治療策略。胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白1（insulin?like growth factor binding protein 1，IGFBP?1）是IGFBP家族成員之一，能以高親和力結(jié)合IGF而影響IGF?1和IGF?2的生物活性［8］。IGFBP?1主要由肝細(xì)胞合成，然后被分泌到血清中，還可由卵巢顆粒細(xì)胞、腎臟和孕婦蛻膜化子宮內(nèi)膜產(chǎn)生［9］。研究表明，IGFBP?1能影響細(xì)胞代謝、分化和生長(zhǎng)，血清IGFBP?1表達(dá)水平與多種慢性疾病密切相關(guān)，例如糖尿病、心血管疾病和結(jié)腸癌等［10?12］，然而，其在GIST中的研究少有報(bào)道。本研究探討IGFBP?1對(duì)GIST細(xì)胞生物學(xué)行為的影響及其可能的作用機(jī)制，為GIST尋找新的診斷和治療靶點(diǎn)

1 材料與方法

1.1 臨床資料

選取2018年8月至2019年12月于新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院接受手術(shù)切除治療的GIST患者45例的腫瘤組織及癌旁組織標(biāo)本（距腫瘤邊緣≥5 cm），病理類(lèi)型均為腺癌，術(shù)前均未接受放化療。危險(xiǎn)度分級(jí)依據(jù)改良美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生院（NIH）分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：極低危險(xiǎn)度3例，低危險(xiǎn)度12例，中危險(xiǎn)度14例，高危險(xiǎn)度16例。本研究經(jīng)新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者知情同意。

1.2 主要材料與試劑

GIST882細(xì)胞購(gòu)自上海賽利生物技術(shù)有限公司；IGFBP?1免疫組化染色試劑、胎牛血清、DMEM培養(yǎng)液以及胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó)HyClone公司；LipofectamineTM2000試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；EDU細(xì)胞增殖試劑盒購(gòu)自英國(guó)Abcam公司，RNAiso Plus試劑、cDNA合成試劑盒與SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ購(gòu)自日本TaKaRa公司；結(jié)晶紫染色液、CCK?8試劑盒、Transwell小室與Annexin V?FITC試劑盒均購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；BCA蛋白測(cè)定試劑盒與化學(xué)發(fā)光液ECL購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；抗體IGFBP?1、p?PI3K、PI3K、p?AKT、AKT、p?mTOR以及mTOR均購(gòu)自美國(guó)SantaCruz Biotech公司；GAPDH與HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；siRNA?IGFBP?1、陰性對(duì)照siRNA?NC以及基因引物序列均交由上海生工生物工程有限公司設(shè)計(jì)合成；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 免疫組化檢測(cè)IGFBP?1表達(dá)

組織經(jīng)固定、脫水、透明、石蠟切片、烘干脫水后，加入枸櫞酸緩沖液煮沸進(jìn)行抗原修復(fù)，3% H2O2溶液消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，山羊血清室溫封閉30 min，滴加一抗（1∶200），4℃孵育過(guò)夜。次日，滴加二抗（1∶1 000），室溫孵育30 min，沖洗后滴加二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色，蘇木素復(fù)染，脫水透明，中性樹(shù)膠封片，電鏡下觀察并拍照。陽(yáng)性細(xì)胞評(píng)分：陽(yáng)性細(xì)胞比例＜5%記 0分；5%～25%記1分；26%～50%記2分；51%～75%記3分；＞75%記4分。染色強(qiáng)度評(píng)分：未著色為0分；淡黃色為1分；棕黃色為2分；棕褐色為3分。兩者相加分?jǐn)?shù)＜2分判定為陰性，≥2分判定為陽(yáng)性。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染及分組

GIST細(xì)胞株GIST882用含10%胎牛血清（FBS），1%雙抗（100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素）的DMEM，置于5% CO2、37℃培養(yǎng)箱中常規(guī)傳代培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)覆蓋至培養(yǎng)基底部80%，使用0.25%胰蛋白酶消化，選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于后期實(shí)驗(yàn)。

GIST882細(xì)胞按1×105/孔接種于6孔板中，按照LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)方法，分別轉(zhuǎn)染siRNA?NC、siRNA?IGFBP?1，記為 siRNA?NC 組和siRNA?IGFBP?1組，并設(shè)置空白對(duì)照組，孵育 4 h后更換為DMEM新鮮培養(yǎng)基。

1.5 qRT?PCR檢測(cè)IGFBP?1 mRNA的表達(dá)

根據(jù)RNAiso Plus試劑說(shuō)明提取各組GIST882細(xì)胞的總RNA，NanoDrop2000紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA的純度、濃度。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA，參照SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒說(shuō)明，并以cDNA為模板進(jìn)行qRT?PCR實(shí)驗(yàn)。擴(kuò)增條件：95℃5 min，1個(gè)循環(huán)；95 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s、58 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。實(shí)驗(yàn)重復(fù) 3次。以GAPDH為內(nèi)參，用2?ΔΔCt法計(jì)算基因表達(dá)水平。引物序列：IGFBP?1上游引物5'?TCGATCTT?TACCCATCCTTCCT?3'，下游引物 5'?ATCGATATG?GAGGACATGACGGTGG?3'；GAPDH 上游引物 5'?GGTGAAGGTCGGTGTGAAC?3'，下游引物 5'?AGAT?GGTGATGGGCTGCCC?3'。

1.6 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)水平

RIPA裂解液提取各組細(xì)胞總蛋白，BCA法進(jìn)行蛋白定量后，取25 μg總蛋白上樣，10% SDS?PAGE分離，轉(zhuǎn)移至PVDF膜。TBST洗滌3次，5%山羊血清封閉 2 h，洗滌并加入一抗 IGFBP?1（1∶500），p?PI3K、PI3K、p?AKT、AKT、p?mTOR及mTOR（均1∶1 000），4 ℃孵育過(guò)夜。TBST洗膜后，加入HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG（1∶5 000）為二抗，室溫孵育2 h。滴加ECL 發(fā)光液顯影，Image J圖像分析軟件統(tǒng)計(jì)各條帶灰度值，并以GAPDH為內(nèi)參，計(jì)算蛋白表達(dá)水平。

1.7 CCK?8法檢測(cè)細(xì)胞活性

GIST882細(xì)胞按1×104/孔接種于96孔板上，置于37℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中過(guò)夜培養(yǎng)，按照1.4進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，每孔設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，分別于轉(zhuǎn)染后24 h、48 h和 72 h，每孔加入 10 μL CCK?8 試劑繼續(xù)培養(yǎng)4 h，采用全自動(dòng)酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處各孔細(xì)胞的光密度（OD）值。

1.8 EDU檢測(cè)細(xì)胞增殖能力

將轉(zhuǎn)染后的GIST882細(xì)胞以2×105/孔接種在24孔板中，培養(yǎng)12 h，滴加EDU至終濃度為10 μmol/L繼續(xù)培養(yǎng)2 h，4%多聚甲醛固定15 min，0.5% Triton X?100穿透20 min，Apollo567避光染色30 min，滴加DAPI染核5 min。中性樹(shù)膠封片，在激光共聚焦顯微鏡下觀察細(xì)胞，其中藍(lán)色熒光為細(xì)胞核，紅色熒光為EDU陽(yáng)性細(xì)胞。

1.9 Annexin V?FITC/PI染色流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡能力

GIST882細(xì)胞轉(zhuǎn)染后，消化離心后將細(xì)胞重懸于結(jié)合緩沖液中，在細(xì)胞懸浮液加入5 μL Annexin V?FITC混勻，混勻后再加入10 μL PI染色液，室溫下置于黑暗環(huán)境溫育30 min，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.10 Transwell檢測(cè)細(xì)胞遷移與侵襲能力

在Transwell小室的上室加50 μL稀釋的Matrigel膠，置于37℃培養(yǎng)箱40 min后，將轉(zhuǎn)染后的GIST882細(xì)胞調(diào)整為 1×106/mL，取 100 μL 細(xì)胞懸液加入Transwell上室，下室加入600 μL含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁，換無(wú)血清培養(yǎng)液培養(yǎng)12 h，孵育12 h，取出后用4%多聚甲醛固定15 min，0.1%結(jié)晶紫染色10 min，PBS洗滌，中性樹(shù)膠封片，顯微鏡下拍照并統(tǒng)計(jì)細(xì)胞數(shù)目。遷移實(shí)驗(yàn)沒(méi)有鋪Matrigel膠步驟，其他操作均與侵襲實(shí)驗(yàn)相同。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)分析處理，計(jì)量資料均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多樣本比較采用單因素方差分析，組間樣本比較采用LSD?t檢驗(yàn)；IGFBP?1陽(yáng)性表達(dá)率在GIST組織和癌旁組織的比較采用配對(duì)χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 IGFBP?1在GIST組織和癌旁組織中的表達(dá)

免疫組化檢測(cè)結(jié)果顯示，GIST組織中IGFBP?1陽(yáng)性表達(dá)率高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（86.67%vs11.11%，P＜0.05），見(jiàn)圖1。

圖1 GIST組織和癌旁組織中IGFBP‐1表達(dá)（IHC，左40×，右400×）Fig.1 IGFBP‐1 expression in GIST tissues and paracancerous tissues（IHC,Left 40×,Right 400×）

2.2 轉(zhuǎn)染后GIST細(xì)胞中IGFBP?1的表達(dá)

qRT?PCR和Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組和siRNA?NC組比較，siRNA?IGFBP?1組IGFBP?1 mRNA相對(duì)表達(dá)量和蛋白表達(dá)量均顯著降低（均P＜0.05），見(jiàn)圖2。說(shuō)明細(xì)胞轉(zhuǎn)染成功。

圖2 GIST細(xì)胞中IGFBP‐1的表達(dá)Fig.2 Expression of IGFBP‐1 in GIST cells

2.3 沉默IGFBP?1對(duì)GIST細(xì)胞增殖活性的影響

CCK?8法檢測(cè)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染24 h、48 h、72 h后，與空白對(duì)照組和siRNA?NC組比較，siRNA?IGFBP?1組細(xì)胞增殖活性均顯著下降（P＜0.05），見(jiàn)圖3。EDU染色結(jié)果顯示，siRNA?IGFBP?1組細(xì)胞中EDU陽(yáng)性細(xì)胞率［（38.25±3.15）%］較空白對(duì)照組［（69.42±6.11）%］和 siRNA?NC組［（71.56±7.04）%］均顯著降低（均P＜0.05），見(jiàn)圖4。

圖3 GIST細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞增殖活性Fig.3 Proliferative activity of GIST cells at different time points

圖4 EDU染色檢測(cè)GIST細(xì)胞增殖情況（100×）Fig.4 Proliferation of GIST cells detected by EDU staining(100×)

2.4 沉默IGFBP?1對(duì)GIST細(xì)胞凋亡的影響

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組［（4.79±0.41）%］和siRNA?NC組［（4.20±0.39）%］比較，siRNA?IGFBP?1組細(xì)胞凋亡率顯著增加［（24.12±2.03）%］（均P＜0.05），見(jiàn)圖5。

圖5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)GIST細(xì)胞凋亡情況Fig.5 Apoptosis of GIST cells detected by flow cytometry

2.5沉默IGFBP?1對(duì)GIST細(xì)胞遷移與侵襲能力的影響

Transwell小室實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組和siRNA?NC組比較，siRNA?IGFBP?1組細(xì)胞遷移數(shù)目和侵襲數(shù)目均顯著減少（均P＜0.05），見(jiàn)圖6。

圖6 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)GIST細(xì)胞遷移與侵襲能力Fig.6 The migration and invasion of GIST cells detected by Transwell assay

2.6 沉默IGFBP?1對(duì)GIST細(xì)胞中PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，siRNA?IGFBP?1組細(xì)胞中p?PI3K/PI3K、p?AKT/AKT及p?mTOR/mTOR的比值較空白對(duì)照組和siRNA?NC組顯著下降（均P＜0.05），而空白對(duì)照組與siRNA?NC組細(xì)胞中p?PI3K/PI3K、p?AKT/AKT及p?mTOR/mTOR的比值比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），見(jiàn)圖7。

圖7 Western blot檢測(cè)GIST細(xì)胞中PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)Fig.7 The expression of PI3K/AKT/mTOR signaling pathway related proteins in GIST cells detected by Western blot

3 討論

GFBPs作為一種分泌蛋白，最初研究表明其通過(guò)隔離血清和細(xì)胞外液中的IGFs而發(fā)揮IGF信號(hào)調(diào)節(jié)劑作用［8］。近年來(lái)，隨著研究不斷深入，在一些疾病和腫瘤組織或血清中也檢測(cè)到IGFBP表達(dá)，例如乳腺癌組織中IGFBP表達(dá)高于鄰近正常組織，且IGFBP在乳腺癌組織的惡性轉(zhuǎn)化中發(fā)揮一定作用［13］。卵巢癌組織和血清中也檢測(cè)到較高水平的IGFBP?1表達(dá)，且晚期患者中IGFBP?1水平更高，IGFBP?1還在卵巢透明細(xì)胞腺癌中特異性表達(dá)［14?15］。本研究也發(fā)現(xiàn) IGFBP?1在GIST組織中呈高表達(dá)，由此推測(cè)IGFBP?1可能參與GIST的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。多項(xiàng)研究還報(bào)道IGFBP?1通過(guò)與細(xì)胞表面分子相互作用而調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、黏附、凋亡、遷移和侵襲過(guò)程［16?20］。本研究進(jìn)一步通過(guò)轉(zhuǎn)染siRNA?IGFBP?1沉默GIST細(xì)胞中IGFBP?1表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)沉默后細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力下降，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，說(shuō)明沉默IGFBP?1表達(dá)對(duì)GIST細(xì)胞生長(zhǎng)具有抑制作用。

PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路參與多種細(xì)胞活動(dòng)，與細(xì)胞周期、細(xì)胞增殖及凋亡等密切相關(guān)。既往研究發(fā)現(xiàn)，在惡性腫瘤中PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路的異常激活可增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞活性，促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)和蛋白質(zhì)合成，從而促進(jìn)癌癥的發(fā)展，而抑制此信號(hào)通路激活可產(chǎn)生相反作用［21?22］。在 GIST 組織中，研究發(fā)現(xiàn)PI3K和AKT高表達(dá)，且隨著GIST惡性程度加重而表達(dá)增加［23］。本研究檢測(cè)GIST細(xì)胞中PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)沉默IGFBP?1表達(dá)后，細(xì)胞中PI3K、AKT、mTOR蛋白的磷酸化水平明顯下降，說(shuō)明在GIST細(xì)胞中下調(diào)IGFBP?1表達(dá)可阻礙PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路激活，從而抑制腫瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為，阻止腫瘤發(fā)展與惡化。

綜上所述，GIST組織中IGFBP?1高表達(dá)，沉默IGFBP?1表達(dá)可抑制GIST細(xì)胞增殖、侵襲與遷移，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與抑制PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路激活有關(guān)，本研究結(jié)果為GIST治療提供了新的靶點(diǎn)和思路。