廣藿香UPLC指紋圖譜研究及基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的廣藿香潛在質(zhì)量標(biāo)志物預(yù)測(cè)

李 媚，陳盛君*，王協(xié)和，李玲玲，徐以亮，狄留慶, 5

廣藿香UPLC指紋圖譜研究及基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的廣藿香潛在質(zhì)量標(biāo)志物預(yù)測(cè)

李 媚1, 2, 3, 4，陳盛君1, 2, 3, 4*，王協(xié)和2, 3, 4，李玲玲1, 2, 3, 4，徐以亮2, 3, 4，狄留慶1, 5

1. 南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 南京 210000 2. 江陰天江藥業(yè)有限公司，江蘇 江陰 214434 3. 江蘇省中藥配方顆粒制備與質(zhì)量控制關(guān)鍵技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 江陰 214434 4. 江蘇省中藥配方顆粒工程技術(shù)研究中心，江蘇 江陰 214434 5. 江蘇省中藥高效給藥系統(tǒng)工程技術(shù)研究中心，江蘇 南京 210000

基于UPLC指紋圖譜、質(zhì)量標(biāo)志物“五原則”和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，研究道地產(chǎn)區(qū)不同產(chǎn)地廣藿香藥材，預(yù)測(cè)廣藿香治療病毒感染和胃潰瘍的潛在質(zhì)量標(biāo)志物。建立廣藿香UPLC指紋圖譜，利用SIMCA-P 14.1分析軟件對(duì)14批藥材共有峰進(jìn)行聚類分析，利用偏最小二乘法-判別分析（partial least squares-discrimination analysis，PLS-DA）篩選共有峰組間主要差異成分。基于質(zhì)量標(biāo)志物“五原則”，對(duì)差異成分進(jìn)行初步分析，進(jìn)一步采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，通過相應(yīng)數(shù)據(jù)庫檢索差異成分、病毒感染和胃潰瘍疾病靶點(diǎn)。采用David 6.8數(shù)據(jù)庫對(duì)共有靶點(diǎn)進(jìn)行基因本體（gene ontology，GO）功能富集分析和京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析，同時(shí)構(gòu)建“成分-靶點(diǎn)-疾病-通路”網(wǎng)絡(luò)，分析廣藿香主要活性成分和關(guān)鍵靶點(diǎn)。UPLC指紋圖譜研究結(jié)合聚類分析結(jié)果顯示，廣東省2個(gè)產(chǎn)地廣藿香藥材存在一定差異。經(jīng)PLS-DA分析，篩選出4個(gè)差異成分，依次為毛蕊花糖苷、廣藿香酮、紫葳新苷和列當(dāng)苷。根據(jù)質(zhì)量標(biāo)志物“五原則”結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析結(jié)果，預(yù)測(cè)廣藿香主要活性成分為廣藿香酮和毛蕊花糖苷，兩者主要通過作用于ERBB2、EGFR、TLR4、AKT1、TNF靶點(diǎn)，調(diào)控TLR、ErbB、MAPK等信號(hào)通路，發(fā)揮抗病毒、調(diào)節(jié)腸胃功能等作用。建立的UPLC指紋圖譜方法簡(jiǎn)便，篩選的2個(gè)活性成分毛蕊花糖苷和廣藿香酮可作為廣藿香潛在的質(zhì)量標(biāo)志物，為廣藿香藥材質(zhì)量的控制和藥效相關(guān)機(jī)制的研究提供參考。

廣藿香；指紋圖譜；聚類分析；質(zhì)量標(biāo)志物“五原則”；網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)；毛蕊花糖苷；廣藿香酮；紫葳新苷；列當(dāng)苷；UPLC；PLS-DA

廣藿香藥材為唇形科植物廣藿香(Blanco) Benth.的干燥地上部分，具有芳香化濁、和中止嘔、發(fā)表解暑的功效[1]。現(xiàn)代藥理研究表明，廣藿香具有抗細(xì)菌、真菌、瘧原蟲[2-7]及調(diào)節(jié)胃腸功能、促進(jìn)消化液分泌、保護(hù)胃腸屏障[8-11]、免疫調(diào)節(jié)[12-13]、止吐[14]、抗炎[12,15]、抗氧化[16-18]、抗癌、抗腫瘤[19-20]、抗病毒[21-22]、殺蟲[23-26]、抗錐蟲[27]等藥理活性。

劉孝昌院士[28]提出的中藥質(zhì)量標(biāo)志物（quality markers，Q-Marker）概念，是基于藥物成分的質(zhì)量傳遞與溯源、特有性、有效性、處方配伍的環(huán)境和成分可測(cè)性“五原則”進(jìn)行的研究，體現(xiàn)了以Q-Marker為基礎(chǔ)的中藥材、飲片、單方或復(fù)方制劑全程質(zhì)量管理體系，在中藥的質(zhì)量控制研究中發(fā)揮著重要作用[29]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)作為一種建立在系統(tǒng)生物學(xué)和網(wǎng)絡(luò)生物學(xué)基礎(chǔ)上的新興研究方法，具有系統(tǒng)性和整體性的特點(diǎn)，廣泛用于單味藥及復(fù)方藥治療疾病多靶點(diǎn)作用機(jī)制的預(yù)測(cè)與研究[30-31]，同時(shí)作為一種輔助分析方法，對(duì)于挖掘中藥材、飲片和復(fù)方Q-Marker發(fā)揮著重要的作用[32-36]。

廣藿香化學(xué)成分包括黃酮類、萜類、苯乙醇苷類和甾體等。其中，廣藿香酮和廣藿香醇屬于萜類，毛蕊花糖苷、列當(dāng)苷等屬于苯丙乙醇苷類[37-40]。目前，有關(guān)廣藿香發(fā)揮藥理作用的活性成分研究最多的是廣藿香醇，對(duì)其他潛在的活性成分尚不清楚。道地藥材具有品種優(yōu)良、療效突出的特點(diǎn)，本研究以道地產(chǎn)區(qū)廣東產(chǎn)廣藿香為例，建立廣藿香藥材指紋圖譜，通過偏最小二乘法-判別分析（partial least squares-discrimination analysis，PLS-DA）分析對(duì)共有峰進(jìn)行初步篩選，選擇主要差異成分，根據(jù)Q-Marker“五原則”結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，基于廣藿香功能主治，預(yù)測(cè)廣藿香治療病毒感染和胃潰瘍的主要活性成分和關(guān)鍵靶點(diǎn)及作用機(jī)制，為廣藿香質(zhì)量控制和臨床發(fā)揮療效的機(jī)制研究提供參考。

1 材料

1.1 儀器與試藥

賽默飛Vanquish Core超高效液相色譜儀，賽默飛公司；安捷倫1290型超高效液相色譜儀，美國安捷倫公司；安捷倫6530四級(jí)桿串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜儀，電噴霧離子源（ESI）；MassHunter Data Acquisition采集工作站，MassHunter Qualiative Analysis分析工作站，美國安捷倫公司；Mettler Toledo ME204型萬分之一電子分析天平，上海梅特勒-托利多儀器有限公司；KQ-250DE型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；QWJ-125D型往復(fù)式切藥機(jī)，江陰香山中藥機(jī)械有限公司；控溫水浴鍋，南通華泰實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；SHZ-DIII循環(huán)水真空泵，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；BPG- 9156A精密鼓風(fēng)干燥箱，上海恒科學(xué)儀器有限公司。

乙腈為色譜純，Thermo Fisher公司；水為超純水；甲酸、磷酸、冰醋酸，色譜純，Aladdin公司；其他試劑均為分析純。

對(duì)照品廣藿香酮（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為100.00%，批號(hào)111822-201102）、毛蕊花糖苷（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為92.50%，批號(hào)111530-201713），以上對(duì)照品均購自中國食品藥品檢定研究院；對(duì)照品異毛蕊花糖苷（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98.00%，批號(hào)ST00490120MG）、芹菜素-7--β--葡萄糖醛酸苷（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98.00%，批號(hào)ST08920120），以上對(duì)照品均購自詩丹德生物技術(shù)有限公司。

1.2 藥材

14批廣藿香藥材經(jīng)江陰天江藥業(yè)有限公司藥材鑒定高級(jí)工程師唐波鑒定均為唇形科植物廣藿香(Blancome) Benth.的干燥地上部分。14批廣藿香藥材具體產(chǎn)地信息見表1。

2 方法與結(jié)果

2.1 UPLC-Q-TOF/MS檢測(cè)

2.1.1 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源（ESI）；干燥氣溫度300 ℃，體積流量8 mL/min，霧化壓力241.316 kPa（35 psi）；負(fù)離子模式下毛細(xì)管電壓3500 V，正離子模式下毛細(xì)管電壓4000 V；高分辨模式數(shù)據(jù)采集，采集范圍/100～2000。

表1 廣藿香藥材信息

2.1.2 色譜條件 Acquity UPLC?BEH（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相為甲醇-0.1%甲酸水溶液，梯度洗脫：0～2 min，10%～22%甲醇；2～15 min，22%～49%甲醇；15～25 min，49%～75%甲醇；檢測(cè)波長(zhǎng)為310 nm；柱溫為30 ℃；體積流量為0.3 mL/min。

2.1.3 供試品溶液制備 取廣藿香樣品粉末（編號(hào)S1）約0.5 g，精密稱定，分別加入50%甲醇溶液25 mL，回流提取30 min，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.1.4 廣藿香藥材正離子基峰離子色譜圖 取供試品溶液，按照“2.1.1”和“2.1.2”項(xiàng)的色譜和質(zhì)譜條件，分析出廣藿香藥材UPLC-Q-TOF/MS的正離子基峰離子色譜圖，見圖1。

根據(jù)質(zhì)譜數(shù)據(jù)結(jié)合參考文獻(xiàn)和化學(xué)數(shù)據(jù)庫對(duì)其物質(zhì)基礎(chǔ)進(jìn)行快速鑒定，推測(cè)廣藿香中化合物分子式，共鑒定了其中16個(gè)峰可能代表的化學(xué)成分，鑒定結(jié)果見表2。

利用對(duì)照品對(duì)質(zhì)譜初步鑒定結(jié)果進(jìn)行了指認(rèn)，指認(rèn)了毛蕊花糖苷（峰7）、異毛蕊花糖苷（峰9）、芹菜素葡萄糖醛酸苷（峰10）和廣藿香酮（峰13），指認(rèn)結(jié)果見圖2。

2.2 指紋圖譜分析

2.2.1 精密度試驗(yàn) 取廣藿香樣品粉末（S1）約0.5 g，按照“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照“2.1.2”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6針，將所得圖譜導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”軟件（2012版），計(jì)算各樣品UPLC圖譜的相似度。結(jié)果各特征峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD均＜0.06%，相對(duì)峰面積的RSD均＜0.5%，指紋圖譜的相似度均＞0.995。表明儀器精密度良好。

2.2.2 重復(fù)性試驗(yàn) 取廣藿香樣品粉末（S1）約0.5 g，按照“2.1.3”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，按照“2.1.2”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，將所得圖譜導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”軟件（2012版），計(jì)算各樣品UPLC圖譜的相似度。結(jié)果各特征峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD均＜0.15%，相對(duì)峰面積的RSD均＜2.0%，指紋圖譜的相似度均≥0.995。表明該方法重復(fù)性良好。

圖1 廣藿香藥材UPLC-Q-TOF/MS正離子基峰離子色譜圖

表2 廣藿香UPLC-Q-TOF/MS鑒定結(jié)果

圖2 對(duì)照品指認(rèn)結(jié)果

2.2.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取廣藿香供試品溶液（S1），按照“2.1.2”項(xiàng)下色譜條件分別在制備后0、1、2、4、6、8、10、12 h進(jìn)樣測(cè)定，將所得圖譜導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”軟件（2012版），計(jì)算各樣品UPLC圖譜的相似度。結(jié)果各特征峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD均＜0.2%，相對(duì)峰面積的RSD均＜0.7%，指紋圖譜的相似度均≥0.995。表明該供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.4 指紋圖譜建立 按“2.1.3”項(xiàng)下方法分別制備14批廣藿香藥材供試品溶液，按照“2.1.2”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄UPLC圖。將色譜圖導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”軟件（2012版），得到13個(gè)共有峰，以S1為參照?qǐng)D譜，采用中位數(shù)法，時(shí)間窗為0.1 s，進(jìn)行多點(diǎn)校正和全譜峰匹配，生成對(duì)照指紋圖譜（R），見圖3。以對(duì)照指紋圖譜為參照，計(jì)算共有峰相似度，結(jié)果顯示，S1～S5、S11～S14相似度均在0.941～0.993，相似度較高，S6～S10相似度在0.760～0.850，相似度較低。結(jié)果見表3。

2.2.5 聚類分析 將14批廣藿香的13個(gè)共有峰相對(duì)峰面積導(dǎo)入SIMCA-P 14.1分析軟件，對(duì)樣本進(jìn)行聚類分析，分析結(jié)果見圖4。結(jié)果顯示，廣藿香藥材S1～S5、S11～S14聚為1類，S6～S10聚為1類，說明廣東省2個(gè)產(chǎn)地廣藿香藥材之間存在一定差異。

圖3 廣藿香藥材指紋圖譜

表3 廣藿香藥材相似度結(jié)果

2.2.6 PLS-DA分析 采用PLS-DA分析方法對(duì)13個(gè)共有峰分別進(jìn)行分析，得分圖、S-plot分析結(jié)果和變量重要性投影預(yù)測(cè)結(jié)果分別見圖5～7。得分圖結(jié)果顯示，廣東省2個(gè)產(chǎn)地廣藿香各自聚為一類，2個(gè)產(chǎn)地藥材之間存在差異。S-plot圖中距離原點(diǎn)由遠(yuǎn)到近的4個(gè)變量依次為峰7、13、6、8，變量距離原點(diǎn)中心越遠(yuǎn)，對(duì)樣品的區(qū)分能力越強(qiáng)。VIP圖中，一般VIP值＞1的變量為組間樣本的主要差異變量，且VIP值越大，表明該成分對(duì)組間差異的貢獻(xiàn)越大。綜合圖6、7，得出各色譜峰影響程度前4位依次為峰7＞峰13＞峰6＞峰8，根據(jù)質(zhì)譜鑒定及對(duì)照品指認(rèn)結(jié)果，峰7為毛蕊花糖苷，峰13為廣藿香酮，峰6可能為紫葳新苷，峰8可能為列當(dāng)苷。即廣藿香主要差異成分為毛蕊花糖苷、廣藿香酮、紫葳新苷和列當(dāng)苷。

圖4 廣藿香藥材聚類分析

圖5 廣藿香PLS-DA得分圖

圖6 廣藿香PLS-DA S-plot圖

圖7 廣藿香PLS-DA VIP值圖

3 基于“五原則”的廣藿香Q-Marker探討

3.1 基于植物親緣學(xué)及化學(xué)成分特有性探討廣藿香Q-Marker

廣藿香始載于《異物志》，根據(jù)產(chǎn)地不同，石牌、寶崗等地產(chǎn)廣藿香又稱“牌香”；肇慶地區(qū)高要等地產(chǎn)廣藿香又稱“高要藿香”“肇香”。廣藿香醇和廣藿香酮為廣藿香特有性成分，不同品種和遺傳多樣性都會(huì)影響兩者的含量，劉曉瑩等[42]采用AFLP反應(yīng)體系對(duì)14個(gè)不同種群的212個(gè)樣本進(jìn)行遺傳多樣性分析，研究廣藿香遺傳變異和遺傳結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)廣藿香的種間遺傳多樣性高于種內(nèi)遺傳多樣性，且種群間遺傳分化遠(yuǎn)大于種群內(nèi)遺傳分化。謝宜杰等[43]采用甲基化敏感擴(kuò)增多態(tài)性（methylation sensitive amplification polymorphism，MSAP）技術(shù)對(duì)廣藿香酮和廣藿香醇的基因組DNA進(jìn)行甲基化分析，結(jié)果石牌廣藿香（酮型）與其余產(chǎn)地的廣藿香（醇型）分成2個(gè)分支，廣藿香居群間的變異所占百分比遠(yuǎn)大于居群內(nèi)變異所占百分比。對(duì)篩選出的10條石牌產(chǎn)地與其余產(chǎn)地差異性片段進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，發(fā)現(xiàn)一條屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族，說明可通過MSAP技術(shù)在不同來源的樣品中鑒別出石牌產(chǎn)地的廣藿香，廣藿香不同化學(xué)型的形成與其DNA甲基化水平有密切連續(xù)。

3.2 基于傳統(tǒng)藥效與藥性探討廣藿香Q-Marker

3.2.1 成分與傳統(tǒng)功效的相關(guān)性 《中國藥典》2020年版中記載廣藿香具有芳香化濁、和中止嘔、發(fā)表解暑的功效?！睹t(yī)別錄》中曰“療風(fēng)水毒腫，去惡氣，療霍亂、心痛”，《本草逢原》中“藿香入手足太陰。芳香之氣主脾醒胃，故能止嘔逆，開胃進(jìn)食。溫中通。凡時(shí)行疫癘，山嵐瘴瘧，用此醒脾健胃，則邪氣自無容而愈矣”。廣藿香酮為廣藿香揮發(fā)油的主要成分之一，毛蕊花糖苷、紫葳新苷、列當(dāng)苷為苯乙醇苷類主要成分?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明廣藿香揮發(fā)油、苯乙醇苷類具有調(diào)節(jié)脾胃、抗病毒等藥理作用[44-46]，與廣藿香傳統(tǒng)藥效具有一定的相關(guān)性。

3.2.2 成分與藥性的相關(guān)性 廣藿香味辛，微溫。歸脾、胃、肺經(jīng)。辛味藥主要包含揮發(fā)油類、苷類和生物堿類3類化學(xué)成分，其中揮發(fā)油、苷類是辛味藥的物質(zhì)基礎(chǔ)[47]。研究表明，辛味藥具有發(fā)散解表的作用，主要表現(xiàn)在解熱、抗菌、抗病毒、調(diào)節(jié)脾胃等方面。故廣藿香酮、毛蕊花糖苷和列當(dāng)苷等可作為Q-Marker分析對(duì)象。

3.3 基于入血成分探討廣藿香Q-Marker

藥物經(jīng)吸收入血后才能發(fā)揮藥效，所以，分析給藥入血后的中藥成分及其體內(nèi)代謝產(chǎn)物對(duì)中藥Q-Marker的預(yù)測(cè)分析具有重要意義。黎玉翠[15]建立LC-ESI-MS分析方法，大鼠口服給藥廣藿香酮，考察了廣藿香酮在大鼠體內(nèi)的代謝行為，發(fā)現(xiàn)口服后大鼠血液、膽汁和尿液中均可檢測(cè)到廣藿香酮及其代謝產(chǎn)物，而在糞便中未檢測(cè)到廣藿香酮原型及其代謝物，說明大鼠口服廣藿香酮后，存在肝腸循環(huán)，對(duì)廣藿香酮給藥后不同時(shí)間廣藿香酮體內(nèi)代謝產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)廣藿香酮給藥后5 min開始，即可檢測(cè)到代謝產(chǎn)物。前期研究發(fā)現(xiàn)，大鼠口服給藥廣藿香酮2 h內(nèi)血液濃度即可達(dá)到峰值，其半衰期低于5 h[48]，給藥24 h后血液中僅能檢測(cè)到極微量的廣藿香酮。秦臻[49]建立的廣藿香藥材及血漿中廣藿香酮定量分析方法簡(jiǎn)便快捷，可作為廣藿香藥材及其相關(guān)制劑中廣藿香酮的含量測(cè)定及質(zhì)量控制監(jiān)控的手段，適用于廣藿香酮在生物體內(nèi)含量的測(cè)定。且對(duì)廣藿香酮體內(nèi)生物利用度進(jìn)行了研究，經(jīng)測(cè)定血漿中廣藿香酮含量，發(fā)現(xiàn)小鼠口服廣藿香酮后，體內(nèi)過程均表現(xiàn)為峰濃度與血藥濃度-曲線下面積與給藥劑量均呈正比，符合線性劑量關(guān)系，廣藿香酮在小鼠體內(nèi)絕對(duì)生物利用度為76.67%，提示廣藿香酮在小鼠體內(nèi)吸收度良好。霍仕霞等[50]通過大鼠ig給予不同劑量毛蕊花糖苷，采用LC-MS/MS法測(cè)定不同時(shí)間點(diǎn)大鼠血漿及組織中毛蕊花糖苷濃度，發(fā)現(xiàn)毛蕊花糖苷在大鼠體內(nèi)的吸收屬于一級(jí)動(dòng)力學(xué)，其中分布在小腸和肺濃度最高，其次為胃和肌肉，且通過尿液、糞便和膽汁排泄量較少，預(yù)測(cè)毛蕊花糖苷主要通過代謝過程吸收入血發(fā)揮作用。黃婧嫣[51]采用HPLC法檢測(cè)大鼠一次大劑量ig給藥毛蕊花糖苷后不同時(shí)間點(diǎn)血液和臟器中毛蕊花糖苷的含量變化，發(fā)現(xiàn)毛蕊花糖苷在胃腸道中的濃度最高，在其余臟器和血漿中分布較低。毛蕊花糖苷在胃腸道內(nèi)發(fā)生了降解，主要產(chǎn)生了咖啡酸、羥基酪醇、咖啡酸、毛蕊花糖苷脫羥基酪醇產(chǎn)物和毛蕊花糖苷的同分異構(gòu)體4種代謝產(chǎn)物，毛蕊花糖苷降解率為（26.68±1.38）%。

經(jīng)TCMSP數(shù)據(jù)庫（https://tcmspw.com/tcmsp. php）查詢，廣藿香酮、毛蕊花糖苷、列當(dāng)苷和紫葳新苷的口服生物利用度依次為30.17%、2.94%、2.74%、3.28%；類藥性依次為0.07、0.62、0.68、0.58。除廣藿香酮外，毛蕊花糖苷、列當(dāng)苷和紫葳新苷3種苯乙醇苷類成分口服生物利用度均較低。劉貴玉等[52]通過對(duì)部分苯乙醇苷類成分的體內(nèi)藥物代謝性質(zhì)（absorption、distribution、metabolism、excretion，ADME）研究發(fā)現(xiàn)，苯乙醇苷類因其特殊的結(jié)果，在體內(nèi)吸收較差，生物利用度低，但其藥效顯著，原型及其代謝產(chǎn)物組成的混合物是其發(fā)揮藥效的活性成分，苯乙醇苷類成分口服進(jìn)入人體后，在體內(nèi)主要發(fā)生水解、還原、脫羥基、甲基化、硫酸化和葡萄糖醛酸化等反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，改善劑型可提高苯乙醇苷類成分的生物利用度，馮文彬 等[53]采用熔融法制備毛蕊花糖苷固體分散體，通過提高毛蕊花糖苷的溶出度，有效提高其生物利用度。Chen等[54]通過生物等位置換和功能“淘汰”戰(zhàn)略設(shè)計(jì)了一種列當(dāng)苷類似物來改善列當(dāng)苷藥動(dòng)學(xué)特性和含量小等缺點(diǎn)，有效提高了其生物利用度。

3.4 基于成分可測(cè)性探討廣藿香Q-Marker

藥典中只規(guī)定了廣藿香中百秋李醇的含量測(cè)定方法及限度，對(duì)其他成分的含量測(cè)定方法目前也有相關(guān)研究，畢丹等[38]建立了UPLC色譜法同時(shí)測(cè)定廣藿香中新西蘭牡荊苷2、毛蕊花糖苷、異毛蕊花糖苷、列當(dāng)苷、藿香黃酮醇和廣藿香酮含量，該方法穩(wěn)定、簡(jiǎn)便可行，可用于廣藿香質(zhì)量控制。葉超等[55]采用HPLC法，以甲醇-0.1%醋酸水溶液（40∶60）為洗脫溶劑，建立了廣藿香中毛蕊花糖苷的含量測(cè)定方法，該方法重復(fù)性好、簡(jiǎn)單可行，可作為廣藿香藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)控制方法。陳海明等[56]采用HPLC法，以乙腈-0.4%磷酸溶液（75∶25）為洗脫溶劑，建立了廣藿香中廣藿香酮的含量測(cè)定方法，該含量測(cè)定方法簡(jiǎn)便快捷，重復(fù)性好，可用于廣藿香質(zhì)量控制。

3.5 基于不同配伍中表達(dá)成分探討廣藿香Q-Marker

中藥配伍后同一藥味在不同復(fù)方中發(fā)揮的功效不同，化學(xué)成分也會(huì)發(fā)生變化，因根據(jù)不同處方中配伍情況分析其發(fā)揮作用的可能化合物。張睿增等[57]采用GC-MS分析技術(shù)分析廣藿香和佩蘭揮發(fā)性成分在配伍前后的含量及種類變化情況，發(fā)現(xiàn)藥對(duì)中新增了蘑菇醇、金合歡烯、γ-廣藿香烯等8個(gè)化合物，而廣藿香中α-石竹烯、α-廣藿香烯、廣藿香烯等10個(gè)化合物和紫蘇中紫蘇醛、甲基丁香酚、異植物醇等9個(gè)化合物均在藥對(duì)中未檢測(cè)到。此外，單味藥對(duì)中α-蒎烯、β-蒎烯、廣藿香醇等化合物的含量在藥對(duì)中明顯提高，石竹烯、廣藿香酮等化合物含量在藥對(duì)中有所降低。唐飛等[58]采用GC-MS分析方法比較廣藿香、厚樸配伍前后揮發(fā)油的化學(xué)成分及抗菌活性的影響，發(fā)現(xiàn)配伍后揮發(fā)油成分含量發(fā)生了變化，化合物新增了7種，減少了5種，廣藿香醇含量較配伍前含量降低。且體外抑菌實(shí)驗(yàn)表明，配伍后抗菌活性增強(qiáng)，抗菌作用較單味藥強(qiáng)。

綜合以上，廣藿香酮、毛蕊花糖苷、列當(dāng)苷和紫葳新苷可作為廣藿香質(zhì)量標(biāo)志物的研究目標(biāo)，將進(jìn)一步通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)其Q-Marker。

4 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

4.1 成分靶點(diǎn)預(yù)測(cè)分析

在Pubchem數(shù)據(jù)庫（https://pubchem.Ncbi.Nlm. Nih.gov/）中查找廣藿香酮、毛蕊花糖苷、列當(dāng)苷和紫葳新苷4種差異性成分的Canonical SMILES編號(hào)并依次導(dǎo)入到Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫（http://www.Swisstargetprediction.ch/）中，選擇物種為“homo sapiens”，預(yù)測(cè)各成分的靶點(diǎn)，剔除重復(fù)靶點(diǎn)蛋白，共得到相關(guān)的54個(gè)靶點(diǎn)蛋白。

4.2 疾病靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

在數(shù)據(jù)庫OMIM（http://www.omim.org/）、Gene Cards（https://www.genecards.org/）中分別以“Virus infection”和“Gastric ulcer”為關(guān)鍵詞，其中GeneCards數(shù)據(jù)庫中篩選出relevance score≥30的靶點(diǎn)，搜索相關(guān)疾病靶點(diǎn)，共得到與病毒感染和胃潰瘍相關(guān)的疾病靶點(diǎn)分別為375、123。將廣藿香4個(gè)成分靶點(diǎn)與2種疾病靶點(diǎn)進(jìn)行匹配，運(yùn)用Venny2.1.0工具繪制Venn圖，見圖8。結(jié)果廣藿香4種成分與2種疾病共有5個(gè)共同靶點(diǎn)，分別為酪氨酸激酶受體2（erythroblastic oncogene B 2，ERBB2）、表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）、Toll樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）、絲氨酸/酪氨酸激酶1（AKT1）、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）。

4.3 功能富集分析與通路分析

利用David 6.8數(shù)據(jù)庫（https://david.ncifcrf. gov/）對(duì)5個(gè)共有靶點(diǎn)進(jìn)行基因本體（gene ontology，GO）功能富集分析和京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析。GO和KEGG分析均以＜0.05表示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在GO富集分析中，共獲取76個(gè)GO條目，其中生物過程（biological process，BP）占54個(gè)，分子功能（molecular function，MF）占14個(gè)，細(xì)胞組分（cellular component，CC）占8個(gè)；在KEGG通路富集中，共得到32條通路。選擇＜0.05%且偽發(fā)現(xiàn)率（false discovery rate，F(xiàn)DR）＜0.05%的GO條目和KEGG通路進(jìn)行可視化分析，GO條目可視化結(jié)果見圖9。GO分析結(jié)果提示生物過程（BP）主要富集在對(duì)細(xì)胞表面受體信號(hào)通路、蛋白質(zhì)磷酸化、磷脂醇3-激酶信號(hào)、NO生物合成過程等的調(diào)節(jié)和細(xì)胞對(duì)表皮生長(zhǎng)因子刺激的反應(yīng)；分子功能（MF）主要富集在一氧化氮合成酶調(diào)節(jié)劑活性、受體信號(hào)蛋白酪氨酸激酶活性和蛋白激酶活性方面；細(xì)胞組分（CC）主要富集在等離子膜和細(xì)胞表面。KEGG通路可視化結(jié)果見圖10。富集到的通路主要涉及Toll樣受體（Toll-like receptor）信號(hào)通路、酪氨酸激酶（ErbB）信號(hào)通路、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路、缺氧誘導(dǎo)因子1（HIF-1）信號(hào)通路、子宮內(nèi)膜癌、非小細(xì)胞肺癌、胰腺癌、前列腺癌、美國錐蟲病、丙型肝炎、乙肝和甲型流感等。

圖8 廣藿香化學(xué)成分、病毒感染及胃潰瘍疾病韋恩圖

圖9 共有靶點(diǎn)的GO分析

圖10 共有靶點(diǎn)的KEGG分析

4.4 成分-靶點(diǎn)-疾病-通路網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

以54個(gè)靶點(diǎn)相關(guān)的4個(gè)成分、32條通路、2種疾病為節(jié)點(diǎn)（node），在Excel中建立彼此對(duì)應(yīng)關(guān)系，將表格導(dǎo)入到Cytoscape 3.6.0軟件中，建立成分-靶點(diǎn)-疾病-通路關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖，（正方形代表成分、菱形代表靶點(diǎn)、正六邊形代表通路、錐形代表疾?。Y(jié)果見圖11。結(jié)果顯示，廣藿香酮（degree 35）和毛蕊花糖苷（degree 16）與各靶點(diǎn)連接度較高，說明廣藿香酮和毛蕊花糖苷可能為廣藿香主要活性成分。靶點(diǎn)ERBB2（degree 15）、EGFR（degree 20）、TLR4（degree 16）、AKT1（degree 28）、TNF（degree 22）與各通路連接度較高，同時(shí)與2種疾病有較高的連接度，說明ERBB2、EGFR、TLR4、AKT1、TNF為廣藿香治療病毒感染和胃潰瘍的主要靶點(diǎn)。

圖11 廣藿香成分-靶點(diǎn)-疾病-通路關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖

5 討論

經(jīng)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析，ERBB2、EGFR、TLR4、AKT1、TNF靶點(diǎn)是廣藿香治療病毒感染和胃潰瘍的關(guān)鍵靶點(diǎn)，且5個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)中AKT、TLR4、TNF參與TLR信號(hào)通路，ERBB2、EGFR參與ErbB信號(hào)通路。AKT1是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（AKT1、AKT2和AKT3）之一，調(diào)節(jié)許多過程，包括代謝、增殖、細(xì)胞生存、生長(zhǎng)和血管生成。TLR4為跨膜蛋白，屬于Toll樣受體之一，TLR4的激活能導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）和炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生，它的配體還包括幾種病毒蛋白、多糖和多種內(nèi)源性蛋白。TNF是一種由TNF基因編碼的人類蛋白，主要由巨噬細(xì)胞分泌，可誘導(dǎo)某些腫瘤細(xì)胞系的細(xì)胞死亡，在一定程度下可刺激細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞分化。

TLR通路的信號(hào)傳導(dǎo)主要與受體胞內(nèi)TIR結(jié)構(gòu)域和與之結(jié)合的接頭蛋白髓樣分化因子88（myeloid differentiation factor 88，MyD88）有關(guān)，經(jīng)配體刺激后，MyD88使激酶白細(xì)胞介素受體相關(guān)激酶（interleukin-1 receptor-associated kinase，IRAK）結(jié)合到TLRs上，經(jīng)過相互反應(yīng)，白介素1受體關(guān)聯(lián)激酶1重組蛋白（interleukin 1 receptor associated kinas 1，IRAK-1）被磷酸化而激活，然后導(dǎo)致c-Jun氨基末端激酶（c-Jun-terminal kinase，JNK）和NF-κB的激活，對(duì)TLR通路進(jìn)行負(fù)調(diào)節(jié)。

EGFR位于表皮，EGFR配體主要包括表皮生長(zhǎng)因子（epidermal growth factor，EGF）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-α（transforming growth factor-α，TGF-α）、BTC、肝素結(jié)合表皮生長(zhǎng)因子（heparin binding epidermal growth factor，HBEGF）和EPR，其中EGF和TGF-α是最重要的2個(gè)配體，EGFR被配體激活后，誘導(dǎo)其內(nèi)在蛋白激酶激活，并進(jìn)一步激活下游細(xì)胞信號(hào)通路Ras/Raf/MEK/ERK/MAPK、PI3K/PKB通路和JAK/STAT通路，在細(xì)胞增殖、存活、侵襲和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著重要作用。ERBB2為酪氨酸蛋白激酶，GP30是該受體的潛在配體，調(diào)控外周微管的生長(zhǎng)和穩(wěn)定，ERBB2激活后，MEMO1-RHOA- DIAPH1信號(hào)通路發(fā)生磷酸化，從而抑制細(xì)胞膜上的糖原合酶激酶3Β（glycogen synthase kinase-3 beta，GSK3B）。

ErbB信號(hào)通路通過介導(dǎo)PI3K/Akt通路、JAK/ STAT通路和MAPK信號(hào)通路來調(diào)控細(xì)胞增殖、遷移、分化、凋亡和細(xì)胞動(dòng)性。在ErbB信號(hào)通路過程中，EGFR在與EGF或TGF-α結(jié)合后，通過系列蛋白相互作用，促進(jìn)線粒體激活MAPK，從而激活PI3K/Akt通路、JNK和MAPK信號(hào)通路，進(jìn)而觸發(fā)基因轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)DNA合成和細(xì)胞增殖。

已有研究發(fā)現(xiàn)，廣藿香中β-廣藿香烯通過增強(qiáng)超氧化物歧化酶、谷胱甘肽和氧化氫酶的含量，降低丙二醛含量抑制氧化應(yīng)激，降低腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）等的水平，以及下調(diào)Fas、FasL和半胱天冬酶-3（Caspase-3）蛋白表達(dá)，上調(diào)原癌基因蛋白（c-fos、c-jun）和微小RNA-21（microRNA- 21，miR-21）的基因表達(dá)和細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK1/2）的磷酸化水平以抑制胃黏膜細(xì)胞凋亡，對(duì)抗無水乙醇引起的胃潰瘍；還能通過降低TNF-α、單核細(xì)胞趨化蛋白-1（monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1）、P-選擇素（P-selectin）、血管細(xì)胞粘附分子（vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1）和髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）等的水平，下調(diào)核因子Iκ抑制因子α（inhibitory subunit of nf kappa b alpha，IκBα）和JNK的磷酸化水平以抑制NF-κB與JNK信號(hào)通路，減緩炎癥反應(yīng)，升高環(huán)氧合酶-1（cyclooxygenase-1，COX-1）、環(huán)氧合酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）和前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）的蛋白表達(dá)，促進(jìn)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和Fms樣酪氨酸激酶-1（Fms-like tyrosine kinase-1，flt-1）表達(dá)，抑制內(nèi)皮素-1（endothelin-1，ET-1）和內(nèi)皮素A受體（endothelin A receptor，ETAR）表達(dá)以促進(jìn)血管生成，加速吲哚美辛引起的胃潰瘍愈合，還能降低TNF-α、細(xì)胞間黏附分子- 1（intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1）、P-selectin和MPO的水平，下調(diào)TLR4和MyD88的蛋白表達(dá)，抑制IκBα的磷酸化以及p65亞基的核易位，從而抑制TLR4介導(dǎo)的NF-κB信號(hào)通路，調(diào)節(jié)免疫功能以減緩腸黏膜的損傷[59]。

目前，有關(guān)廣藿香抗病毒感染引起的相關(guān)疾病的治療主要通過減輕病毒感染后的炎癥反應(yīng)來實(shí)現(xiàn)。研究發(fā)現(xiàn)，廣藿香醇和廣藿香酮均具有較強(qiáng)的抗炎活性，兩者均可下調(diào)炎癥介質(zhì)的信使mRNA表達(dá)，依耐性地減少炎癥部位TNF-α、IL-1β，PGE2和一氧化氮的堆積，抑制炎癥部位TNF-α、白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶和COX-2和PGE2的合成，減少炎癥組織中丙二醛堆積，降低NO含量來發(fā)揮抗炎活性[60-61]。Mirko等[62]發(fā)現(xiàn)毛蕊花糖苷通過抑制轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β激活激酶1/JNK/激活蛋白1（activator protein-1，AP-1）及其下游COX-2和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）的表達(dá)發(fā)揮抗炎作用。Motojima等[63]發(fā)現(xiàn)毛蕊花糖苷通過下調(diào)Ca/NFATc和JNK/MAPK信號(hào)通路，抑制IL-4、TNF-α等細(xì)胞因子的表達(dá)，抑制嗜堿性粒細(xì)胞I型超敏反應(yīng)的發(fā)生。此外，毛蕊花糖苷還能抑制肥大細(xì)胞和嗜堿性細(xì)胞組胺、花生四烯酸和前列腺素的釋放及細(xì)胞因子TNF-α、IL-4的產(chǎn)生，抑制炎癥反應(yīng)[64]。彭紹忠[65]研究發(fā)現(xiàn)，廣藿香有效成分廣藿香醇能降低致炎大鼠足趾中NO、PGE2、TNF-α含量，減輕炎癥反應(yīng)，延長(zhǎng)病毒感染小鼠生存時(shí)間的作用，廣藿香醇能增強(qiáng)肺組織中超氧化物歧化酶活力，降低丙二醛含量，減輕小鼠肺組織脂質(zhì)過氧化損傷，提高抗自由基損傷功能，調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能，從而達(dá)到抗病毒作用。

本研究建立了廣藿香藥材UPLC指紋圖譜，分析了不同產(chǎn)地廣藿香藥材的主要差異成分，基于質(zhì)量標(biāo)志物“五原則”，對(duì)差異成分進(jìn)行了初步分析，發(fā)現(xiàn)差異成分符合“五原則”要求，可作為廣藿香質(zhì)量標(biāo)志物的研究對(duì)象，進(jìn)一步采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，根據(jù)廣藿香傳統(tǒng)功能主治，對(duì)廣藿香治療病毒感染和胃潰瘍的主要活性成分、關(guān)鍵基因和作用機(jī)制進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)廣藿香主要活性成分廣藿香酮和毛蕊花糖苷主要通過作用于ERBB2、EGFR、TLR4、AKT1、TNF靶點(diǎn)，調(diào)控TLR信號(hào)通路、ErbB、MAPK等信號(hào)通路，發(fā)揮抗病毒、調(diào)節(jié)腸胃等作用。

本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對(duì)廣藿香潛在Q- Marker進(jìn)行預(yù)測(cè)分析時(shí)，首先對(duì)廣藿香化學(xué)成分、疾病對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)進(jìn)行匹配，選取廣藿香化學(xué)成分與2種疾病共有靶點(diǎn)進(jìn)行分析，篩選結(jié)果可信度較高，但考慮到目前網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究仍然具有一定的局限性，同一成分在不同藥物或不同處方中，篩選結(jié)果相似度程度高，后續(xù)仍需通過藥效實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，以進(jìn)一步確定本研究預(yù)測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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UPLC fingerprint ofand prediction of its potential quality markers based on network pharmacology

LI Mei1, 2, 3, 4, CHEN Sheng-jun1, 2, 3, 4, WANG Xie-he2, 3, 4, LI Ling-ling1, 2, 3, 4, XU Yi-liang2, 3, 4, DI Liu-qing1, 5

1. College of Pharmacy, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210000, China 2. Jiangyin Tianjiang Pharmaceutical Co., Ltd., Jiangyin 214434, China 3. Jiangsu Key Technology Laboratory for Preparation and Quality Control of Traditional Chinese Medicine Granules, Jiangyin 214434, China 4. Jiangsu Traditional Chinese Medicine Formula Granule Engineering Research Center, Jiangyin 214434, China 5. Jiangsu Engineering Research Center for Efficient Delivery System of TCM, Nanjing 210000, China

To research Guanghuoxiang (, PH) in different producing areas and predict the main active ingredients of PH in the treatment of viral infection and gastric ulcer based on UPLC fingerprint, “five principles” of quality markers and network pharmacology.The UPLC fingerprint of PH was established, and the common peaks of 14 batches were analyzed by SIMCA-P 14.1 analysis software, and the main difference components were selected by partial least squares- discrimination analysis (PLS-DA). Based on quality markers “five principles”, the differential components were preliminarily analyzed; The differential compositions, virus infection and gastric ulcer disease related targets were retrieved through the related database by network pharmacology. David 6.8 database was used for gene ontology (GO) function enrichment analysis and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) pathway enrichment analysis of common targets, and a “component-target-disease- pathway” network was constructed to analyze the main active components and key targets of PH.The results of UPLC fingerprint and cluster analysis showed that there were some differences in PH between the two producing areas in Guangdong Province. Four different components were selected by PLS-DA, which were verbascoside, pogostone, campneoside I and crenatoside in order. According to the “five principles” of quality markers combined with the network pharmacological analysis results, the main active ingredients of PH were pogostone and verbascoside. Both of them could regulate TLR signaling pathway, ErbB, MAPK and other signaling pathways by ERBB2, EGFR, TLR4, AKT1 and TNF targets, and played antiviral and gastrointestinal regulation roles.The UPLC fingerprint method established in this study was simple, the two active ingredients could be used asquality markers of PH, which provided reference for the research on quality control of PH and the mechanism related to drug efficacy.

; fingerprint; cluster analysis; “five principles” of quality markers; network pharmacology; verbascoside; pogostone; campneoside Ⅰ; crenatoside; UPLC; PLS-DA

R283.6

A

0253 - 2670(2021)09 - 2665 - 13

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.09.017

2021-02-04

國家科技重大專項(xiàng)項(xiàng)目（2019ZX09201005-002-006）

李 媚（1994—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)橹兴帍?fù)方與經(jīng)典名方研究開發(fā)。Tel: 19852880756 E-mail: 202918054@qq.com

陳盛君（1979—），女，博士，副主任藥師，碩士生導(dǎo)師，從事中藥配方顆粒與經(jīng)典名方研究開發(fā)工作。Tel: 15370230291 E-mail: chensj@tianjiang.com

[責(zé)任編輯 鄭禮勝]