基于譜效關(guān)系的肉桂改善腎陽(yáng)虛作用的質(zhì)量標(biāo)志物（Q-Marker）研究

侯小濤，陳曉璐，郝二偉，杜正彩，韋 瑋，盧炳達(dá)，任 鑫，鄧家剛*

基于譜效關(guān)系的肉桂改善腎陽(yáng)虛作用的質(zhì)量標(biāo)志物（Q-Marker）研究

侯小濤1, 2, 3，陳曉璐1, 2，郝二偉2, 3，杜正彩2, 3，韋 瑋2, 3，盧炳達(dá)1, 2，任 鑫1, 2，鄧家剛2, 3*

1. 廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，廣西 南寧 530200 2. 廣西中藥藥效研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530200 3. 廣西農(nóng)作物廢棄物功能成分研究協(xié)同創(chuàng)新中心，廣西 南寧 530200

建立基于譜效關(guān)系的肉桂（的干燥樹(shù)皮）改善腎陽(yáng)虛作用的質(zhì)量標(biāo)志物（quality marker，Q-Marker）研究方法，為其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及質(zhì)量控制研究提供依據(jù)。采用高效液相色譜法，建立不同產(chǎn)地肉桂水煎液及甲醇提取物的指紋圖譜。采用氫化可的松建立小鼠腎陽(yáng)虛癥模型，以體質(zhì)量增長(zhǎng)率、三碘甲狀腺氨酸（triiodothyronine，T3）、四碘甲狀腺氨酸（tetraiodothyronine，T4）、促腎上腺皮質(zhì)激素（adrenal cortical hormone，ACTH）、腎臟指數(shù)、睪丸指數(shù)作為指標(biāo)評(píng)價(jià)不同產(chǎn)地肉桂的改善腎陽(yáng)虛作用。通過(guò)灰色關(guān)聯(lián)度分析構(gòu)建色譜峰與藥效指標(biāo)的相關(guān)性，篩選Q-Marker。在改善腎陽(yáng)虛方面，肉桂水煎液中肉桂酸為關(guān)聯(lián)度較高的成分（＞0.74）；肉桂甲醇提取物中肉桂醛、肉桂酸關(guān)聯(lián)度最高（＞0.80），鄰甲氧基肉桂醛關(guān)聯(lián)度較高（＞0.72），初步確認(rèn)了肉桂醛、肉桂酸、鄰甲氧基肉桂醛為肉桂改善腎陽(yáng)虛的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)即Q-Marker。通過(guò)譜效關(guān)系研究，探討了肉桂改善腎陽(yáng)虛作用的Q-Marker，可為肉桂改善腎陽(yáng)虛作用的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究提供依據(jù)。

肉桂；譜效關(guān)系；灰色關(guān)聯(lián)度分析；腎陽(yáng)虛；質(zhì)量標(biāo)志物；肉桂醛；肉桂酸；鄰甲氧基肉桂醛

為了提升中藥及產(chǎn)品的質(zhì)量控制水平，劉昌孝院士提出了中藥質(zhì)量標(biāo)志物（quality marker，Q-Marker）的新概念[1]，引起廣泛的關(guān)注。中藥Q-Marker是來(lái)源于中藥材中與功效相關(guān)的特征化學(xué)物質(zhì)和物質(zhì)群，具有可測(cè)性。中藥具有多成分、多功效、多作用靶點(diǎn)的特性，單一指標(biāo)難以從整體上評(píng)價(jià)中藥質(zhì)量，因此挖掘中藥的Q-Marker成為了建立更科學(xué)、合理的中藥質(zhì)量控制方法的研究重點(diǎn)。

肉桂為廣西大宗道地藥材，其味甘、辛，性大熱，可入腎經(jīng)，性主下行，具有補(bǔ)火助陽(yáng)、引火歸元、散寒止痛、溫經(jīng)通脈的傳統(tǒng)功效，是治療上熱下寒之要藥[2]?，F(xiàn)代藥理研究顯示，肉桂具有抗氧化、降血糖、抗炎鎮(zhèn)痛等多種功效[3-5]。前期研究可知，肉桂中含有揮發(fā)油、黃酮類(lèi)、黃烷醇類(lèi)及其苷類(lèi)和多聚體類(lèi)、萜類(lèi)、木脂素類(lèi)、香豆素類(lèi)等豐富的化學(xué)成分，揮發(fā)油及其中的肉桂醛、肉桂酸、多酚類(lèi)、黃烷醇類(lèi)和萜類(lèi)成分與其有效性密切相關(guān)[6]。研究表明，肉桂混懸液可通過(guò)調(diào)節(jié)下丘腦-垂體-腎上腺（hypothalamic-pituitary- adrenal，HPA）改善大鼠的腎陽(yáng)虛證，發(fā)揮補(bǔ)腎陽(yáng)作用[7]；肉桂、桂皮水提物具有對(duì)糖皮質(zhì)激素致陽(yáng)虛小鼠模型的預(yù)防保護(hù)作用[8]。以上研究均與肉桂的補(bǔ)火助陽(yáng)傳統(tǒng)功效相關(guān)，但僅見(jiàn)肉桂改善腎陽(yáng)虛作用的藥效研究，與之相關(guān)的藥效物質(zhì)及作用機(jī)制尚未明確。

腎陽(yáng)虛證小鼠模型普遍體現(xiàn)出HPA軸功能的血清三碘甲狀腺氨酸（triiodothyronine，T3）、四碘甲狀腺氨酸（tetraiodothyronine，T4）下降，下丘腦-垂體-腎上腺-胸腺（hypothalamus-pituitary-adrenal- thymus，HPAT）軸功能的血清促腎上腺皮質(zhì)激素（adrenal cortical hormone，ACTH）下降的現(xiàn)象[9-10]。近些年來(lái)，譜效關(guān)系研究[11-12]、指紋圖譜結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)分析法[13-15]、網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選[16-17]、層次分析-熵權(quán)法[18-19]等研究手段被應(yīng)用于中藥Q-Marker研究中。為了闡明肉桂中與其改善腎陽(yáng)虛作用密切相關(guān)的化學(xué)物質(zhì)，本研究開(kāi)展多批肉桂藥材水提、甲醇提取物的改善腎陽(yáng)虛作用藥效評(píng)價(jià)，同時(shí)采用指紋圖譜結(jié)合灰色關(guān)聯(lián)度分析的譜效關(guān)系方法，初步確定肉桂中具有改善腎陽(yáng)虛作用的Q-Marker。本研究結(jié)果可為肉桂質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 材料

12批次肉桂藥材樣品均購(gòu)自廣西、廣東不同地區(qū)藥材市場(chǎng)，詳細(xì)信息見(jiàn)表1。經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)韋松基教授鑒定為樟科植物肉桂Presl的干燥樹(shù)皮。各批次藥材均留樣憑證存放于廣西中醫(yī)藥大學(xué)廣西中藥藥效研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

表1 肉桂藥材采集信息

1.2 儀器

Waters e2695型高效液相色譜儀，Waters 2998 PDA檢測(cè)器，Empower 2色譜數(shù)據(jù)工作站（美國(guó)Waters公司）；EL204萬(wàn)分之一電子分析天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；SQP十萬(wàn)分之一電子分析天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；SB25-12D超聲波清洗機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）；ELGA Classic UV型超純水儀（英國(guó)Veolia公司）；HL-1500A型萬(wàn)能粉碎機(jī)（上海塞耐機(jī)械有限公司）；H22-X3電陶爐（杭州九陽(yáng)生活電器有限公司）；TGL-16M醫(yī)用離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司）；N-1100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海愛(ài)朗儀器有限公司）；ALPHA1-A LDplus冷凍干燥機(jī)（德國(guó)Christ公司）；SPX-2508低溫生化培養(yǎng)箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司）；Infinite 200 pro全波長(zhǎng)多功能酶標(biāo)儀（瑞士TECAN公司）；移液器（10、100、200、1000 μL，DRAGONLAB公司）。

1.3 試劑

血清T3、T4、ACTH ELISA試劑盒，購(gòu)于南京建成生物公司。NaCl購(gòu)于回音必集團(tuán)江西東亞制藥有限公司；4%多聚甲醛購(gòu)于Biosharp公司；醋酸氫化可的松片（20 mg/片，批號(hào)019190901）購(gòu)于上海上藥信宜藥廠有限公司；桂附地黃丸（濃縮丸，每8丸相當(dāng)于原生藥3 g，批號(hào)201911022）購(gòu)于九芝堂股份有限公司。乙腈、甲醇均為色譜純，購(gòu)自德國(guó)Merck公司；對(duì)照品香豆素（批號(hào)DST190809-013，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）購(gòu)自成都德思特生物技術(shù)有限公司；肉桂醇（批號(hào)DL280148，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99%）、肉桂醛（批號(hào)DF100126，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%），均購(gòu)自薩恩化學(xué)技術(shù)（上海）有限公司；肉桂酸（批號(hào)C10197736，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99%）購(gòu)自上海麥克林生化科技有限公司；鄰甲氧基肉桂醛（批號(hào)S28D9G78359，質(zhì)量分?jǐn)?shù)96%）購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)昆明種小鼠，雄性，共300只，3周齡，體質(zhì)量為18～22 g，購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（湘）2019-0004。飼養(yǎng)于廣西中醫(yī)藥科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心動(dòng)物部?jī)?nèi)，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)DW20190413-028）。

2 肉桂水煎液與甲醇提取物的指紋圖譜建立

2.1 色譜條件

色譜柱：Waters XBridge C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脫：0～20 min，24% A；20～21 min，24%～27% A；21～35 min，27%～35% A；體積流量1 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)250 nm；柱溫25 ℃；進(jìn)樣量20 μL。

2.2 混合對(duì)照品溶液的制備

分別精密稱(chēng)取對(duì)照品香豆素10.74 mg、肉桂酸2.36 mg、鄰甲氧基肉桂醛5.21 mg，置于1 mL量瓶?jī)?nèi)，加甲醇溶解，并稀釋至刻度得到各對(duì)照品儲(chǔ)備液。分別量取各對(duì)照品儲(chǔ)備液0.5 mL置于5 mL量瓶?jī)?nèi)，加甲醇稀釋至刻度，得到含香豆素1.07 mg/mL、肉桂酸0.24 mg/mL、鄰甲氧基肉桂醛0.52 mg/mL的混合對(duì)照品溶液，備用。

分別精密稱(chēng)取對(duì)照品香豆素10.13 mg、肉桂醇0.50 mg、肉桂酸1.00 mg、肉桂醛50.00 mg、鄰甲氧基肉桂醛5.21 mg，置于1 mL量瓶?jī)?nèi)，加甲醇溶解，并稀釋至刻度得到各對(duì)照品儲(chǔ)備液。分別量取各對(duì)照品儲(chǔ)備液0.5 mL置于5 mL量瓶?jī)?nèi)，加甲醇稀釋至刻度，得到含香豆素1.01 mg/mL、肉桂醇0.05 mg/mL、肉桂酸0.10 mg/mL、肉桂醛5.01 mg/mL、鄰甲氧基肉桂醛0.52 mg/mL的混合對(duì)照品溶液，備用。

2.3 供試品溶液制備

2.3.1 肉桂水煎液供試品溶液的制備 取適量肉桂粉末（過(guò)3號(hào)篩），加入10倍量純水提取30 min，濾過(guò)后濾渣加入8倍量純水提取30 min再次濾過(guò)，合并2次濾液，濃縮成浸膏后使用冷凍干燥機(jī)凍干粉末。稱(chēng)取肉桂水煎液生藥量約1.0 g的干粉適量，加入甲醇25 mL，稱(chēng)定質(zhì)量，超聲處理30 min，放冷至室溫，稱(chēng)定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，經(jīng)微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得生藥量為0.04 g/mL的肉桂水煎液供試品溶液。

2.3.2 肉桂甲醇提取物供試品溶液的制備 取肉桂粉末（過(guò)3號(hào)篩）約1.0 g，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱(chēng)定質(zhì)量，超聲處理30 min，放冷至室溫，稱(chēng)定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，經(jīng)微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得生藥量為0.02 g/mL的肉桂甲醇提取物供試品溶液。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精密度試驗(yàn) 取批次為P12的肉桂水煎液粉末，以“2.3.1”項(xiàng)下方法制備肉桂水煎液供試品溶液，以“2.1”項(xiàng)下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，以肉桂酸為參照峰，計(jì)算各峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果顯示各峰相對(duì)保留時(shí)間RSD均小于0.13%，相對(duì)峰面積RSD均小于2.24%，表明該方法精密度良好。

取批次為P12的肉桂粉末，以“2.3.2”項(xiàng)下方法制備肉桂甲醇提取物供試品溶液，以“2.1”項(xiàng)下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，以肉桂酸為參照峰，計(jì)算各峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果顯示各峰相對(duì)保留時(shí)間RSD均小于0.79%，相對(duì)峰面積RSD均小于2.99%，表明該方法精密度良好。

2.4.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取批次為P12的肉桂水煎液粉末，以“2.3.1”項(xiàng)下方法制備肉桂水煎液供試品溶液，以“2.1”項(xiàng)下色譜條件分別于0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣測(cè)定，以肉桂酸為參照峰，計(jì)算各峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果顯示各峰相對(duì)保留時(shí)間RSD均小于0.12%，相對(duì)峰面積RSD均小于2.64%，表明室溫下樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

取批次為P12的肉桂粉末，以“2.3.2”項(xiàng)下方法制備肉桂甲醇提取物供試品溶液，以“2.1”項(xiàng)下色譜條件分別于0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣測(cè)定，以肉桂酸為參照峰，計(jì)算各峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果顯示各峰相對(duì)保留時(shí)間RSD均小于0.79%，相對(duì)峰面積RSD均小于2.45%，表明室溫下樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取批次為P12的肉桂水煎液粉末，以“2.3.1”項(xiàng)下方法制備6份肉桂水煎液供試品溶液，以“2.1”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣，以肉桂酸為參照峰，計(jì)算各峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果顯示各峰相對(duì)保留時(shí)間RSD均小于0.13%，相對(duì)峰面積RSD均小于3.00%，表明該方法重復(fù)性良好。

取批次為P12的肉桂粉末，以“2.3.2”項(xiàng)下方法制備6份肉桂甲醇提取物供試品溶液，以“2.1”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣，以肉桂酸為參照峰，計(jì)算各峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果各峰相對(duì)保留時(shí)間RSD均小于0.19%，相對(duì)峰面積RSD均小于2.33%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.5 指紋圖譜的建立及峰歸屬

分別精密吸取12批肉桂水煎液與甲醇提取物的供試品溶液及混合對(duì)照品溶液進(jìn)樣分析，得到HPLC指紋圖譜（圖1～4）。使用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》（2012版）對(duì)12批肉桂藥材的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，進(jìn)行譜峰匹配后，建立了供試品指紋圖譜的共有模式。以對(duì)照?qǐng)D譜為參照計(jì)算相似度，結(jié)果顯示肉桂水煎液指紋圖譜除產(chǎn)自越南肉桂藥材（P11、P12）相似度低于0.90外，其余批次相似度均大于0.95；肉桂甲醇提取物指紋圖譜相似度均大于0.93。在共有模式下，肉桂水煎液指紋圖譜標(biāo)定了共8個(gè)共有色譜峰（ST1～ST8），保留時(shí)間及峰面積RSD分別為0.05%～0.12%、45.94%～179.94%；肉桂甲醇提取物指紋圖譜標(biāo)定了共9個(gè)共有色譜峰（CT1～CT9），保留時(shí)間及峰面積RSD分別為0.31%～1.09%、35.45%～174.50%。通過(guò)與對(duì)照品比對(duì)，確定了ST3和CT5為香豆素，ST5和CT7為肉桂酸，CT8為肉桂醛，ST8和CT9為鄰甲氧基肉桂醛。

STR-對(duì)照?qǐng)D譜 ST3-香豆素 ST5-肉桂酸 ST8-鄰甲氧基肉桂醛

1-香豆素 2-肉桂酸 3-鄰甲氧基肉桂醛

CTR-對(duì)照?qǐng)D譜 CT5-香豆素 CT7-肉桂酸 CT8-肉桂醛 CT9-鄰甲氧基肉桂醛

1-香豆素 2-肉桂醇 3-肉桂酸 4-肉桂醛 5-鄰甲氧基肉桂醛

3 肉桂水煎液與甲醇提取物改善腎陽(yáng)虛作用

3.1 方法

3.1.1 藥物制備

（1）肉桂水煎液藥物的制備：取適量肉桂水煎液干粉以蒸餾水配制成生藥量為0.32 g/mL的藥液，置?20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

（2）肉桂甲醇提物藥物的制備：每克肉桂粉末加入50 mL甲醇，超聲提取30 min，濾過(guò)，利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將濾液濃縮成浸膏，濃縮成浸膏后使用冷凍干燥機(jī)凍干粉末，取適量?jī)龈煞勰┮哉麴s水配制成生藥量為0.32 g/mL的藥液，置?20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

（3）陽(yáng)性藥的制備：選擇桂附地黃丸作為陽(yáng)性藥，取桂附地黃丸研成粉末后加水使混懸，以蒸餾水配制成生藥量為0.68 g/mL藥液即得。

3.1.2 造模、分組及給藥 將150只昆明種雄性小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)后隨機(jī)分為15組，每組10只，即對(duì)照組、模型組、陽(yáng)性藥組、12批次不同產(chǎn)地肉桂水煎液組。除對(duì)照組外，其他各組小鼠按25 mg/kg ig給予醋酸氫化可的松片混懸液，建立腎陽(yáng)虛小鼠模型[20]（成功建模的動(dòng)物表現(xiàn)為豎毛、采食飲水減少、活動(dòng)減少、體質(zhì)量減輕、聚集成團(tuán)，血清T3、T4含量降低），對(duì)照組ig等量生理鹽水。從造模第15天開(kāi)始，12批次不同產(chǎn)地肉桂水煎液組每天按3.2 g/kg（以肉桂生藥計(jì)，約為人臨床給藥計(jì)量的4倍）ig給予相應(yīng)藥液，陽(yáng)性藥組每天按6.8 g/kg（約為人臨床給藥計(jì)量的5倍）ig給予相應(yīng)藥液，對(duì)照組、模型組小鼠ig給予等體積生理鹽水，連續(xù)7 d。

將150只昆明種雄性小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)后隨機(jī)分為15組，每組10只，即對(duì)照組、模型組、陽(yáng)性藥組、12批次不同產(chǎn)地肉桂甲醇提取物組。造模及給藥同上述肉桂水煎液的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。

3.1.3 血清及臟器的處理 末次給藥后，禁食不禁水12 h后小鼠眼球取血，3000 r/min離心20 min，分離血清，于?80 ℃保存?zhèn)溆?。小鼠脫頸椎處死，分離各組小鼠腎臟、睪丸，計(jì)算腎臟、睪丸臟器指數(shù)并進(jìn)行組織學(xué)觀察。

臟器指數(shù)＝臟器質(zhì)量/體質(zhì)量

3.1.4 生化指標(biāo)測(cè)定 采用酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定血清中T3、T4、ACTH的含量，嚴(yán)格按照各試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

3.2 結(jié)果與分析

3.2.1 一般行為狀態(tài)觀察 對(duì)照組小鼠表現(xiàn)為毛發(fā)順滑、有光澤，體質(zhì)量逐步增加，反應(yīng)、活動(dòng)靈敏，正常進(jìn)食飲水。除對(duì)照組外，其余各組均在ig醋酸氫化可的松第14天開(kāi)始出現(xiàn)不同程度的體質(zhì)量增加緩慢，尿量增多，活動(dòng)減少，喜扎堆現(xiàn)象。隨著給予陽(yáng)性藥、肉桂水煎液、肉桂甲醇提取物時(shí)間的增加，小鼠身體蜷縮、喜扎堆、避陽(yáng)、小便次數(shù)增加、脫發(fā)等癥狀逐漸出現(xiàn)緩解。末次給藥后與對(duì)照組相比，模型組、陽(yáng)性藥組、12批次不同產(chǎn)地水煎液組、12批次肉桂甲醇提取物組小鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)率均顯著降低（＜0.05、0.01）。與模型組相比，陽(yáng)性藥組、P06肉桂甲醇提取物組小鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)率極顯著升高（＜0.01），P01、P07肉桂水煎液組和P03肉桂甲醇提取物組小鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)率顯著升高（＜0.05）。見(jiàn)表2、3。

3.2.2 肉桂對(duì)小鼠血清T3含量的影響 如表4所示，與對(duì)照組相比，模型組小鼠血清T3含量均呈下降趨勢(shì)，表明腎陽(yáng)虛模型造模成功。與模型組相比，陽(yáng)性藥組、12批次不同產(chǎn)地肉桂水煎液和甲醇提取物均能不同程度升高腎陽(yáng)虛小鼠血清T3的含量。其中，P06～P08批次肉桂水煎液組與P01～P04、P07、P08、P10批次肉桂甲醇提取物組的小鼠血清T3含量極顯著升高（＜0.01）；P05、P06、P09批次肉桂甲醇提取物組小鼠血清T3含量顯著升高（＜0.05）。

表2 肉桂水煎液對(duì)腎陽(yáng)虛模型小鼠體質(zhì)量影響()

與對(duì)照組比較：*＜0.05**＜0.01；與模型組比較：#＜0.05##＜0.01

*< 0.05**< 0.01control group；#< 0.05##< 0.01model group

表3 肉桂甲醇提取物對(duì)腎陽(yáng)虛模型小鼠體質(zhì)量影響()

與對(duì)照組比較：*＜0.05**＜0.01；與模型組比較：#＜0.05##＜0.01

*< 0.05**< 0.01control group；#< 0.05##< 0.01model group

3.2.3 肉桂對(duì)小鼠血清T4含量的影響 如表5所示，與對(duì)照組相比，模型組小鼠血清T4含量均呈顯著下降趨勢(shì)，表明腎陽(yáng)虛模型造模成功。與模型組相比，陽(yáng)性藥組、12批次不同產(chǎn)地肉桂水煎液組、12批次不同產(chǎn)地肉桂甲醇提取物組均能不同程度升高腎陽(yáng)虛小鼠血清T4的含量。其中，P01、P04、P05批次肉桂水煎液組與P03、P05、P08、P10批次肉桂甲醇提取物組小鼠血清T4含量極顯著升高（＜0.01）；P03、P06、P07、P10、P12批次肉桂水煎液組與P01、P02、P06、P07、P09、P11、P12批次肉桂甲醇提取物組小鼠血清T4含量顯著升高（＜0.05）。

表4 肉桂提取物對(duì)腎陽(yáng)虛小鼠血清T3含量的影響()

與對(duì)照組比較：*＜0.05**＜0.01；與模型組比較：#＜0.05##＜0.01

*< 0.05**< 0.01control group；#< 0.05##< 0.01model group

表5 肉桂提取物對(duì)腎陽(yáng)虛小鼠血清T4含量的影響()

與對(duì)照組比較：*＜0.05**＜0.01；與模型組比較：#＜0.05##＜0.01

*< 0.05**< 0.01control group；#< 0.05##< 0.01model group

3.2.4 肉桂對(duì)小鼠血清ACTH含量的影響 如表6所示，與對(duì)照組相比，模型組小鼠血清ACTH含量均呈顯著下降趨勢(shì)，表明腎陽(yáng)虛模型造模成功。與模型組相比，陽(yáng)性藥組、12批次不同產(chǎn)地肉桂水煎液組、12批次不同產(chǎn)地肉桂甲醇提取物組均能不同程度升高腎陽(yáng)虛小鼠血清ACTH的含量。其中，P01、P02、P04、P05、P07～P10、P12批次肉桂甲醇提取物組小鼠血清ACTH含量極顯著升高（＜0.01）；P03、P05、P07、P08、P10批次肉桂水煎液組與P03批次肉桂甲醇提取物組小鼠血清ACTH含量顯著升高（＜0.05）。

3.2.5 肉桂對(duì)小鼠腎臟、睪丸臟器指數(shù)的影響 如表7所示，與對(duì)照組相比，模型組腎臟指數(shù)明顯下降，睪丸指數(shù)明顯升高，均具有顯著差異（＜0.05、0.01）。與模型組相比，陽(yáng)性藥組、12批次不同產(chǎn)地肉桂水煎液組、12批次不同產(chǎn)地肉桂甲醇提取物組均能不同程度影響腎陽(yáng)虛小鼠腎臟、睪丸的臟器系數(shù)。其中，P02、P05、P08、P09、P11、P12批次肉桂水煎液組與P01、P03～P05、P07、P08、P10～P12批次肉桂甲醇提取物組小鼠腎臟指數(shù)極顯著升高（＜0.01）；P01、P10批次肉桂水煎液組與P02、P06、P09批次肉桂甲醇提取物組小鼠血清腎臟指數(shù)顯著升高（＜0.05）。P07批次肉桂水煎液組與P03、P09、P10批次肉桂甲醇提取物組小鼠血清睪丸指數(shù)顯著下降（＜0.05）。

表6 肉桂提取物對(duì)腎陽(yáng)虛小鼠血清ACTH含量的影響()

與對(duì)照組比較：*＜0.05**＜0.01；與模型組比較：#＜0.05##＜0.01

*< 0.05**< 0.01control group；#< 0.05##< 0.01model group

4 譜效關(guān)系分析

4.1 主成分分析

體質(zhì)量增長(zhǎng)率，血清T3、T4、ACTH含量，腎臟指數(shù)和睪丸指數(shù)作為改善腎陽(yáng)虛證的評(píng)價(jià)指標(biāo)，存在一定的相關(guān)性，因此，可通過(guò)主成分分析進(jìn)行降維處理，重新組合為綜合指標(biāo)來(lái)代替原有的6個(gè)指標(biāo)[21]。

采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行主成分分析，分析結(jié)果表明，在肉桂水煎液組中主成分1、2、3的貢獻(xiàn)率已達(dá)到90.90%，可用主成分1、2、3作為新變量代替原有的6個(gè)變量；在肉桂甲醇提取物組中主成分1、2、3的貢獻(xiàn)率已達(dá)到82.75%，可用主成分1、2、3作為新變量代替原有的6個(gè)變量。由肉桂水和甲醇提取物的初始因子載荷矩陣分析（表8、9）可知，在肉桂水煎液組中對(duì)主成分1、2、3影響最大的分別為血清ACTH含量、睪丸指數(shù)、體質(zhì)量增長(zhǎng)率，即血清ACTH含量、睪丸指數(shù)、體質(zhì)量增長(zhǎng)率可以較大程度地反映肉桂水煎液改善腎陽(yáng)虛證的強(qiáng)弱；在肉桂甲醇提取物組中對(duì)主成分1、2、3影響最大的分別為睪丸指數(shù)、血清T3含量，即睪丸指數(shù)、血清T3含量可以較大程度地反映肉桂甲醇提取物改善腎陽(yáng)虛證的強(qiáng)弱。

表7 肉桂提取物對(duì)腎陽(yáng)虛小鼠腎臟、睪丸指數(shù)的影響()

與對(duì)照組比較：*＜0.05**＜0.01；與模型組比較：#＜0.05##＜0.01

*< 0.05**< 0.01control group；#< 0.05##< 0.01model group

表8 肉桂水煎液初始因子載荷矩陣

表9 肉桂甲醇提取物初始因子載荷矩陣

4.2 關(guān)聯(lián)度分析

以12批次肉桂水煎液組和12批次肉桂甲醇提取物組的體質(zhì)量增長(zhǎng)率，血清T3、T4、ACTH含量，腎臟指數(shù)、睪丸指數(shù)作為參考序列，以肉桂水煎液和肉桂甲醇提取物HPLC圖譜共有峰峰面積與取樣量的比值作為比較序列。采用均值法[22]處理所有序列，根據(jù)灰色關(guān)聯(lián)系數(shù)計(jì)算公式[23]分別計(jì)算每個(gè)比較序列和參考序列所對(duì)應(yīng)元素的關(guān)聯(lián)系數(shù)。關(guān)聯(lián)系數(shù)的算術(shù)平均數(shù)即為關(guān)聯(lián)度，計(jì)算結(jié)果見(jiàn)表10、11。當(dāng)關(guān)聯(lián)度大于0.6時(shí)，表明色譜峰代表的化學(xué)成分與藥理指標(biāo)有關(guān)聯(lián)性；當(dāng)關(guān)聯(lián)度大于0.8時(shí)，表明色譜峰代表的化學(xué)成分與藥理指標(biāo)有較大的關(guān)聯(lián)性；當(dāng)關(guān)聯(lián)度大于0.9時(shí)，表明色譜峰代表的化學(xué)成分與藥理指標(biāo)關(guān)聯(lián)性非常大[24]。

結(jié)果顯示，肉桂水煎液8個(gè)共有峰中除ST3外，其余色譜峰關(guān)聯(lián)度均大于0.6；肉桂甲醇提取物9個(gè)共有峰中除CT5外，其余色譜峰關(guān)聯(lián)度均大于0.6。肉桂水煎液中對(duì)腎陽(yáng)虛小鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)率貢獻(xiàn)較大的共有峰強(qiáng)弱順序?yàn)镾T2＞ST5＞ST7＞ST1＞ST8＞ST6＞ST4；對(duì)T3貢獻(xiàn)較大的共有峰強(qiáng)弱順序?yàn)镾T5＞ST2＞ST7＞ST6＞ST1＞ST8＞ST4；對(duì)T4貢獻(xiàn)較大的共有峰強(qiáng)弱順序?yàn)镾T2＞ST5＞ST7＞ST1＞ST8＞ST4＞ST6；對(duì)ACTH貢獻(xiàn)較大的共有峰強(qiáng)弱順序?yàn)镾T2＞ST5＞＞ST7＞ST8＞ST1＞ST6＞ST4；對(duì)腎臟指數(shù)影響貢獻(xiàn)較大的共有峰強(qiáng)弱順序?yàn)镾T2＞ST5＞ST7＞ST8＞ST1＞ST6＞ST4；對(duì)睪丸指數(shù)影響貢獻(xiàn)較大的共有峰強(qiáng)弱順序?yàn)镾T2＞ST5＞ST7＞ST1＞ST8＞ST6＞ST4。肉桂甲醇提取物中對(duì)腎陽(yáng)虛小鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)率貢獻(xiàn)較大的共有峰強(qiáng)弱順序?yàn)镃T8＞CT2＞CT7＞CT3＞CT1＞CT9＞CT4；對(duì)T3貢獻(xiàn)較大的共有峰強(qiáng)弱順序?yàn)镃T8＞CT2＞CT7＞CT3＞CT1＞CT9＞CT4；對(duì)T4貢獻(xiàn)較大的共有峰強(qiáng)弱順序?yàn)镃T7＞CT2＞CT8＞CT9＞CT3＞CT1＞CT4；對(duì)ACTH貢獻(xiàn)較大的共有峰強(qiáng)弱順序?yàn)镃T7＞CT8＞CT9＞CT2＞CT3＞CT1＞CT6；對(duì)腎臟指數(shù)影響貢獻(xiàn)較大的共有峰強(qiáng)弱順序?yàn)镃T8＞CT2＞CT7＞CT3＞CT9＞CT1＞CT4＞CT6；對(duì)睪丸指數(shù)影響貢獻(xiàn)較大的共有峰強(qiáng)弱順序?yàn)镃T8＞CT2＞CT7＞CT3＞CT9＞CT1＞CT4＞CT6。

表10 不同產(chǎn)地肉桂水煎液色譜峰與藥效指標(biāo)的關(guān)聯(lián)度

表11 不同產(chǎn)地肉桂甲醇提取物色譜峰與藥效指標(biāo)的關(guān)聯(lián)度

5 討論

肉桂作為藥食同源的經(jīng)典中藥，被廣泛應(yīng)用在臨床和生活中?，F(xiàn)代藥理研究表明，肉桂及其主要化學(xué)成分具有廣泛的生物活性，對(duì)泌尿系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、消化系統(tǒng)等具有藥理作用[6]。肉桂在質(zhì)量控制方面的研究還不夠充分，由于藥材原產(chǎn)地較多，導(dǎo)致市場(chǎng)上藥材質(zhì)量參差不齊，《中國(guó)藥典》2020年版中僅以肉桂醛的含量作為質(zhì)量控制的單一指標(biāo)并不能全面體現(xiàn)肉桂藥材的整體質(zhì)量。現(xiàn)代研究表明，中藥材通過(guò)多成分、多途徑、多靶點(diǎn)協(xié)同發(fā)揮傳統(tǒng)功效，為了確保肉桂藥材的安全性和臨床有效性，研究者需要以多個(gè)藥效活性成分為指標(biāo)共同評(píng)價(jià)其內(nèi)在質(zhì)量。因此，為了探究肉桂藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，本研究針對(duì)肉桂改善腎陽(yáng)虛作用，比較不同產(chǎn)地肉桂藥材藥效作用差異，結(jié)合指紋圖譜進(jìn)行譜效關(guān)系分析，篩選出肉桂中與改善腎陽(yáng)虛作用有關(guān)的可能活性成分。

通過(guò)本研究發(fā)現(xiàn)，12批次肉桂的化學(xué)指紋圖譜具有較高的相似度，但改善腎陽(yáng)虛作用差異較大，其中P01、P07、P08、P10肉桂藥材的改善腎陽(yáng)虛作用較好，P11、P12肉桂藥材的藥效較差，說(shuō)明不同產(chǎn)地肉桂對(duì)腎陽(yáng)虛小鼠具有不同的改善作用。因此，本研究通過(guò)灰色關(guān)聯(lián)度方法分析HPLC指紋圖譜與改善腎陽(yáng)虛作用的譜效相關(guān)性。結(jié)果表明，肉桂水煎液中7個(gè)共有峰所代表的成分、肉桂甲醇提取物中8個(gè)共有峰所代表的成分與改善腎陽(yáng)虛作用的相關(guān)性均大于0.6，說(shuō)明肉桂水和甲醇提取物的改善腎陽(yáng)虛作用是“化學(xué)成分群”共同作用的結(jié)果[25]。其中，肉桂水煎液中肉桂酸為關(guān)聯(lián)度較高的成分（＞0.77）；肉桂甲醇提取物中肉桂醛、肉桂酸關(guān)聯(lián)度最高（＞0.76），鄰甲氧基肉桂醛關(guān)聯(lián)度較高（＞0.70），有明顯的改善腎陽(yáng)虛作用。本研究采用肉桂藥材的傳統(tǒng)煎煮法與甲醇提取法分別制備2種肉桂提取物，通過(guò)譜效關(guān)系分析研究發(fā)現(xiàn)肉桂傳統(tǒng)水煎液與甲醇提取物中含量較大的化學(xué)成分肉桂醛、肉桂酸、鄰甲氧基肉桂醛與改善腎陽(yáng)虛作用的相關(guān)性均較強(qiáng)，因此提示《中國(guó)藥典》2020年版含量測(cè)定采用甲醇提取法可以對(duì)肉桂主要的藥效物質(zhì)進(jìn)行有效提取。本研究按照關(guān)聯(lián)度大小確定了肉桂水和甲醇提取物中各成分對(duì)改善腎陽(yáng)虛作用的貢獻(xiàn)程度，初步確認(rèn)了肉桂醛、肉桂酸、鄰甲氧基肉桂醛為肉桂的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。

本研究采用指紋圖譜結(jié)合灰色關(guān)聯(lián)度分析的譜效關(guān)系研究方法，初步確認(rèn)了肉桂改善腎陽(yáng)虛作用的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，證明Q-Marker與生物活性的密切相關(guān)，有利于篩選與藥效相關(guān)的核心Q-Marker，保證藥材質(zhì)量的可控性，研究結(jié)果為肉桂藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的完善、規(guī)范合理的應(yīng)用以及藥效物質(zhì)的進(jìn)一步闡明提供科學(xué)依據(jù)并奠定了基礎(chǔ)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Quality marker study ofon improving kidneydeficiency based on spectrum-effect relationship

HOU Xiao-tao1, 2, 3, CHEN Xiao-lu1, 2, HAO Er-wei2, 3, DU Zheng-cai2, 3, WEI Wei2, 3, LU Bing-da1, 2, REN Xin1, 2, DENG Jia-gang2, 3

1. School of Pharmacy, Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530200, China 2. Guangxi Key Laboratory of Efficacy Study on Chinese Materia Medica, Nanning 530200, China 3. Guangxi Collaborative Innovation Center of Functional Ingredients of Agricultural Residues, Nanning 530200, China

To establish a quality marker research method of Rougui () based on the spectrum-effect relationship study on its improving kidneydeficiency, so as to provide some basis for its pharmacodynamic material basis and quality control.HPLC was used to establish the fingerprints of water and methanol extract of different batches of. Kidney-deficiency mice model was established by intragastric administration of hydrocortisone, and the improving effects ofon kidney-deficiency were evaluated by body weight growth rate, T3, T4, ACTH, kidney coefficient and testis coefficient. The correlation between chromatographic peaks and pharmacodynamic indexes was constructed by grey correlation analysis to screen quality markers.Cinnamic acid in the water extract ofwas the component with high correlation (＞0.74), and cinnamaldehyde and cinnamic acid in the methanol extract had the highest correlation (＞0.80) and-methoxy cinnamaldehyde had high correlation (＞0.72). It was preliminarily confirmed that the above-mentioned three components were the effective improving kidney-deficiency substances of.The results of this study can provide evidence for the effective substance and quality markers study ofbased on its improving kidney-deficiency effect.

Presl; spectrum-effect relationship; grey correlation analysis; kidney-deficiency; quality marker; cinnamaldehyde; cinnamic acid;-methoxy cinnamaldehyde

R285

A

0253 - 2670(2021)09 - 2597 - 11

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.09.011

2020-04-02

中國(guó)-東盟傳統(tǒng)藥物研究國(guó)際合作聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室建設(shè)（二期）（桂科AD19110165）；2020年度廣西中藥藥效研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室運(yùn)行補(bǔ)助項(xiàng)目（20-065-38）；農(nóng)作物廢棄物功能成分研究協(xié)同創(chuàng)新中心（CICAR 2020）；廣西中醫(yī)藥大學(xué) 2019 年自治區(qū)級(jí)碩士研究生科研創(chuàng)新項(xiàng)目（YCSW2019170）；廣西中醫(yī)藥大學(xué)2020年校級(jí)一般碩士研究生科研創(chuàng)新項(xiàng)目（YCSY2020026）；廣西中醫(yī)藥大學(xué)?一方制藥大學(xué)生科技創(chuàng)新課題項(xiàng)目（DXS2019058）

侯小濤（1969—），女，廣西荔浦人，博士，教授，研究方向?yàn)橹兴幓钚猿煞峙c質(zhì)量控制。Tel: 13878858205 E-mail: xthou@126.com

鄧家剛，博士生導(dǎo)師，廣西終身教授，主要從事中藥基礎(chǔ)理論與藥效篩選研究。E-mail: dengjg53@126.com

[責(zé)任編輯 潘明佳]