角膜緣保護技術(shù)在經(jīng)上皮角膜交聯(lián)術(shù)中的應(yīng)用效果

王萌萌，王晶晶，劉延?xùn)|，李明然，尹會蘇，張印博，董興國

0引言

角膜交聯(lián)(corneal collagen cross-linking，CXL)是一類提高角膜生物力學(xué)強度和對抗生物降解能力的新型技術(shù)，目前專指已經(jīng)在眼科臨床上應(yīng)用的紫外光-核黃素(riboflavin)角膜交聯(lián)手術(shù)技術(shù)。CXL采用370nm的紫外光A照射被核黃素浸潤的角膜，可以使角膜纖維之間發(fā)生共價鍵結(jié)合，提高了膠原纖維的生物力學(xué)強度和生物學(xué)穩(wěn)定性，主要用于治療圓錐角膜、大泡性角膜病變、角膜炎等疾病[1]。大量研究已經(jīng)表明，CXL能夠有效阻止圓錐角膜的進展，是目前圓錐角膜綜合治療措施中的重要組成部分。CXL的主流術(shù)式有兩種，即經(jīng)典的去上皮角膜交聯(lián)(epithelium-off CXL，Epi-off CXL)和經(jīng)上皮角膜交聯(lián)(epithelium-on CXL，Epi-on CXL)。Epi-off CXL又被稱為Dresden方案，是最早提出的經(jīng)典角膜交聯(lián)方案，由于角膜上皮層的細胞間緊密連接阻礙了光敏劑核黃素滲透進入角膜基質(zhì)層，需要術(shù)中人為去除角膜上皮層，因此不可避免地帶來了術(shù)后疼痛和角膜上皮愈合問題；Epi-on CXL又被稱為跨上皮角膜交聯(lián)(transepithelial corneal collagen cross-linking，TECXL)，是采用化學(xué)和電滲等方法促進核黃素進入角膜基質(zhì)層，由于術(shù)中不用去除角膜上皮，所以術(shù)后不適感較輕，視力恢復(fù)也較快。其中化學(xué)法是在核黃素溶液中加入苯扎氯銨或乙二胺四乙酸(EDTA)等化學(xué)促滲劑。這些化學(xué)促滲劑能夠引起角膜上皮細胞間的緊密連接發(fā)生斷裂，導(dǎo)致角膜上皮疏松，便于核黃素的滲透。與電滲法相比，化學(xué)法不需要特殊儀器，所以在國內(nèi)外應(yīng)用較多[2]。

盡管CXL對圓錐角膜具有明顯的防治作用，但是該手術(shù)的安全風險依然不能被忽視，尤其是紫外光A[3]和化學(xué)促滲劑[4]都具有一定的組織毒性，CXL本身也會引起治療部位組織細胞的死亡[5]。基礎(chǔ)研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)CXL手術(shù)可造成角膜緣干細胞的損傷，并建議在術(shù)中對角膜緣進行必要的保護[6]，然而目前國內(nèi)外尚未見有關(guān)角膜緣保護的臨床研究報道。我院自2015年開展CXL手術(shù)以來，一直重視術(shù)中對角膜緣的保護。本研究將對治療圓錐角膜的Epi-on CXL術(shù)中使用的一種角膜緣保護技術(shù)的臨床應(yīng)用效果進行評估。

1對象和方法

1.1對象本研究為前瞻性臨床研究。選取2019-01/12河北省眼科醫(yī)院收治擬行Epi-on CXL手術(shù)的雙眼進展期圓錐角膜患者15例30眼，其中男8例，女7例，平均年齡20.2±1.8歲。右眼15眼納入試驗組，Epi-on CXL術(shù)中采用角膜緣保護技術(shù)；左眼15眼納入對照組，Epi-on CXL術(shù)中不采用角膜緣保護技術(shù)。納入標準：(1)年齡大于18周歲；(2)明確診斷為雙眼進展期圓錐角膜；(3)中央角膜厚度大于400μm；(4)雙眼行Epi-on CXL手術(shù)。排除標準：(1)伴有其它眼部合并癥；(2)患有全身系統(tǒng)性疾?。?3)有眼部感染史；(4)有眼部手術(shù)史；(5)有眼部外傷史；(6)有軟性或硬性角膜接觸鏡配戴史。本研究經(jīng)過河北省眼科醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會的許可實施，手術(shù)前每位患者及其家屬均充分理解該研究的意義和手術(shù)風險，并自愿簽署科研和手術(shù)知情同意書。

1.2方法

1.2.1手術(shù)方法所有患者術(shù)前3d均采用5g/L左氧氟沙星滴眼液點眼，每天4次。Epi-on CXL手術(shù)均由同一名手術(shù)醫(yī)師(第一作者)采用KXL紫外光交聯(lián)系統(tǒng)完成。眼部消毒、鋪巾、開瞼，表面麻醉。試驗組首先在角膜緣和球結(jié)膜表面注射薄薄的一層醫(yī)用透明質(zhì)酸鈉凝膠，在角膜表面居中放置已滅菌的自制不銹鋼金屬環(huán)(內(nèi)徑9.0mm，外徑13.0mm，厚2.0mm)，用蘸有生理鹽水的海綿將金屬環(huán)中央孔內(nèi)露出的角膜表面擦拭干凈后滴加0.25%核黃素透上皮配方溶液(含乙二胺四乙酸、堿式氯化鋁等化學(xué)促滲劑)至覆蓋住裸露的角膜表面，注意不要讓核黃素溶液從角膜和金屬環(huán)表面流下來(圖1)。浸泡角膜240s后生理鹽水沖洗并蘸干角膜，滴加0.25%核黃素鹽溶液(不含化學(xué)促滲劑)浸泡360s，再次生理鹽水沖洗并蘸干角膜。采用370±5nm紫外光A照射角膜表面160s，光斑直徑9mm，照度45mW/cm2，能量密度7.2J/cm2，照射過程中適時滴加生理鹽水以保持角膜表面濕潤。試驗組角膜表面的金屬環(huán)自手術(shù)開始時放置，直至紫外光照射結(jié)束取下。對照組不放置金屬環(huán)，直接在角膜表面滴加0.25%核黃素透上皮配方溶液使之覆蓋住全部角膜表面，將流淌進入結(jié)膜囊內(nèi)多余的0.25%核黃素透上皮配方溶液用棉簽擦除，其余用藥和紫外光照射步驟同試驗組。兩組術(shù)后均采用5g/L左氧氟沙星滴眼液點眼，4次/天，共14d；1g/L玻璃酸鈉滴眼液點眼，4次/天，共14d；1g/L氟米龍滴眼液點眼，4次/天，共7d，每周遞減1次，持續(xù)4wk。

圖1 在Epi-on CXL手術(shù)中采用的角膜緣保護技術(shù) 術(shù)中治療區(qū)域外的眼球表面涂抹醫(yī)用透明質(zhì)酸鈉凝膠，并在角膜上放置自制的不銹鋼金屬環(huán)，該技術(shù)能夠防止含有化學(xué)促滲劑的核黃素溶液滲漏到非治療區(qū)域的角結(jié)膜表面，并能遮擋角膜緣以避免紫外光的輻射損傷。

1.2.2隨訪觀察隨訪并記錄術(shù)前、術(shù)后7d，3mo時兩組最佳矯正遠視力、散光度、角膜曲率Sim-K平均值(Km) 、角膜最薄點厚度、淚膜破裂時間，其中Km、角膜最薄點厚度、淚膜破裂時間均采用Sirius眼前節(jié)分析系統(tǒng)檢測獲得。術(shù)后7d時，采用患者主觀評分法評估術(shù)后不適感，總分0～9分，0分為無不適，9分為非常痛苦。隨訪期間，觀察并記錄兩組角膜上皮愈合時間。

統(tǒng)計學(xué)分析：采用IBM SPSS Statistics 23統(tǒng)計軟件包進行數(shù)據(jù)分析。計量資料的統(tǒng)計描述采用均數(shù)±標準差表示，采用重復(fù)測量設(shè)計的廣義估計方程比較手術(shù)前后兩組最佳矯正遠視力、散光度、Km、角膜最薄點厚度、淚膜破裂時間的差異；采用配對樣本t檢驗比較兩組術(shù)后不適感和術(shù)后角膜上皮愈合時間的差異。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

手術(shù)前后不同時間點兩組最佳矯正遠視力、散光度、角膜最薄點厚度、淚膜破裂時間比較，均具有時間差異性(χ2=17.010、6.500、829.489、52.230，P<0.001、=0.039、<0.001、<0.001)。其中，術(shù)后3mo時的最佳矯正遠視力優(yōu)于術(shù)前和術(shù)后7d，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；術(shù)后3mo時的散光度小于術(shù)前，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.043)；與術(shù)前相比，術(shù)后7d，3mo時角膜最薄點厚度差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)；與術(shù)前相比，術(shù)后7d時淚膜破裂時間變短，隨后盡管有所恢復(fù)，但依然小于術(shù)前，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)，見表1、2。兩組手術(shù)前后不同時間點Km無時間差異性(χ2=0.437，P=0.804)。此外，手術(shù)前后不同時間點兩組最佳矯正遠視力、散光度、Km、角膜最薄點厚度、淚膜破裂時間比較，均無組間差異性(χ2=0.515、0.112、1.227、0.041、0.416，P=0.473、0.738、0.268、0.839、0.519)，時間與組間也無交互作用(χ2=2.134、0.277、2.687、3.973、0.572，P=0.344、0.870、0.261、0.137、0.751)。

表1 手術(shù)前后各觀察指標檢測結(jié)果

表2 廣義估計方程中各觀察指標時間差異分析結(jié)果

試驗組和對照組術(shù)后不適感評分分別為3.13±0.99、3.33±1.23分，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=0.764，P=0.458)。試驗組術(shù)后角膜上皮愈合時間(3.20±0.56d)比對照組(3.73±0.96d)短，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=2.256，P=0.041)。

3討論

角膜緣是保障角膜上皮細胞動態(tài)平衡的重要部位，對維持角膜透明性和眼表完整性起到了重要作用[7]。其中，角膜緣Vogt柵欄結(jié)構(gòu)區(qū)被認為是角膜緣干細胞之所在。各種原因?qū)е碌慕悄ぞ壐杉毎軗p和缺乏會引起角膜和眼表功能障礙[8]。盡管大量臨床研究已經(jīng)證實CXL手術(shù)在防治圓錐角膜方面的有效性和安全性[9]，但是依然不能忽視CXL手術(shù)可能引起的角膜緣損傷。基礎(chǔ)研究發(fā)現(xiàn)，CXL具有細胞毒性作用，不僅能夠降低角膜緣部位上皮細胞的擴增能力[10]，而且會引起細胞凋亡[11]。臨床研究也有關(guān)于CXL術(shù)后發(fā)生角膜緣干細胞失代償[12]、角膜上皮延遲愈合[13]、誘發(fā)眼表腫瘤[14-15]等個別病例的報道，提示CXL術(shù)中保護角膜緣的重要性。

與以往研究[1-2]結(jié)果相似，本研究中，無論是否采用角膜緣保護技術(shù)，患者術(shù)后3mo時最佳矯正遠視力、散光度均優(yōu)于術(shù)前(P<0.05)；兩組術(shù)后角膜最薄點厚度均逐漸減小(P<0.05)；兩種Epi-on CXL手術(shù)均造成術(shù)后短期(7d)淚膜破裂時間縮短，盡管在術(shù)后中期(3mo)時有所恢復(fù)，但依然低于術(shù)前水平(P<0.05)。本研究試驗組所采用角膜緣保護技術(shù)未對Epi-on CXL手術(shù)患者的最佳矯正遠視力、散光度、Km、角膜最薄點厚度、淚膜破裂時間、術(shù)后不適感方面造成顯著影響，說明此種角膜緣保護技術(shù)并不能提升Epi-on CXL手術(shù)治療圓錐角膜的臨床療效。然而，本研究結(jié)果顯示此種角膜緣保護技術(shù)能夠縮短術(shù)后角膜上皮愈合時間，提示該技術(shù)可能在降低Epi-on CXL手術(shù)源性損傷、保護角膜緣組織、維護角膜上皮修復(fù)能力方面具有重要的保護作用，并能夠提高Epi-on CXL手術(shù)的安全性。

目前國外研究者已經(jīng)開發(fā)和報道了幾種CXL術(shù)中角膜緣保護技術(shù)。相比而言，本研究所采用的角膜緣保護技術(shù)具有操作簡單、效果確切、成本低廉、器材可重復(fù)使用等諸多優(yōu)點。Lee等[16]通過動物實驗驗證CXL術(shù)中采用一種直徑為9mm的金屬擋圈(retention ring)限制核黃素溶液擴散到角膜緣，從而使角膜緣干細胞免于受到CXL的損傷。需要強調(diào)的是，上述動物實驗研究中使用的金屬擋圈需要術(shù)者手持并施壓于眼球，其保護角膜緣的原理只是阻止核黃素溶液對角膜緣浸潤，并沒有在術(shù)中對紫外光進行遮擋，因此無法避免術(shù)中紫外光輻射性損傷；使用金屬擋圈的動物眼角膜發(fā)生了較為嚴重的炎癥反應(yīng)，作者推測可能與核黃素潴留引起過度的交聯(lián)反應(yīng)有關(guān)，也可能是由于金屬擋圈對角膜的壓迫引起的。本研究使用的自制不銹鋼金屬環(huán)無需手持，其與角膜表面的貼敷是依靠金屬環(huán)的自身重量和眼球表面醫(yī)用透明質(zhì)酸鈉凝膠的黏附作用。術(shù)中該金屬環(huán)能夠阻止核黃素溶液滲漏到角膜緣和結(jié)膜囊；由于該金屬環(huán)具有一定的寬度，所以能夠托起足夠的核黃素溶液覆蓋住裸露的角膜表面；該金屬環(huán)的寬度能夠遮擋角膜緣，從而保護角膜緣免受紫外線的直接照射。本研究未發(fā)現(xiàn)試驗組出現(xiàn)Lee等[16]在其動物實驗中發(fā)生的比對照組更為嚴重的炎癥反應(yīng)，我們推測由于本研究所使用的金屬環(huán)不需要手持和施壓，因而可能對眼部的刺激性較小。

Jeyalatha等[17]在離體人眼實驗中使用了一種聚甲基丙烯酸甲酯制成的透明遮擋環(huán)，發(fā)現(xiàn)該遮擋環(huán)能夠保護角膜緣干細胞免受CXL術(shù)中紫外線的輻射損傷。Bilgihan等[18]采用角膜接觸鏡中央打孔的方法制作了一種簡易的角膜緣遮擋環(huán)，并使用激光照度計檢測證實了該中央打孔的角膜接觸鏡能夠有效阻斷紫外線的穿透，但是沒有在其研究中提及該方法的臨床應(yīng)用效果。與以上兩種術(shù)中角膜緣保護技術(shù)相比，本研究使用的保護技術(shù)具有以下可能的優(yōu)勢：本研究使用的金屬環(huán)不僅遮光更徹底，而且具有一定的重量，能夠穩(wěn)定地放置在角膜上，不容易受到眼球不自主運動的影響而發(fā)生移動；除了金屬環(huán)自身重量的作用之外，醫(yī)用透明質(zhì)酸鈉凝膠能夠更好地封閉金屬環(huán)與角膜之間的間隙，有效防止核黃素溶液滲漏到角膜緣，進而可以避免核黃素溶液中化學(xué)促滲劑對角膜緣的毒性損傷，因此尤其適合在Epi-on CXL手術(shù)中使用。此外，已有研究證實透明質(zhì)酸鈉本身也能夠降低化學(xué)滲透劑EDTA對人角膜上皮細胞造成的氧化損傷[19]。因此，本研究中使用的角膜緣保護技術(shù)比以往研究中提及的金屬擋圈技術(shù)、聚甲基丙烯酸甲酯環(huán)技術(shù)和中央打孔的角膜接觸鏡技術(shù)等更具臨床推廣價值。

本研究的主要不足之處在于病例數(shù)較少、隨訪時間較短，因此除了術(shù)后角膜上皮愈合時間外，未發(fā)現(xiàn)試驗組和對照組更多的差異。然而，由于CXL手術(shù)是一項較為安全的手術(shù)技術(shù)，其本身發(fā)生角膜緣干細胞損傷相關(guān)的臨床病例較少，所以術(shù)中角膜緣保護技術(shù)的重要作用可能很難在臨床研究中顯現(xiàn)出來。此外，本研究僅對該角膜緣保護技術(shù)的臨床療效進行了分析，未開展在角膜緣細胞活性、細胞形態(tài)、核黃素浸染程度等方面的基礎(chǔ)性研究來加以佐證。今后我們將繼續(xù)深入研究，不僅努力收集和納入更多的病例、延長隨訪時間，并且對以上幾種術(shù)中角膜緣保護技術(shù)進行深入比較，以期望為廣大手術(shù)醫(yī)師提供更多的臨床應(yīng)用參考。

總之，本研究中所采用的術(shù)中角膜緣保護技術(shù)能夠縮短Epi-on CXL術(shù)后角膜上皮愈合時間，初步證實了該術(shù)中角膜緣保護技術(shù)在Epi-on CXL手術(shù)中應(yīng)用的可行性和安全性，其長期的臨床應(yīng)用價值有待今后進一步研究加以驗證。