基于非靶向代謝組學(xué)評(píng)價(jià)傳統(tǒng)發(fā)酵對(duì)客家酸芥菜酚類化合物組成的影響

唐富豪，滕建文，韋保耀，黃麗，夏寧，覃超

(廣西大學(xué) 輕工與食品工程學(xué)院，廣西 南寧，530004)

酚類物質(zhì)是植物中普遍存在的次生代謝產(chǎn)物，包括多酚、黃酮、酚酸等，絕大多數(shù)具有鎮(zhèn)痛、抗自由基和抗腫瘤等多種生物學(xué)活性和藥理作用[1]。芥菜屬于十字花科、蕓薹屬，目前國(guó)內(nèi)外研究表明芥菜及其發(fā)酵制品含有多種多酚物質(zhì)[2]。NICCIO等[3]在南美芥菜中檢出了7種酚類物質(zhì)，包括4種酚酸(4-羥基苯甲酸、對(duì)香豆酸、阿魏酸和芥子酸)和3種黃酮類物質(zhì)(柚皮苷、芹菜素、山奈酚)；HARBAUM等[4]對(duì)新鮮芥菜中的酚酸進(jìn)行含量鑒定，發(fā)現(xiàn)芥子酸含量最高，沒食子酸含量最少；LI等[5]對(duì)瘤莖芥菜進(jìn)行靶向代謝組學(xué)分析，結(jié)果表明酚類物質(zhì)含有黃酮醇、羥基肉桂酰衍生物、黃烷酮和黃酮。盡管如此，已報(bào)道的芥菜酚類物質(zhì)占比仍不足其總酚含量的30%[6]，芥菜的酚類組成仍未探明，這影響著芥菜的物質(zhì)分析和功能評(píng)價(jià)。

發(fā)酵蔬菜是世界傳統(tǒng)食品，根據(jù)加工過程中是否留鹵分為留鹵腌漬和倒置腌漬，后者除浙江倒篤菜外[7]，兩廣客家酸芥菜(地方俗稱“客家擦菜”)是其中的典型代表?，F(xiàn)有研究已證實(shí)，發(fā)酵過程對(duì)蔬菜中酚類物質(zhì)組成產(chǎn)生了顯著影響，進(jìn)而影響其營(yíng)養(yǎng)吸收率及生物活性。經(jīng)過適當(dāng)?shù)陌l(fā)酵，芥菜中的酚類物質(zhì)含量有所提高，如咖啡酸的含量在發(fā)酵過程中顯著增加[8]。盡管目前從蔬菜總酚、總黃酮等含量上已明確發(fā)酵的作用，但由于芥菜酚類物質(zhì)具有多樣性，發(fā)酵過程如何引起各酚類物質(zhì)變化，進(jìn)而影響其生理活性，仍少有報(bào)道。

本項(xiàng)研究針對(duì)新鮮芥菜和客家擦菜，利用非靶向代謝組學(xué)方法，應(yīng)用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)，檢測(cè)酚類物質(zhì)組成，并分析其差異性變化，揭示其多酚、酚酸及黃酮物質(zhì)組成，為蔬菜發(fā)酵過程中化學(xué)物質(zhì)表征和功能成分研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

新鮮芥菜采集于廣西陸川古城鎮(zhèn)?？图也敛巳∽詮V西陸川泓源食品有限公司，其基本加工工藝為：新鮮芥菜清洗后曬制脫水，切段(1～2 cm)后裝入瓦罐中壓實(shí)并倒置發(fā)酵(7～10 d)；將菜取出并加2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))食鹽拌勻，裝回瓦罐中壓實(shí)，倒置進(jìn)行二段發(fā)酵1個(gè)月以上。取新鮮芥菜和發(fā)酵成品各12個(gè)樣品，分別混勻后取3個(gè)平行，收集密封后低溫下運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，于-80 ℃保存。

1.2 樣品制備及測(cè)定

1.2.1 樣品提取

樣本于液氮中研磨，取100 mg加入500 μL含0.1%甲酸的80%甲醇水溶液，渦旋振蕩后，冰浴靜置5 min。于15 000 r/min、4 ℃下離心10 min，取一定量的上清液加質(zhì)譜級(jí)水稀釋至甲醇體積分?jǐn)?shù)為53%，并于4 ℃，15 000 r/min離心10 min，收集上清液，用于LC-MS分析。質(zhì)控樣本由2組不同的樣本提取物等量混合制備而成，空白樣本為含0.1%甲酸的53%甲醇水溶液。該部分委托北京諾禾致源科技股份有限公司完成。

1.2.2 LC-MS/MS分析

利用超高效液相色譜和串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行物質(zhì)鑒定[9-10]。液相分析條件：(1)色譜柱：Thermo Hyperil Gold column C18(2.1 nm×100 nm，1.9 μm)；(2)流動(dòng)相：正離子模式水相為超純水(0.1%甲酸)，有機(jī)相為甲醇；負(fù)離子模式水相為超純水(5 mmol/L 醋酸銨、pH 9.0)，有機(jī)相為甲醇；(3)洗脫梯度：0～1.5 min為V(水)∶V(甲醇)=98∶2，12.0～14.0 min為0∶100，14.1～17.0 min為98∶2；(4)流速為0.2 mL/min；柱溫40 ℃。質(zhì)譜條件為：質(zhì)譜電壓3 200 V，鞘氣流速35 arb，輔助氣流速10 arb，離子傳輸管溫度320 ℃，二級(jí)掃描為數(shù)據(jù)依賴性掃描。該部分委托北京諾禾致源科技股份有限公司完成。

1.2.3 定性定量分析

將色譜數(shù)據(jù)文件導(dǎo)入Compound Discoverer 3.1搜庫(kù)軟件中，用空白樣本去除背景離子，依據(jù)保留時(shí)間、質(zhì)荷比等參數(shù)進(jìn)行簡(jiǎn)單篩選。根據(jù)保留時(shí)間偏差0.2 min和質(zhì)量偏差5×10-6進(jìn)行峰對(duì)齊。設(shè)置信號(hào)強(qiáng)度偏差30%、信噪比3、最小信號(hào)強(qiáng)度100 000、加和離子等信息進(jìn)行峰提取，同時(shí)對(duì)峰面積進(jìn)行定量，再整合目標(biāo)離子，通過分子離子峰和碎片離子進(jìn)行分子式的預(yù)測(cè)并與mzCloud、mzVault、MassList數(shù)據(jù)庫(kù)和諾禾致源公司的自建數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用多元統(tǒng)計(jì)分析，對(duì)2組樣本進(jìn)行主成分分析(principal component analysis，PCA)、聚類分析和相關(guān)性分析，根據(jù)偏最小二乘法判別分析(partial least squares discrimination analysis，PLS-DA)預(yù)測(cè)模型的穩(wěn)定可靠性。設(shè)置閾值為：變量影響投影(variable influence on projection，VIP)>1.0，差異倍數(shù)(fold change，F(xiàn)C)>1.5或 FC < 0.667 且P<0.05篩選差異酚類物質(zhì)。對(duì)差異酚類物質(zhì)進(jìn)行聚類分析，并上傳至KEGG網(wǎng)站，進(jìn)行代謝通路分析。采用Excel對(duì)下機(jī)數(shù)據(jù)進(jìn)行初步分析后，利用Origin 2019軟件繪制PCA圖，SPSS 23進(jìn)行顯著性分析，云平臺(tái)繪制熱圖及高級(jí)氣泡圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 芥菜及客家擦菜中酚類物質(zhì)的非靶代謝組學(xué)分析

針對(duì)新鮮芥菜和客家擦菜，結(jié)合總離子流色譜圖，2種材料在正、負(fù)離子模式下均分別檢出84、53種酚類物質(zhì)，共136種(芥子酸在2種模式下均有檢出)。其中，119種物質(zhì)在芥菜及其發(fā)酵產(chǎn)品中首次檢出，另外8種酚酸和9種黃酮類物質(zhì)在芥菜研究中已有報(bào)道。具體信息見表1。

KHANAM等[11]用HPLC-二極管陣列檢測(cè)器測(cè)定日本芥菜中的酚類物質(zhì)，主要為芥子酸、金絲桃苷、水楊酸、對(duì)香豆酸和香蘭素酸。高媛等[12]在多個(gè)品種的新鮮蔬菜及制品中發(fā)現(xiàn)阿魏酸、異阿魏酸和對(duì)香豆酸3種酚酸的含量最高。已有研究表明，芥菜中的主要黃酮類物質(zhì)為黃酮醇、羥基肉桂酰衍生物、黃烷酮和黃酮。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本包括前人對(duì)于芥菜等綠葉蕓薹屬作物及其發(fā)酵制品的靶向研究結(jié)果[4,11]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果包含已報(bào)道的酚類物質(zhì)類別，并檢測(cè)出更多的多酚物質(zhì)，且首次在芥菜及發(fā)酵芥菜中定性檢出大豆苷元及雌馬酚等。

表1 新鮮芥菜與客家擦菜中鑒定出的酚類物質(zhì)統(tǒng)計(jì) 單位：種

2.2 新鮮芥菜和客家擦菜中酚類物質(zhì)差異性分析

2.2.1 PCA結(jié)果

圖1為新鮮芥菜和客家擦菜2組樣品的PCA圖。其中PC1的貢獻(xiàn)率為68.5%，PC2的貢獻(xiàn)率為26.3%，兩者累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)到94.8%。2個(gè)主成分反映的主要指標(biāo)有芥子酸、山奈酚、對(duì)羥基肉桂酸、阿魏酸、異阿魏酸、2-羥基肉桂酸和水楊酸等，表明酚酸物質(zhì)是新鮮芥菜和客家擦菜的主體特征組分，也是與發(fā)酵處理相關(guān)性系數(shù)最高的成分。與PARK等[13]對(duì)發(fā)酵芥菜中酚類物質(zhì)組成變化的結(jié)論一致。2種樣品分別在PC1、PC2表現(xiàn)出組內(nèi)聚集趨勢(shì)，且在PC1中表現(xiàn)出組間分離趨勢(shì)，整體上表明新鮮芥菜經(jīng)發(fā)酵后，酚類物質(zhì)的組成發(fā)生顯著改變。

A-新鮮芥菜；B-客家擦菜圖1 酚類物質(zhì)的PCA結(jié)果Fig.1 PCA results of phenolic compounds

2.2.2 酚類物質(zhì)差異性鑒定

PCA可以有效提取主要信息，但對(duì)于相關(guān)性較小的變量不敏感。而PLS-DA可使組間區(qū)分最大化，利于準(zhǔn)確篩選差異代謝物。如表2所示，綜合VIP值、FC值和P值判定發(fā)酵前后差異性酚類物質(zhì)。結(jié)果表明，有29種酚類物質(zhì)的含量經(jīng)發(fā)酵后發(fā)生顯著變化，占2種材料中所有酚類物質(zhì)的21.48%，包括14種酚酸物質(zhì)、8種黃酮類物質(zhì)、3種異黃酮物質(zhì)、2種黃酮醇物質(zhì)，1種查爾酮和1種花青素。發(fā)酵后，含量差異倍數(shù)最大的為槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷(FC為1 543)，其次為水楊酸和對(duì)羥基肉桂酸等。

PARK等[14]評(píng)估了芥菜中酚類物質(zhì)在不同發(fā)酵時(shí)期的變化，發(fā)現(xiàn)咖啡酸的含量在發(fā)酵前期波動(dòng)，2個(gè)月后顯著下降，綠原酸的含量持續(xù)降低，且成品中含量相比原料為顯著下降。此外，LE等[15]報(bào)道了乳桿菌屬產(chǎn)生的酯酶可將生咖啡中綠原酸轉(zhuǎn)化為咖啡酸；發(fā)酵小麥的阿魏酸含量顯著高于未發(fā)酵小麥[16]；使用植物乳桿菌發(fā)酵平菇使阿魏酸的含量顯著增加[17]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)非糖苷鍵鍵合類黃酮如芹菜素、槲皮素、柚皮素、山奈酚、橙皮素、楊梅素、川陳皮素等物質(zhì)的含量在發(fā)酵后升高；糖苷鍵鍵合類黃酮例如山奈酚-3-O-雙糖苷、芹苷-7-葡萄糖苷、蘆丁、三葉豆苷、槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷、楊梅素-3-O-半乳糖苷、木犀草素-7-葡萄糖醛酸苷等物質(zhì)的含量在發(fā)酵后降低。參考現(xiàn)有關(guān)于芥菜及發(fā)酵芥菜研究，顯著變化的酚類物質(zhì)種類基本一致，但考慮到客家擦菜在發(fā)酵過程中始終有物質(zhì)隨水分流出，因此未表現(xiàn)出顯著變化的物質(zhì)需進(jìn)一步絕對(duì)定量確認(rèn)。

表2 客家擦菜和新鮮芥菜中顯著性差異的酚類物質(zhì)Table 2 Significantly different phenolic compounds between fresh Brassica juncea and Hakka sour mustard

2.3 差異酚類物質(zhì)富集通路分析

通過KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)所有顯著差異的酚類物質(zhì)進(jìn)行通路富集分析，得到7條代謝通路(圖2)，分別為(1)苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸的生物合成通路，包括原兒茶酸等；(2)次生代謝產(chǎn)物的合成通路，包括槲皮素、原兒茶酸、水楊酸、異甘草素等；(3)植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，包括反式玉米素、水楊酸；(4)酪氨酸代謝通路，包括2,5-二羥基苯甲酸；(5)代謝途徑，包括2,5-二羥基苯甲酸、槲皮素、原兒茶酸等；(6)黃酮和黃酮醇的合成通路，包括丁香亭、蘆丁、槲皮素、三葉豆苷、山奈酚、楊梅素等；(7)芪類、二苯基庚酮和姜酚生物合成，包括姜黃素。且由圖2可知次級(jí)代謝產(chǎn)物合成途徑通路的富集程度最高，苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸生物合成通路的富集最為顯著。

現(xiàn)有研究表明，植物多酚的前體物質(zhì)來源于糖代謝的中間產(chǎn)物，經(jīng)莽草酸途徑、苯丙烷代謝途徑和類黃酮代謝途徑合成。其中沒食子酸是由莽草酸途徑中間產(chǎn)物3-羥基莽草酸在相關(guān)酶作用下合成，其余大多數(shù)酚酸類物質(zhì)都是通過苯丙烷代謝途徑合成。而莽草酸代謝途徑生成的4-羥基查爾酮?jiǎng)t是類黃酮代謝途徑的前體物質(zhì)[18]。苯丙烷代謝途徑是植物中合成木質(zhì)素及類黃酮物質(zhì)的重要次生代謝途徑之一，而莽草酸途徑在植物次生代謝途徑中起到了中心作用，為其他次生代謝途徑提供底物。本研究中未富集到莽草酸途徑、苯丙烷代謝途徑，可能是核心物質(zhì)莽草酸作為非酚酸物質(zhì)未被鑒定分析，苯丙氨酸及對(duì)香豆酸的含量未發(fā)生顯著性變化。由于尚無對(duì)新鮮芥菜及發(fā)酵蔬菜中酚類物質(zhì)的代謝通路富集，故本次富集到的7條通路可為發(fā)酵對(duì)酚類物質(zhì)的影響提供參考。

圖2 新鮮芥菜與客家擦菜中顯著性差異酚類物質(zhì)的 KEGG富集圖Fig.2 KEGG enrichment map found in significantly different phenolic compounds between fresh Brassica juncea and Hakka sour mustard注：點(diǎn)的顏色代表P值，越紅表示富集越顯著；點(diǎn)的大小代表 富集到的差異代謝物的數(shù)量

3 討論

3.1 針對(duì)本實(shí)驗(yàn)未檢到和非顯著差異酚酸物質(zhì)的討論

本研究在新鮮芥菜和客家擦菜中檢測(cè)到的42種酚酸多為苯甲酸和肉桂酸的羥化衍生物。MOCO等[19]研究發(fā)現(xiàn)盡管不同品種蔬菜的多酚物質(zhì)有所不同，但這些代謝產(chǎn)物的整體分類相同。綠原酸作為咖啡酸與奎尼酸組成的縮酚酸，在植物有氧呼吸過程中可由肉桂酰酯酶經(jīng)莽草酸途徑轉(zhuǎn)化肉桂酸和奎寧酸形成?？Х人岬纳锖铣芍饕ňG原酸的水解和對(duì)香豆酸的轉(zhuǎn)化。已有研究發(fā)現(xiàn)芥菜的發(fā)酵降低了綠原酸的含量，但造成咖啡酸含量的增加，將這些變化歸因于發(fā)酵的乳酸菌產(chǎn)酯酶活性[13]。而在本研究中，部分羥基肉桂酸類酚酸，咖啡酸、沒食子酸、異綠原酸及阿魏酸未發(fā)生顯著變化。此前，在橄欖發(fā)酵過程中，已證實(shí)酚類物質(zhì)損失主要是由于向鹽水中的擴(kuò)散[20]。經(jīng)過比對(duì)甲醇和水2種提取溶劑的提取結(jié)果，發(fā)現(xiàn)甲醇的提取效果更佳，但不乏個(gè)別酚類物質(zhì)僅在水相中被檢測(cè)到的現(xiàn)象[14]。并且有一些水溶性酚類物質(zhì)在發(fā)酵過程中隨水分持續(xù)流出，因此尚無法準(zhǔn)確判斷部分水溶性酚類物質(zhì)的顯著性變化是否僅為代謝活動(dòng)導(dǎo)致[13]。

現(xiàn)有關(guān)于芥菜及其發(fā)酵制品的研究均未檢測(cè)到莽草酸，但檢測(cè)到有莽草酸代謝途徑產(chǎn)物沒食子酸。莽草酸作為莽草酸代謝途徑的重要底物，與苯丙烷代謝途徑聯(lián)系密切?？紤]芥菜品種、留鹵與倒置無鹵發(fā)酵工藝及加入食鹽濃度的差異和樣品處理方法的不同，可能導(dǎo)致類似研究中酚酸物質(zhì)表現(xiàn)出不同的含量變化。

3.2 針對(duì)槲皮素與其糖苷物質(zhì)含量變化的討論

天然槲皮素多以糖基結(jié)合成糖苷的形式存在，相關(guān)研究表明，黃酮苷元比黃酮糖苷具有更高的生物利用率，槲皮素在體內(nèi)的生物利用率及抗氧化活性優(yōu)于槲皮素糖苷[21]，且糖苷在攝取后幾乎不被吸收。前人在蕓薹屬作物菜心[15]、西藍(lán)花[6]及刺梨[21]中均有檢測(cè)出槲皮素，而對(duì)芥菜利用標(biāo)品靶向測(cè)定槲皮素的一些研究中，仍存在未檢測(cè)到的情況[3,8]。本研究在2種材料中均檢出槲皮素，并發(fā)現(xiàn)其含量經(jīng)發(fā)酵后呈顯著上升，其糖苷物質(zhì)槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷的含量呈顯著性下降，可知發(fā)酵影響了槲皮素糖苷物質(zhì)的水解轉(zhuǎn)化。目前實(shí)驗(yàn)室多用β-葡萄糖苷酶、α-鼠李糖苷酶及α-L-鼠李糖苷酶等水解黃酮糖苷配基，而微生物則是這些酶的主要來源[22]。有研究報(bào)道乳桿菌屬具有β-葡萄糖苷酶活性，可轉(zhuǎn)化大豆異黃酮糖苷，表現(xiàn)出高效的槲皮素釋放能力[23]。雖已篩選出一些具有產(chǎn)酶能力的乳酸菌，但不同菌種發(fā)酵轉(zhuǎn)化糖苷配基的水平存在差異，且作用機(jī)制尚未徹底清晰，亟待跟進(jìn)研究。

目前，二氫槲皮素的生物合成過程已經(jīng)基本探明，涉及到苯丙烷和類黃酮2個(gè)階段[24]。本研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵后二氫槲皮素和柚皮素的含量均未呈顯著性變化，并且未檢到圣草酚、二氫山奈酚等。因此，在差異代謝物富集KEGG通路時(shí)，未能富集到苯丙烷和類黃酮2個(gè)途徑。

3.3 乳酸菌發(fā)酵影響酚類物質(zhì)

現(xiàn)有研究表明，參與發(fā)酵的多種乳酸菌都具有使膳食多酚脫羧、脫脂、脫甲基和脫糖基化的能力[25-27]。適當(dāng)?shù)陌l(fā)酵可能是改善蔬菜發(fā)酵制品的化學(xué)特性，并增強(qiáng)其潛在生物活性的有效途徑[28]。研究報(bào)道了一些細(xì)菌和酵母可將羥基肉桂酸(例如咖啡酸、阿魏酸)脫羧為乙烯基酚[29]。腸道微生物和其他乳酸菌被證明能夠通過肉桂酰酯酶將綠原酸轉(zhuǎn)化為咖啡酸和奎寧酸[27]。約翰遜乳桿菌NCC 533產(chǎn)生的酯酶和羥肉桂酸脫羧酶，可分2步將5-咖啡?？崴嵬耆鉃榭Х人醄28]。通過乳酸菌合成的β-葡萄糖苷酶等，可以去糖基定向修飾黃酮類物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)，發(fā)揮其特定功能[30]。此外乳酸菌具有將果蔬中游離酯、結(jié)合態(tài)酚酸分解為游離態(tài)酚酸的作用，并使其生物活性增強(qiáng)。乳酸菌在發(fā)酵過程中產(chǎn)生的水解酶可通過分解細(xì)胞壁而釋放出結(jié)合的酚類物質(zhì)，從而增加酚類物質(zhì)的含量[31]。并且，乳酸菌可以保護(hù)某些多酚在生理?xiàng)l件下免受化學(xué)降解[32-33]。發(fā)酵蔬菜中存在大量的乳酸菌，并篩選出一些具有代謝多酚物質(zhì)能力的菌株，但具體轉(zhuǎn)化機(jī)制尚未完全清晰，可以深入探究，以期通過發(fā)酵將多酚物質(zhì)轉(zhuǎn)化為具有更高生物利用度和生物活性的物質(zhì)。

4 結(jié)論

當(dāng)前研究已對(duì)部分芥菜品種和發(fā)酵芥菜中具體酚類物質(zhì)進(jìn)行定性定量分析，但尚不清晰2種材料的酚類物質(zhì)組成。本實(shí)驗(yàn)采用非靶向代謝組學(xué)，首次較系統(tǒng)報(bào)道了新鮮芥菜和客家擦菜中酚類物質(zhì)組成。通過顯著變化的酚類物質(zhì)及相關(guān)代謝通路，為探索發(fā)酵對(duì)酚類物質(zhì)的影響及代謝機(jī)制提供參考?，F(xiàn)有研究更多集中于蔬菜發(fā)酵前后酚酸的變化，針對(duì)黃酮類物質(zhì)的研究鮮有報(bào)道。盡管一些酚類物質(zhì)在發(fā)酵后未表現(xiàn)出顯著變化，已明確具有生物活性的酚類物質(zhì)仍待進(jìn)一步定量確認(rèn)。對(duì)植物多酚物質(zhì)代謝途徑的研究已取得較大進(jìn)展，但其生物合成代謝較為復(fù)雜，因此可分離發(fā)酵乳酸菌對(duì)其相關(guān)酶學(xué)特性進(jìn)行代謝調(diào)控研究。