抗菌肽及其在動(dòng)物生產(chǎn)中的應(yīng)用

劉夢(mèng)雪，楊 瑞，劉優(yōu)優(yōu)，李蘊(yùn)玉，李佩國(guó)

(河北科技師范學(xué)院 河北省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 秦皇島，066604)

抗菌肽(Antimicrobial Peptides, AMPs)通常由20～60個(gè)氨基酸殘基組成[1]，具有多種生物學(xué)活性，是生物體固有免疫的重要組成部分[2]。天蠶素(cecropins)是通過(guò)向惜古比天蠶蛹的免疫血淋巴中注射陰溝腸桿菌和大腸桿菌后被誘導(dǎo)、分離和純化出的第一個(gè)抗菌肽[3]，目前APD數(shù)據(jù)庫(kù)(http://aps.unmc.edu/AP/main.php)已收錄了3 250種抗菌肽，并有新的抗菌肽被不斷地產(chǎn)生與發(fā)現(xiàn)?？咕木哂袕V譜抗菌、不易引起細(xì)菌耐藥、無(wú)免疫原性[4]和獨(dú)有的破膜殺菌機(jī)制等優(yōu)點(diǎn)，已作為抗生素替代品在畜牧業(yè)、農(nóng)業(yè)、食品工業(yè)和醫(yī)藥衛(wèi)生等領(lǐng)域顯示出良好的發(fā)展前景。筆者從抗菌肽的分類、功能及其在動(dòng)物生產(chǎn)中的作用效果進(jìn)行綜述，以期為抗菌肽作為抗生素替代品在動(dòng)物養(yǎng)殖生產(chǎn)中的合理和深入應(yīng)用提供參考。

1 抗菌肽的分類方式

抗菌肽種類繁多，可根據(jù)不同的研究系統(tǒng)以多種方式進(jìn)行分類，目前主要是根據(jù)其生物來(lái)源和結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行分類。

1.1 根據(jù)生物來(lái)源分類

1.1.1植物源性抗菌肽植物源性抗菌肽是植物內(nèi)分泌系統(tǒng)分泌的能夠抵御外界環(huán)境中微生物入侵的小分子多肽。根據(jù)序列相似性、半胱氨基酸序列和二硫鍵模式的不同，可被分為8類：硫素(thionins)、防御素(defensins)、橡膠蛋白類(hevein-like peptides)、打結(jié)素類(knottin-type peptides)、脂轉(zhuǎn)移蛋白(lipid transfer proteins)、蛻皮素(snakins)、α-hairpinin家族和未分類的CRP抗菌肽[5,6]。

1.1.2昆蟲源性抗菌肽昆蟲源性抗菌肽一般是由昆蟲的血淋巴和機(jī)體組織在昆蟲被微生物感染或意外傷害時(shí)產(chǎn)生[7]，這種抗菌肽對(duì)多種細(xì)菌和真菌有抗菌作用，但對(duì)自身正常細(xì)胞無(wú)毒害作用。根據(jù)氨基酸序列和結(jié)構(gòu)的不同可將其分為3類：天蠶素類抗菌肽、防御素類抗菌肽、富含脯氨酸或富含甘氨酸的抗菌肽[8]。

1.1.3動(dòng)物源性抗菌肽動(dòng)物源性抗菌肽根據(jù)其來(lái)源和分類的不同可分為哺乳動(dòng)物類、禽類、兩棲類、魚類和其他類。根據(jù)分子的總電荷不同又可分為陰離子和陽(yáng)離子2種抗菌肽，其中陽(yáng)離子抗菌肽較多，在哺乳動(dòng)物研究中較為深入，根據(jù)分子結(jié)構(gòu)的不同可分為速激肽和防御素2種[9]。

1.1.4微生物基因工程抗菌肽由于天然性抗菌肽含量較少，不易提取，大量應(yīng)用不僅困難且成本較高，而微生物豐富多樣，具有易于繁殖和生長(zhǎng)迅速等優(yōu)點(diǎn)，因此，利用基因工程重組技術(shù)異源表達(dá)系統(tǒng)可以解決抗菌肽在體內(nèi)分泌過(guò)少難以提取的問(wèn)題。細(xì)菌和酵母表達(dá)系統(tǒng)是抗菌肽生產(chǎn)的主要表達(dá)系統(tǒng)，又因真核與原核的差異而存在著各自的特點(diǎn)[10]。此外，桿狀病毒和轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物表達(dá)系統(tǒng)也被經(jīng)常使用[11]。

1.1.5人工合成抗菌肽隨著抗菌肽研究的深入進(jìn)行，人工合成方式如改造抗菌肽的氨基酸序列或?qū)咕钠芜M(jìn)行設(shè)計(jì)等可以快速大量獲得所需的抗菌肽。且合成的目的抗菌肽在相應(yīng)生物基質(zhì)中同樣具有優(yōu)良的抗菌活性，甚至比親本抗菌肽的生物活性更強(qiáng)[12]。

1.2 根據(jù)結(jié)構(gòu)特征分類

抗菌肽的結(jié)構(gòu)特性與其生物學(xué)特性密切相關(guān)，根據(jù)二級(jí)結(jié)構(gòu)的不同，可將其分為以下4類：α-螺旋結(jié)構(gòu)抗菌肽，這類抗菌肽具有兩親性，即親水性和疏水性，分布廣泛且多樣；β-折疊結(jié)構(gòu)抗菌肽，多來(lái)源于動(dòng)物和植物，可通過(guò)2個(gè)或2個(gè)以上的二硫鍵來(lái)穩(wěn)定結(jié)構(gòu)；環(huán)鏈狀結(jié)構(gòu)抗菌肽，在C端結(jié)尾處有1個(gè)分子內(nèi)二硫鍵來(lái)成環(huán)；伸展性結(jié)構(gòu)抗菌肽，呈線性結(jié)構(gòu)，富含有1種或幾種氨基酸殘基[13,14]。此外，還可根據(jù)所含氨基酸種類的不同將其分為不含半胱氨酸的線性陽(yáng)離子α-螺旋肽、含半胱氨酸和1～3個(gè)二硫鍵的抗菌肽、含特別氨基酸的線肽[11]。

2 抗菌肽的功能

2.1 抗細(xì)菌功能

相比于傳統(tǒng)抗生素，抗菌肽不易產(chǎn)生耐藥性且具有抗菌譜更廣的抗菌活性。張煒等[15]通過(guò)微量倍比稀釋法和擴(kuò)散法發(fā)現(xiàn)抗菌肽BSN-37對(duì)大腸桿菌、沙門氏菌、枯草芽孢桿菌、短小芽孢桿菌有較好的抗菌作用，其中大腸桿菌CVCC1568能在90 min內(nèi)被完全殺死。Ageitos等[16]研究表明，一些含有2～4個(gè)氨基酸的短線性抗菌肽對(duì)金黃色葡萄球菌、腸炎沙門氏菌、枯草芽孢桿菌具有很高的抑菌活性，并發(fā)現(xiàn)最小抑菌濃度為2×10-8～6×10-8mol/L。Li等[17]發(fā)現(xiàn)，從鯰魚皮膚粘液中提取出的抗菌肽CF-14可以增加大腸桿菌細(xì)胞膜通透性，并表明CF-14可能通過(guò)作用于大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)靶點(diǎn)而穿透大腸桿菌細(xì)胞膜，從而對(duì)大腸桿菌起到抑菌作用。

2.2 抗真菌功能

近年來(lái)，由真菌感染和真菌耐藥引起的發(fā)病率和死亡率逐漸上升，特別是由念珠菌和曲霉引起的侵襲性真菌感染最普遍[18]。研究發(fā)現(xiàn)，一些抗菌肽對(duì)部分真菌具有很好的抗性，如Yang等[19]報(bào)道，新型家蠅抗菌肽AMP-17可抑制或殺滅白色念珠菌、熱帶念珠菌、克魯斯念珠菌、近緣念珠菌和新生隱球菌，最低抑菌濃度為9.375～18.75 μg/mL，最低殺菌濃度為18.75～37.5 μg/mL。馬慧玲[20]研究發(fā)現(xiàn)，抗菌肽AMP-17可以通過(guò)破壞白色念珠菌細(xì)胞壁、干擾細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)、改變細(xì)胞膜通透性、增加胞內(nèi)滲透壓以及影響白色念珠菌細(xì)胞壁細(xì)胞膜合成相關(guān)基因的表達(dá)來(lái)發(fā)揮抗真菌效果，同時(shí)，AMP-17還可以抑制白色念珠菌的細(xì)胞分裂過(guò)程，改變細(xì)胞周期進(jìn)程。Khani等[21]研究發(fā)現(xiàn)，抗菌肽Skh-AMP1在濃度為4×10-5mol/L和8×10-5mol/L條件下對(duì)未發(fā)芽的煙曲霉孢子具有殺孢活性，表明Skh-AMP1的抗煙曲霉菌活性可能與其破壞真菌細(xì)胞膜通透性和誘導(dǎo)增強(qiáng)活性氧產(chǎn)生的能力有關(guān)。

2.3 抗病毒功能

抗菌肽可通過(guò)結(jié)合宿主細(xì)胞膜或病毒囊膜來(lái)中和病毒直接作用于病毒顆粒，還可間接干擾病毒生命周期的不同階段來(lái)阻止病毒感染[22]。朱志翠等[23]研究發(fā)現(xiàn)，家蠅抗菌肽MAF-1A能直接破壞甲型流感病毒(IAV)形態(tài)結(jié)構(gòu)的完整性，導(dǎo)致其不能正常復(fù)制增殖，還可以阻止IAV的吸附，干擾其釋放，并提示MAF-1A是通過(guò)對(duì)多靶點(diǎn)作用而發(fā)揮抗流感病毒效應(yīng)。張亞[24]研究表明，雞β-防御素7(AvBD7)蛋白和雞β-防御素10(AvBD10)蛋白對(duì)馬立克氏病病毒(MDV)有較好的抑制作用，體內(nèi)注射Av BD7或Av BD10能減輕MDV感染所造成的傷害。

2.4 抗寄生蟲功能

對(duì)于引起人類及動(dòng)物寄生蟲病的寄生蟲，如瘧疾、錐蟲病、利什曼病等[25]，抗菌肽可以將其有效地殺滅。瘧原蟲是瘧疾的病原體，在瘧原蟲的無(wú)性血液階段會(huì)導(dǎo)致發(fā)燒、貧血、死亡等瘧疾臨床表現(xiàn)的出現(xiàn)。Tonk等[26]研究發(fā)現(xiàn)，抗菌肽Mtk-1和Mtk-2在低濃度時(shí)就可抑制惡性瘧原蟲的生長(zhǎng)，且對(duì)豬和小鼠的紅細(xì)胞顯示出低溶血作用，表明Mtk-1和Mtk-2可被視為針對(duì)惡性瘧原蟲無(wú)性血液階段重要的抗寄生蟲藥物開(kāi)發(fā)的先導(dǎo)。Liu等[27]研究發(fā)現(xiàn)，抗菌肽HPRP-A1/A2通過(guò)破壞弓形蟲速殖子的結(jié)構(gòu)并誘導(dǎo)保護(hù)性免疫應(yīng)答從而有效地對(duì)抗弓形蟲的感染。

2.5 抗腫瘤功能

對(duì)于癌癥細(xì)胞株，抗菌肽能選擇性地殺滅癌細(xì)胞，但對(duì)正常細(xì)胞無(wú)毒害作用[28]。Sang等[29]研究發(fā)現(xiàn)，抗菌肽ABP-dHC-Cecropin A及其類似物在白血病細(xì)胞中均具有濃度依賴性的細(xì)胞毒性作用，而對(duì)非癌細(xì)胞系則無(wú)細(xì)胞毒性。Athanasios等[30]將具有抗癌和抗菌活性的特定基因序列IIKK和LLKKL插入到抗菌肽Cathelicidin LL-37的17～29片段中，發(fā)現(xiàn)該合成肽對(duì)支氣管上皮癌細(xì)胞有實(shí)質(zhì)性細(xì)胞毒性，對(duì)人紅細(xì)胞無(wú)細(xì)胞毒性。

2.6 免疫學(xué)功能

大多數(shù)抗菌肽在體內(nèi)的合成濃度遠(yuǎn)低于其最小抑菌濃度，這些研究表明，有些抗菌肽具有招募趨化因子、激活免疫細(xì)胞、抗炎及提高機(jī)體抗感染的能力，能起到免疫調(diào)節(jié)的作用[31]。此外，有些抗菌肽能加速免疫和傷口愈合過(guò)程[32]。張守平等[33]表明，抗菌肽能影響嗜中性粒細(xì)胞呼吸暴發(fā)反應(yīng)，通過(guò)凝集病毒能力的提高，從而使嗜中性粒細(xì)胞攝入病毒的能力提高。目前對(duì)抗菌肽免疫功能的研究還比較分散，對(duì)抗菌肽在生理環(huán)境下調(diào)控機(jī)體免疫功能的具體機(jī)制還有待深入研究。

3 抗菌肽在動(dòng)物生產(chǎn)中的應(yīng)用

3.1 作為綠色飼料添加劑的應(yīng)用

近年來(lái)，由于抗生素在動(dòng)物生產(chǎn)過(guò)程中的過(guò)度使用，導(dǎo)致動(dòng)物機(jī)體紊亂，腸道微生態(tài)平衡被破壞，動(dòng)物機(jī)體的自身抵抗力下降，同時(shí)也導(dǎo)致動(dòng)物產(chǎn)品和環(huán)境中出現(xiàn)大量抗生素殘留，使致病菌的耐藥性增強(qiáng)，危害人類健康。由于抗菌肽具有多種生物學(xué)活性，易消化吸收，耐酸堿、耐熱等，因此可作為抗生素替代品添加在畜禽飼料中。作為新型綠色飼料添加劑，抗菌肽可以提高動(dòng)物生產(chǎn)性能、增強(qiáng)動(dòng)物免疫力、改善動(dòng)物腸道形態(tài)和盲腸菌群結(jié)構(gòu)[34]，對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用具有促進(jìn)作用，目前已經(jīng)在許多動(dòng)物生產(chǎn)中得到應(yīng)用。

3.1.1提高生產(chǎn)性能及產(chǎn)品品質(zhì)抗菌肽作為一種新型高效的綠色飼料添加劑不會(huì)在畜禽體內(nèi)產(chǎn)生殘留，并對(duì)畜禽生產(chǎn)性能和產(chǎn)品品質(zhì)的有效提升有十分積極的意義。侯佳妮等[35]研究表明，鱟素抗菌肽能延緩產(chǎn)蛋后期蛋雞產(chǎn)蛋率的下降幅度，改善蛋品質(zhì)。徐帆等[36]報(bào)道，抗菌肽可提高斷奶仔豬的生長(zhǎng)性能和免疫活性指標(biāo)。董曉慶等[37]研究發(fā)現(xiàn)，抗菌肽對(duì)建鯉肌肉中蛋白質(zhì)含量具有提高的作用，并且能改善肌肉品質(zhì)。Liu等[38]研究表明，抗菌肽能提高幼山羊的平均日增重，增加果膠酶、木聚糖酶和脂肪酶的酶活性，導(dǎo)致體重增加，并影響瘤胃發(fā)酵功能。付義凱等[39]報(bào)道，禽類β-防御素在保護(hù)精子的作用方面具有一定的特殊性。

3.1.2提高畜禽免疫力在飼料中添加抗菌肽可使動(dòng)物的免疫能力有所提高。王莉等[40]研究表明，在817肉雜雞的日糧中添加天蠶素抗菌肽可以提高免疫器官指數(shù)、ND抗體水平和T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率。袁威等[41]發(fā)現(xiàn)在斷奶仔豬的日糧中添加1 000 mg/kg的復(fù)合抗菌肽不僅可以提高生長(zhǎng)性能，同時(shí)還可提高血清中細(xì)胞因子的含量，提高免疫功能。胡世康等[42]研究表明，在飼料中添加適量的微生物抗菌肽S200可以提高凡納濱對(duì)蝦中超氧化物岐化酶、溶菌酶的活性，從而提高凡納濱對(duì)蝦的抗氧化能力和殺菌活性，增強(qiáng)其免疫功能，有助于凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖成功。楊顏銥[43]研究表明，復(fù)合抗菌肽“態(tài)康利保”可提高川中黑山羊機(jī)體的細(xì)胞、體液免疫應(yīng)答，從而提高山羊的免疫能力。

3.1.3殺菌抑菌，改善腸道菌群結(jié)構(gòu)腸道菌群可維持機(jī)體的免疫和消化吸收功能，并能參與宿主代謝，促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育。王建[44]發(fā)現(xiàn)，抗菌肽Api-PR19能顯著減少飼養(yǎng)后期肉雞盲腸有害菌大腸桿菌和空腸彎曲桿菌的數(shù)量，并在一定程度上維持了盲腸微生物的豐度，改善腸道健康。陳張華等[45]研究表明，在飼料中添加復(fù)合抗菌肽不僅能使斷奶仔豬腸道內(nèi)乳酸桿菌的數(shù)量增加，還能減少腸道大腸桿菌的數(shù)量，且最適添加量為1 000 mg/kg。Liao等[46]在抗菌肽對(duì)南美白對(duì)蝦的影響研究中發(fā)現(xiàn)，多肽S100可以改善南美白對(duì)蝦的生長(zhǎng)性能和腸道菌群結(jié)構(gòu)，并能提高抗菌和免疫功能。Ren等[47]通過(guò)在山羊飼料里添加不同劑量的抗菌肽與空白對(duì)照組做比較，發(fā)現(xiàn)飼喂抗菌肽的山羊其瘤胃微生物菌群結(jié)構(gòu)得到改善，瘤胃發(fā)酵功能發(fā)生改變，并提高了飼料利用率。

3.1.4改善腸道形態(tài)，促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)吸收腸道結(jié)構(gòu)和形態(tài)的完整是機(jī)體正常消化吸收和維持動(dòng)物健康的基礎(chǔ)。Hu等[48]將豬腸道抗菌肽添加到肉仔雞日糧中，發(fā)現(xiàn)能顯著提高肉雞生產(chǎn)性能，減少腸道損傷，并能改善和提高慢性熱應(yīng)激條件下的正常腸道結(jié)構(gòu)、吸收功能和黏膜免疫。梁秀麗等[49]研究發(fā)現(xiàn)，抗菌肽APB-13可促進(jìn)仔豬小腸形態(tài)發(fā)育，改善盲腸微生物菌群結(jié)構(gòu)，從而提高仔豬生長(zhǎng)性能，降低腹瀉率。蘇保元[50]比較了不同抗菌肽—天蠶素、表面活性素粗提品以及表面活性素發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)斜帶石斑魚腸道組織結(jié)構(gòu)的影響，結(jié)果表明，天蠶素和表面活性素均可增加腸黏膜皺襞高度和肌層厚度。

3.2 在疾病防治上的應(yīng)用

目前關(guān)于抗菌肽在動(dòng)物疾病防治如在斷奶仔豬腹瀉、奶牛乳房炎方面的研究報(bào)道較多。仔豬斷奶可導(dǎo)致腸道功能系亂，出現(xiàn)腹瀉、生長(zhǎng)性能下降等現(xiàn)象，嚴(yán)重時(shí)會(huì)致使豬死亡，極大地阻礙了養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展?？咕牟粌H可調(diào)節(jié)機(jī)體免疫，還具有保護(hù)腸道上皮屏障功能，可應(yīng)用于防治斷奶豬腹瀉。Peng等[51]評(píng)估了重組豬β-防御素2(rpBD2)作為斷奶仔豬的藥用飼料添加劑的用途，發(fā)現(xiàn)在基礎(chǔ)日糧中添加5 g/kg的粗制rpBD2不僅能增加十二指腸和空腸的腸絨毛高度，rpBD2還提高了仔豬盲腸黏膜微生物區(qū)系的一致性，降低了微生物區(qū)系的多樣性，使細(xì)菌病原體更少，從而減少了斷奶仔豬腹瀉的發(fā)生。Shi等[52]研究發(fā)現(xiàn)，復(fù)合抗菌肽CAP能顯著降低斷奶仔豬的腹瀉率。萬(wàn)遂如[53]報(bào)道，抗菌肽在豬病防治中用途廣泛，可用于豬呼吸道病綜合征、豬腹瀉性疫病、母豬乳腺炎和子宮內(nèi)膜炎、豬附紅細(xì)胞體病等多種病毒以及細(xì)菌共感染和繼發(fā)感染引發(fā)疾病的治療，肌肉注射抗菌肽配合細(xì)胞因子療法效果顯著。

奶牛乳房炎是當(dāng)今造成世界各國(guó)奶牛損失最大的一種疾病[54]，該病不僅會(huì)使產(chǎn)奶量和牛奶質(zhì)量降低，還能引起嚴(yán)重的食品安全問(wèn)題，而使用抗菌肽是治療奶牛乳房炎的安全有效的手段之一。單玉雪等[55]研究發(fā)現(xiàn)，抗菌肽NZ2114對(duì)導(dǎo)致奶牛乳房炎的無(wú)乳鏈球菌和乳房炎臨床分離株的抗菌活性分別是萬(wàn)古霉素2.91和6.09倍。Báez-Magaa等[56]發(fā)現(xiàn)從擬南芥中分離出的抗菌肽—硫蛋白Thi2.1通過(guò)誘導(dǎo)產(chǎn)生促炎和抗炎分子來(lái)調(diào)節(jié)牛乳腺上皮細(xì)胞的先天免疫反應(yīng)，從而抑制金黃色葡萄球菌的侵襲感染。王靜[57]利用致病性大腸桿菌和金黃色葡萄球菌感染構(gòu)建了奶牛乳房炎的動(dòng)物模型，通過(guò)乳房灌注試驗(yàn)和乳房注射質(zhì)粒試驗(yàn)證明重組牛LAP-CATHL2抗菌肽對(duì)奶牛乳房炎有良好的防治效果。

4 展 望

雖然抗菌肽在很多方面發(fā)揮著重要作用，但距離廣泛應(yīng)用還有許多問(wèn)題需要解決，主要包括以下幾個(gè)方面：1) 天然抗菌肽表達(dá)量低，重組抗菌肽分離純化困難、只有少部分能進(jìn)入生產(chǎn)實(shí)踐階段[58]且工業(yè)批量生產(chǎn)技術(shù)不成熟；2)雖然抗菌肽的熱穩(wěn)定性強(qiáng)，但易被動(dòng)物胃腸道的多種蛋白酶和多肽酶降解，導(dǎo)致其使用方式受到限制，使用劑量問(wèn)題也需要深入研究；3)抗菌肽具有廣譜抗菌作用，雖然研究人員通過(guò)共軛修飾提高了天然抗菌肽的抗菌活性和靶向性等特性[59]，但不同種屬抗菌活性不一，導(dǎo)致研究成本較高；4) 部分抗菌肽具有較強(qiáng)的細(xì)胞毒性以及溶血活性高，影響其在動(dòng)物體內(nèi)的表達(dá)，所以抗菌肽的安全性問(wèn)題也同樣值得我們具體研究。5) 目前提出的抗菌作用機(jī)制只是理論模型，且十分復(fù)雜，仍需對(duì)抗菌肽的作用機(jī)理進(jìn)行探索與發(fā)現(xiàn)。相信隨著基因工程和分子生物學(xué)的發(fā)展，運(yùn)用更多的現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)和工程菌發(fā)酵技術(shù)在抗菌肽的合成、安全穩(wěn)定性、作用機(jī)理等方面進(jìn)行深入研究，將會(huì)研發(fā)出更多綠色、新型、高效的抗菌肽產(chǎn)品，使其更好地應(yīng)用于畜牧生產(chǎn)實(shí)踐中，為養(yǎng)殖戶帶來(lái)更多的經(jīng)濟(jì)效益。