原發(fā)性免疫性血小板減少癥患者血清微小RNA-155和微小RNA-146a表達(dá)情況及臨床意義▲

孫桂芝 賀韋東 姬艷博 劉麗麗 竺 青 郭成山

(1 山東省血液中心機(jī)采成分科，濟(jì)南市 250014，電子郵箱：sgz250014@163.com；2 山東第一醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院血液內(nèi)科， 濟(jì)南市 250014；3 廣東省深圳寶安區(qū)人民醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，深圳市 518101)

原發(fā)性免疫性血小板減少癥(primary immune thrombocytopenia，pITP)是一種臨床上常見的獲得性自身免疫性疾病，以血小板破壞過多、外周血血小板減少為特征，主要表現(xiàn)為廣泛的皮膚黏膜出血，嚴(yán)重者可并發(fā)內(nèi)臟出血、顱內(nèi)出血，其發(fā)病機(jī)制目前仍未明確[1-2]。微小RNA(microRNA，miRNA)是一類長度為21～25個核苷酸的非編碼小分子RNA，廣泛存在于真核生物中，是重要的基因表達(dá)調(diào)節(jié)因子，在各種生理過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用，并參與多種疾病的發(fā)生和發(fā)展過程，或可成為疾病診斷的潛在生物標(biāo)志物。miRNA也是免疫系統(tǒng)發(fā)育和免疫應(yīng)答過程中重要的調(diào)控因素之一，近年來，其在各種免疫性疾病中的作用逐漸被證實，對固有免疫和適應(yīng)性免疫發(fā)揮重要的調(diào)控作用，其中miRNA-155、miRNA-146a在多種免疫性疾病中發(fā)揮重要作用[3]。相關(guān)研究表明，miRNA可能是參與pITP發(fā)病機(jī)制的重要調(diào)控分子，與pITP的病理生理發(fā)展過程密切相關(guān)[4-5]。目前關(guān)于miRNA-155、miRNA-146a在pITP中的作用鮮有研究報告。本研究分析pITP患者miRNA-155、miRNA-146a表達(dá)水平及其臨床意義，以期為pITP的臨床診斷提供一定參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2016年11月至2019年11月于山東第一醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院就診的130例pITP患者作為觀察組，納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合pITP的診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]；(2)患者及其家屬知情同意，并簽署同意書；(3)臨床資料完整者。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)肝、腎、甲狀腺功能異?；颊?；(2)合并嚴(yán)重心腦血管疾病患者；(3)合并惡性腫瘤患者；(4)合并其他免疫性、代謝性疾病患者。選取同期于山東省血液中心的130例機(jī)采血小板捐獻(xiàn)者作為對照組。其中，觀察組男性68例、女性62例，年齡18～52(30.52±10.11)歲；對照組男性64例、女性66例，年齡19～50(31.26±9.85)歲。兩組研究對象的性別、年齡差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。

1.2 主要試劑與儀器 PowerUP SYBR Master Mix(貨號：A25742)購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司；TRIzol RNA提取試劑盒(貨號：15596-026)購自美國Invitrogen公司；Allegra X-15R低溫高速離心機(jī)購自美國貝克曼庫爾特公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(貨號：ALH266-PTO)購自北京百奧萊博科技有限公司；NanoDrop微量分光光度計、Applied Biosystems 實時熒光定量RT-PCR儀均購自購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司；Sysmex-XN 2000全自動血液分析儀購自日本Sysmex公司；miRNA-155、miRNA-146a、U6引物由EXIQON公司合成。

1.3 血小板相關(guān)參數(shù)指標(biāo)的檢測 采集所有研究對象空腹血液樣本5 mL，采用Sysmex-XN 2000全自動血液分析儀檢測血小板計數(shù)、血小板平均體積(mean platelet volume，MPV)、血小板分布寬度(platelet distribution width，PDW)。

1.4 血清miRNA-155、miRNA-146a表達(dá)水平的檢測 采集所有研究對象空腹靜脈血5 mL，2 500 r/min離心10 min后取上層血清，-80℃冰箱儲存?zhèn)溆?。按照RNA提取試劑盒說明書提取血清總RNA，紫外分光光度計檢測及鑒定RNA濃度及純度，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將血清RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，而后取反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行實時熒光定量PCR，以U6為內(nèi)參基因。miRNA-155上游引物為5′-ACCCTGCTGGATGAACGTAG-3′，下游引物為5′-CATGTGGGCTTGAAGTTGAG-3′；miRNA-146a上游引物為5′-CACGGACCTGAAGAACACTGG-3′，下游引物為5′-AGAAATGAAATTAGAACACACATCAATCC-3′；U6上游引物為5′-ATCCGCAAAGACCTGT-3′，下游引物為5′-GGGTGTAACACTAAG-3′。實時熒光定量PCR反應(yīng)體系共20 μL：PowerUP SYBR Master Mix 10 μL，cDNA 4.0 μL，上下游引物(10 μM)各1 μL，ddH2O 4.0 μL。反應(yīng)條件：92℃ 60 s；95℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 30 s，40個循環(huán)。每個標(biāo)本設(shè)置3個復(fù)孔，反應(yīng)結(jié)束收集數(shù)據(jù)，以2-ΔΔCT法計算血清中miRNA-155、miRNA-146a相對表達(dá)量。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 22.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計量資料以(x±s)表示，組間比較采用t檢驗或t′檢驗；計數(shù)資料以例數(shù)(百分比)表示，比較采用χ2檢驗；相關(guān)性分析采用Pearson檢驗；采用Logistic回歸模型分析影響pITP發(fā)生的因素。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組血小板相關(guān)參數(shù)的比較 觀察組血小板計數(shù)低于對照組，PDW及MPV水平高于對照組(均P<0.05)，見表1。

表1 兩組血小板相關(guān)參數(shù)的比較(x±s)

2.2 兩組血清miRNA-155、miRNA-146a表達(dá)水平的比較 觀察組血清miRNA-155相對表達(dá)水平高于對照組，而血清miRNA-146a相對表達(dá)水平低于對照組(均P<0.05)，見表2。

表2 兩組血清miRNA-155和miRNA-146a相對表達(dá)水平的比較(x±s)

2.3 pITP患者血清miRNA-155、miRNA-146a表達(dá)水平與血小板參數(shù)指標(biāo)的相關(guān)性 pITP患者血清miRNA-155相對表達(dá)水平與血小板計數(shù)呈負(fù)相關(guān)，與PDW、MPV均呈正相關(guān)(均P<0.05)；血清miRNA-146a相對表達(dá)水平與血小板計數(shù)呈正相關(guān)，與PDW、MPV均呈負(fù)相關(guān)(均P<0.05)。見表3。

表3 pITP患者血清miRNA-155、miRNA-146a相對表達(dá)水平與血小板參數(shù)指標(biāo)的相關(guān)性

2.4 pITP發(fā)生的影響因素的Logistic回歸分析 以所有研究對象的血清miRNA-155、miRNA-146a水平均值為界限分為高表達(dá)和低表達(dá)。將血清miRNA-155、miRNA-146a納入自變量(miRNA-155賦值：高表達(dá)=1，低表達(dá)=0；miRNA-146a賦值：低表達(dá)=1，高表達(dá)=0)，以是否發(fā)生pITP為因變量(是=1，否=0)，進(jìn)行Logistic回歸分析。結(jié)果顯示，血清miRNA-155高表達(dá)、血清miRNA-146a低表達(dá)均是影響pITP發(fā)生的獨(dú)立危險因素(均P<0.05)，見表4。

3 討 論

pITP是一種常見的以血小板破壞過多為特征的自身免疫性疾病，其臨床表現(xiàn)主要為皮膚黏膜或內(nèi)臟出血，嚴(yán)重影響患者健康。pITP的發(fā)病機(jī)制尚不十分明確，傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為主要是由體液免疫異常所致：B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生大量針對自身血小板的抗體，導(dǎo)致血小板異常，包括血小板破壞增加和生成減少兩方面[7-8]。血小板計數(shù)是反映機(jī)體中血小板生成、衰老情況的重要指標(biāo)，其水平下降是引起出血的主要原因。PDW是反映患者血小板體積異質(zhì)性的主要指標(biāo)，其水平升高則表示血小板體積呈均一性下降。MPV是反映血小板體積大小的指標(biāo)，與血小板密切相關(guān)[9]。本研究結(jié)果顯示，與對照組比較，pITP患者血小板計數(shù)水平降低，PDW及MPV水平均升高，表明pITP患者血小板遭到破壞，導(dǎo)致血小板相關(guān)參數(shù)指標(biāo)異常。

miRNA是一類內(nèi)源性非編碼小分子RNA，其通過堿基互補(bǔ)配對的方式結(jié)合到靶基因上，導(dǎo)致靶基因降解或者抑制其翻譯，影響正常細(xì)胞的分化和生長過程，在人類免疫細(xì)胞成熟分化、發(fā)育、凋亡中起重要作用，其異常表達(dá)可導(dǎo)致機(jī)體免疫功能異常，甚至引起多種自身免疫疾病及其他多種疾病[3]，已成為分子醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。miRNA可能是參與pITP發(fā)病機(jī)制的重要調(diào)控分子。研究顯示，pITP患者的T淋巴細(xì)胞、單個核細(xì)胞及血漿中存在多種miRNA的異常表達(dá)[10-11]。Th1/Th2的平衡調(diào)節(jié)著機(jī)體免疫系統(tǒng)的穩(wěn)定，而在多種自身免疫性疾病中該平衡被破壞，其在pITP的發(fā)病機(jī)制中也發(fā)揮重要作用，Th1/Th2平衡失調(diào)介導(dǎo)B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生抗血小板抗體，進(jìn)而引起血小板被破壞[12]。相關(guān)研究表明，miRNA-155、miRNA-146a可能影響Thl/Th2平衡并在疾病進(jìn)展中發(fā)揮重要作用[13-14]。

研究表明，miRNA-155與多種自身免疫性疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，其過表達(dá)能夠過度激活自身反應(yīng)性B細(xì)胞產(chǎn)生大量特異性抗體，導(dǎo)致機(jī)體免疫系統(tǒng)亢進(jìn)，介導(dǎo)疾病的發(fā)生[15]。呼小茹等[3]的研究表明，pITP患者miRNA-155表達(dá)水平高于健康對照組，其過度表達(dá)可能通過體液免疫參與pITP的發(fā)生，并與疾病分期、預(yù)后、病情嚴(yán)重程度有關(guān)。郭瑩等[16]研究發(fā)現(xiàn)，pITP患者B淋巴細(xì)胞中miRNA-155表達(dá)水平增高。本研究結(jié)果顯示，觀察組血清miRNA-155水平高于對照組，與以上研究結(jié)果相似，這提示miRNA-155可能參與pITP的發(fā)生，其對疾病診斷具有一定的價值。相關(guān)性分析結(jié)果顯示，pITP患者miRNA-155相對表達(dá)水平與血小板計數(shù)呈負(fù)相關(guān)，與PDW、MPV均呈正相關(guān)(P<0.05)，表明pITP患者血清miRNA-155表達(dá)水平可影響血小板生成、衰老及體積異質(zhì)性和大小，進(jìn)而影響疾病。本研究進(jìn)一步Logistic回歸分析結(jié)果顯示，血清miRNA-155高表達(dá)是影響pITP發(fā)生的獨(dú)立危險因素，表明血清miRNA-155可能參與pITP的發(fā)生，其水平升高提示存在發(fā)生pITP的風(fēng)險。

miRNA-146a是miRNA-146家族中的一員，廣泛參與人體免疫細(xì)胞分化、自身免疫性疾病、腫瘤等發(fā)生和發(fā)展，并主要在免疫調(diào)控中發(fā)揮作用，在多種自身免疫性疾病中存在異常表達(dá)[13]。鄭雪倩等[17]的研究表明，與正常人相比，pITP患者外周血單個核細(xì)胞中miRNA-146a表達(dá)顯著降低，且與pITP患者外周血中血小板數(shù)量呈正相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，觀察組血清miRNA-146a相對表達(dá)水平低于對照組(P<0.05)，提示血清miRNA-146a可能也在pITP的發(fā)生中發(fā)揮重要作用，其水平降低預(yù)示pITP的發(fā)生，與佟丹江等[13]研究結(jié)果相似。相關(guān)性分析結(jié)果顯示，miRNA-146a相對表達(dá)水平與血小板計數(shù)呈正相關(guān)，與PDW、MPV均呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，表明pITP患者血清miRNA-146a水平可能通過影響血小板的數(shù)量、體積，進(jìn)而加重疾病。本研究Logistic回歸分析結(jié)果顯示，血清miRNA-146a低表達(dá)是影響pITP發(fā)生的獨(dú)立危險因素，提示miRNA-146a低表達(dá)可能與pITP的發(fā)生存在一定聯(lián)系，但其具體作用機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

綜上所述，pITP患者血清miRNA-155表達(dá)水平升高，血清miRNA-146a表達(dá)水平下降，兩者或共同參與了pITP的發(fā)生機(jī)制，這為進(jìn)一步研究miRNA在pITP中的作用提供新的線索。但因本研究的樣本數(shù)量有限，相關(guān)結(jié)果仍需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量進(jìn)行研究驗證，并深入探討血清miNAR-155、miRNA-146a在pITP中的具體作用機(jī)制。