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    不同濃度新型分裂素PBU誘導(dǎo)的尾巨桉愈傷組織中miRNA396及CKX基因表達(dá)差異研究

    2022-10-12 06:40:14劉亞梅吳宇朋李莉梅歐陽(yáng)樂(lè)軍
    植物研究 2022年5期
    關(guān)鍵詞:細(xì)胞分裂桉樹(shù)調(diào)控

    劉亞梅 吳宇朋 李莉梅 蘇 敏 余 珠 歐陽(yáng)樂(lè)軍*

    (1. 喀什大學(xué)生命與地理科學(xué)學(xué)院,葉爾羌綠洲生態(tài)與生物資源研究高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,喀什 844000;2. 廣東石油化工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院,茂名 525000)

    桉樹(shù)是世界上公認(rèn)的三大人工林樹(shù)種之一,在全球各地的種類(lèi)已達(dá)到1 000多種。桉樹(shù)不僅在環(huán)境綠化、生態(tài)保護(hù)等方面起著重要作用,還廣泛應(yīng)用于制漿造紙行業(yè),也可作為實(shí)木用材,葉片還可用于提煉桉葉油,在化工生產(chǎn)方面也有著重要作用。中國(guó)是目前世界上種植桉樹(shù)面積第三的國(guó)家,其木材產(chǎn)量占全國(guó)木材總產(chǎn)量的30%左右,大大緩解了我國(guó)對(duì)天然林保護(hù)的壓力。尾巨桉()是尾葉桉和巨桉的雜交種,具有良好的雜交優(yōu)勢(shì),是綜合性比其他桉樹(shù)品種更好的速生樹(shù)種。因桉樹(shù)種子高度雜合,其種苗生產(chǎn)一直是通過(guò)植物組培技術(shù)進(jìn)行,但普遍存在不定芽分化效率不理想,再生效率低等問(wèn)題。由于桉樹(shù)的遺傳背景較為復(fù)雜,遺傳機(jī)理尚未明確,大多數(shù)性狀屬于多基因調(diào)控,常規(guī)育種手段已經(jīng)無(wú)法滿(mǎn)足培育不同用途的桉樹(shù)優(yōu)良品種的需求,利用基因工程技術(shù)進(jìn)行遺傳改良具有十分廣闊的應(yīng)用前景。

    建立尾巨桉高效的離體再生體系是開(kāi)展基因工程育種的前提,因此,尾巨桉愈傷組織誘導(dǎo)及不定芽分化機(jī)理的研究受到廣大研究工作者的高度重視。尾巨桉離體再生過(guò)程受到多方面因素的影響,其中內(nèi)源激素的調(diào)控尤為重要,如細(xì)胞分裂素與生長(zhǎng)素等。尾巨桉愈傷組織的內(nèi)源激素受miRNA所調(diào)控,miRNA396便是其中一種與尾巨桉愈傷組織內(nèi)源分裂素含量緊密相關(guān)的miRNA,從而調(diào)控愈傷組織的分化與不定芽的發(fā)生。最近幾年關(guān)于miRNA396基因家族的研究表明,在擬南芥中的miRNA396 有miRNA396A 和miRNA396B兩個(gè)基因,靶向7 個(gè)生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子(Growth-Regulating Factor,),根據(jù)miRBase 上登錄的miRNA396 及其基因家族的研究進(jìn)展來(lái)看,miRNA396是一條相當(dāng)保守的miRNA,僅存在于36 個(gè)物種之中。在 水 稻 中,miRNA396 由8 個(gè) 基 因 編 碼(miRNA396A~H),可以影響水稻的籽粒發(fā)育與抗旱能力等。大豆根系能否正常發(fā)育已被證實(shí)與9 個(gè)miRNA396 及其23 個(gè)靶基因()所構(gòu)成的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)有重要關(guān)系。根據(jù)公布的巨桉基因組比對(duì)分析,尾巨桉中miRNA396 家族有miRNA396A、miRNA396B,負(fù)責(zé)調(diào)控尾巨桉愈傷組織中的細(xì)胞分裂素氧化酶基因(Cytokinin oxidase gene,)與生長(zhǎng)調(diào)節(jié)基因,從而參與尾巨桉愈傷組織內(nèi)源激素對(duì)其生長(zhǎng)分化的調(diào)控。細(xì)胞分裂素幾乎參與了植物生長(zhǎng)發(fā)育的全部過(guò)程,特別是細(xì)胞的分裂與分化的過(guò)程,而基因可以有效地調(diào)節(jié)植物組織中細(xì)胞分裂素的水平,進(jìn)而參與了調(diào)控植物的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程。據(jù)研究,miRNA396通過(guò)調(diào)控其靶基因來(lái)影響植物的生根、發(fā)芽、開(kāi)花和結(jié)果等生物學(xué)過(guò)程,也能控制植物體內(nèi)細(xì)胞的代謝與植物對(duì)脅迫的反應(yīng)。歐陽(yáng)樂(lè)軍等前期研究中發(fā)現(xiàn)新型分裂素PBU 對(duì)尾巨桉再生具有重要的調(diào)控作用。因此,研究不同濃度的PBU 處理下,尾巨桉愈傷組織miRNA396及基因表達(dá)差異,對(duì)研究尾巨桉高效再生體系建立有重要意義。

    本研究以尾巨桉的無(wú)性系無(wú)菌苗的莖段作為外植體,以MS 作為基本培養(yǎng)基,添加瓊脂、蔗糖,并用自主合成的高活性噻唑基脲類(lèi)新型植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑PBU(專(zhuān)利號(hào):ZL200510035860.X)結(jié)合IAA 誘導(dǎo)愈傷組織,選取不同濃度PBU 處理的桉樹(shù)愈傷組織樣品,提取總RNA,反轉(zhuǎn)錄得到cDNA,利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR,分析了基因家族和miRNA396A、miRNA396B 在尾巨桉不同愈傷組織中的表達(dá)差異,初步分析miRNA396和基因?qū)ξ簿掼駜?nèi)源激素的調(diào)控作用。本研究結(jié)果可為優(yōu)化尾巨桉胚性愈傷組織誘導(dǎo)提供一定依據(jù),為揭示尾巨桉胚性愈傷組織發(fā)生及分化的分子機(jī)制提供一定的借鑒和參考。

    1 材料與方法

    1.1 試驗(yàn)材料

    湛江市林業(yè)科學(xué)研究所提供的尾巨桉無(wú)菌苗為材料,切取無(wú)芽點(diǎn)的莖段分別接種在0.5(樣品1)、1.0(樣品2)、2.0(樣品3)mg·L不同質(zhì)量濃度的PBU 誘導(dǎo)愈傷組織,其他培養(yǎng)基組成為MS+0.05 mg·LIAA+100 mg·LVc,pH5.8~6.0,暗 培養(yǎng)2周后光培養(yǎng)1周,分別命名為樣品1、2、3,作為后續(xù)試驗(yàn)材料。

    1.2 主要試驗(yàn)試劑

    異丙醇、Tris、EDTA、NaCl、SDS、焦碳酸二乙酯(Diethy pyrocarbonate,DEPC)、無(wú)水乙醇、氯仿、Ms基鹽、蔗糖、瓊脂、Vc等購(gòu)置于廣州化學(xué)試劑廠(chǎng),新型噻唑基脲類(lèi)細(xì)胞分裂素(N-phenyl-·N′-[6-(2-chlorobenzothiazol)-yl]urea,PBU)由本實(shí)驗(yàn)室保存,Trans Zol Up Plus RNA Kit總RNA提取試劑盒、TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix 試劑盒、Perfect StartGreen熒光定量PCR SuperMix 熒光定量試劑盒購(gòu)于全式金生物技術(shù)有限公司,TIANgel Midi Purification Kit 瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購(gòu)于天根生化科技(北京)有限公司。

    1.3 引物設(shè)計(jì)

    利用Primer 5 軟件設(shè)計(jì)鑒定及熒光定量PCR引物。以基因作為內(nèi)參基因,引物序列見(jiàn)表1。引物合成由生工生物工程(廣州)有限公司完成。

    表1 引物序列Table 1 Primer sequence used in the expriment

    1.4 試驗(yàn)方法

    分 別 用Eu396A-F、Eu396B-F 和Eu396A-R、Eu396B-R 為上下游引物,以尾巨桉基因組DNA 為模板,進(jìn)行PCR 擴(kuò)增,反應(yīng)擴(kuò)增程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性2 min;94 ℃變性30 s,56 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,35 個(gè)循環(huán);72 ℃最終延伸3 min;4 ℃保存。將得到的PCR 產(chǎn)物用瓊脂糖(1.5%)凝膠電泳進(jìn)行驗(yàn)證并回收目的條帶。

    將回收純化所得的PCR 產(chǎn)物送檢測(cè)序,利用DNAMAN 軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果和miRNA396A、miRNA396B 進(jìn)行比對(duì),用Primer 5 軟件設(shè)計(jì)熒光定量PCR引物。引物設(shè)計(jì)方法同1.3,引物合成序列見(jiàn)表1。

    分別提取前述3 種不同試驗(yàn)處理得到的愈傷組織RNA,提取方法參照全式金生物技術(shù)有限公司Trans Zol Up Plus RNA Kit 總RNA 提取試劑盒,使用超微量分光光度計(jì)測(cè)定總RNA濃度。

    使用全式金生物技術(shù)公司的TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix試劑盒,將上述RNA 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,進(jìn)行下一步的實(shí)驗(yàn)操作。

    選用樣品1 的cDNA 作為模板,進(jìn)行熒光定量PCR 擴(kuò)增。為研究?jī)?nèi)參基因與目的基因引物特異性,進(jìn)行不同退火溫度梯度的定量PCR 實(shí)驗(yàn)。分別設(shè)置為56、58、60 ℃,其他條件不變。熒光定量PCR 反應(yīng)體系為:2×TransScript Tip Green 熒光定量PCR SuperMix 10.0 μL,正向、反向引物各0.4 μL,cDNA 2.0 μL,ddHO 7.2 μL。反應(yīng)程序:94 ℃30 s,94 ℃5 s,56 ℃/58 ℃/60 ℃15 s,72 ℃10 s,每個(gè)擴(kuò)增40次循環(huán),每一個(gè)溫度做3個(gè)重復(fù)。

    采用全式金生物技術(shù)公司Perfect StartGreen 熒光定量PCR SuperMix 熒光定量試劑盒,StepOne 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀對(duì)尾巨桉miRNA396A、miRNA396B 和基因的表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)。內(nèi)參基因選用尾巨桉基因,采用三步法進(jìn)行熒光定量PCR,分析在不同濃度PBU 誘導(dǎo)下得到的桉樹(shù)愈傷組織中miRNA396 和基因的表達(dá)差異。數(shù)據(jù)使用2法計(jì)算分析。熒光定量PCR 的程序設(shè)置為94 ℃30 s,94 ℃5 s,58 ℃15 s,72 ℃10 s,40 個(gè)循環(huán)。使用模板量為1 000 ng 反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA 作為熒光定量PCR 的模板,每個(gè)樣品做3個(gè)重復(fù),反應(yīng)體系同1.4.3。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 miRNA396的PCR擴(kuò)增結(jié)果

    由圖1 可見(jiàn),miRNA396A 與miRNA396B 擴(kuò)增條帶很亮,說(shuō)明擴(kuò)增效率好,且兩條目的條帶的大小與預(yù)期相符;條帶濃度好,經(jīng)送樣測(cè)序分析,結(jié)果比對(duì)見(jiàn)圖2,與預(yù)期生信分析的尾巨桉miRNA396A、miRNA396B 序列完全一致,圖中個(gè)別堿基差異是由套峰所致。

    圖1 miRNA396A與miRNA396B擴(kuò)增電泳圖1.miRNA396A;M.Marker;2.miRNA396BFig.1 Amplification electrophoresis of miRNA396A gene and miRNA396B gene 1.miRNA396A;M.Marker;2.miRNA396B

    圖2 miRNA396A與miRNA396B序列比對(duì)圖A.miRNA396A序列比對(duì)圖;B.miRNA396B序列比對(duì)圖Fig.2 Sequencing results of miRNA396A and miRNA396BA.miRNA396A sequence alignment diagram;B.miRNA396B sequence alignment diagram

    在DNAMAN 軟件中對(duì)比測(cè)序結(jié)果,選取miRNA396A 和miRNA396B 中一段連續(xù)200 bp 的堿基序列,以此序列設(shè)計(jì)熒光定量PCR的引物。

    2.2 尾巨桉RNA提取結(jié)果

    圖3 為不同濃度細(xì)胞分裂素PBU 處理下的桉樹(shù)愈傷組織誘導(dǎo)結(jié)果,不同濃度PBU 誘導(dǎo)得到的愈傷組織在形態(tài)大小上都表現(xiàn)出較大差異。在0.5 mg·L細(xì)胞分裂素PBU 處理下的桉樹(shù)愈傷組織質(zhì)地緊密,呈顆粒狀,在1mg·LPBU 誘導(dǎo)的桉樹(shù)愈傷組織質(zhì)地疏松、較膨大,頂端呈黃白色,在2 mg·LPBU 處理下的桉樹(shù)愈傷組織分裂呈規(guī)則分裂的形態(tài),整體表現(xiàn)為綠色。

    圖3 不同濃度PBU誘導(dǎo)得到的桉樹(shù)愈傷組織A.0.5 mg·L-1 PBU;B.1.0 mg·L-1 PBU;C.2.0 mg·L-1 PBUFig.3 Eucalyptus callus induced by different concentrations of PBUA.0.5 mg·L-1 PBU;B.1.0 mg·L-1 PBU;C.2.0 mg·L-1 PBU

    圖4 為不同濃度細(xì)胞分裂素PBU 處理下的桉樹(shù)愈傷組織的RNA 提取電泳結(jié)果??梢钥闯? 個(gè)樣品RNA 電泳圖中18 與28 S 兩條帶清晰無(wú)降解,并且28 S 的亮度很亮,幾乎是18 S 的兩倍,說(shuō)明提取的RNA 完整性較好。也沒(méi)有雜帶,說(shuō)明RNA 提取過(guò)程中沒(méi)有受到DNA的污染。符合后續(xù)逆轉(zhuǎn)錄與熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)要求。

    圖4 不同樣品的RNA提取結(jié)果M.Marker;1~3.樣品1~3Fig.4 RNA extraction results of samplesM.Marker;1-3.Sample 1-3

    使用超微量分光光度計(jì)所測(cè)得的RNA 濃度與OD/OD的值。3 份樣品的濃度最低為206 ng·μL,最 高 為655 ng·μL,OD/OD值 都 在1.8~2.0,證明提取的RNA 污染較少,提取的RNA濃度和純度均滿(mǎn)足后續(xù)實(shí)驗(yàn)的要求。

    2.3 擴(kuò)增特異性分析

    為了探究基因及目標(biāo)基因的最適退火溫度,本實(shí)驗(yàn)選用56、58 和60 ℃進(jìn)行熒光定量PCR,對(duì)3 個(gè)溫度的擴(kuò)增曲線(xiàn)和熔解曲線(xiàn)的結(jié)果進(jìn)行分析?,F(xiàn)不同退火溫度下的目標(biāo)基因都呈現(xiàn)單峰,說(shuō)明引物特異性較好,但是基因的熔解曲線(xiàn)在56 與60 ℃時(shí)均出現(xiàn)了雜峰,因此,后續(xù)基因表達(dá)分析采用58 ℃為退火溫度。

    2.4 基因表達(dá)測(cè)定結(jié)果

    經(jīng)StepOne Software v2.3軟件分析miRNA 396的表達(dá)差異,根據(jù)所測(cè)得的樣品CT值,代入2法的公式計(jì)算它們的相對(duì)表達(dá)量,并使用SPSS軟件對(duì)基因表達(dá)差異結(jié)果進(jìn)行差異顯著性分析(檢驗(yàn)),其結(jié)果見(jiàn)圖5。

    圖5 不同濃度PBU誘導(dǎo)的愈傷組織中目標(biāo)基因表達(dá)差異*表示不同濃度PBU誘導(dǎo)的愈傷組織基因表達(dá)量差異顯著;**表示不同濃度PBU誘導(dǎo)的愈傷組織基因表達(dá)量差異極顯著Fig.5 Different expression of target genes in callus induced by different concentrations of PBU* indicated significant difference among different concentrations of PBU(P<0.05);** indicated significant difference among different concentrations of PBU(P<0.01)

    與樣1 相比較,miRNA396A 和miRNA396B 在樣2 中表達(dá)量均下調(diào),分別為樣1 的0.003 4 和0.032 1 倍,顯著性檢驗(yàn)結(jié)果sig=0.000 3<0.01 和sig=0.004 3<0.01,說(shuō)明差異極顯著。而樣3 的miRNA396A表達(dá)量下調(diào)為樣1的0.326 4倍,sig=1.46×10<0.01,差異達(dá)到極顯著水平,miRNA396B表達(dá)量卻上調(diào)為樣1的1.149 3倍,sig=0.050 6>0.05,差異不顯著。3 個(gè)樣品的擴(kuò)增曲線(xiàn)都呈現(xiàn)出明顯的增長(zhǎng)期和平臺(tái)期,且每個(gè)樣品的3個(gè)重復(fù)性較好。

    用同樣方法對(duì)基因進(jìn)行分析,其結(jié)果見(jiàn)圖5。與樣1 桉樹(shù)愈傷組織基因表達(dá)量相比較,樣2 的、和基因表達(dá)量下調(diào),分別為樣1 的0.169 7、0.168 8 和0.756 6 倍,sig=1.067 1×10、sig=0.006 3、sig=0.003 4,均小于0.01,證明差異均達(dá)到極顯著水平,其他基因均上調(diào)。在上調(diào)的基因里,除基因表達(dá)量為樣1的14.360 1倍,sig=0.000 3<0.01,差異達(dá)到極顯著性水平外,其他兩個(gè)基因表達(dá)差異均不顯著。同樣對(duì)樣3 的基因表達(dá)量進(jìn)行分析。相較于樣1,樣3 的基因均上調(diào),基因均下調(diào),上調(diào)基因倍數(shù)對(duì)應(yīng)為樣品1 的1.161 8、4.316 4、14.562 0 倍,顯著性檢 驗(yàn) 結(jié)果sig=0.036 1、sig=0.002 3、sig=0.000 3,差異分別達(dá)到顯著、極顯著和極顯著水平,下調(diào)基因倍數(shù)對(duì)應(yīng)為樣品1 的0.129 2、0.224 3和0.907 6 倍,sig=7.184 1E-09、sig=0.001 0、sig=0.000 4,均小于0.01,差異均達(dá)到極顯著水平。

    3 討論

    本 研 究 發(fā) 現(xiàn),miRNA396A 與miRNA396B 在0.5 mg·LPBU 誘導(dǎo)下的桉樹(shù)愈傷組織表達(dá)量最高,因?yàn)樵诘蜐舛确秶鷥?nèi),隨著細(xì)胞分裂素濃度升高,愈傷組織的生長(zhǎng)代謝加快,在1.0 和2.0 mg·LPBU 處理下的桉樹(shù)愈傷組織生長(zhǎng)發(fā)育狀況要好于用0.5 mg·LPBU 誘導(dǎo)的桉樹(shù)愈傷組織。miRNA396通過(guò)作用其靶基因來(lái)形成調(diào)控植物組織生產(chǎn)發(fā)育的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。在本研究中的3種樣品中,2.0 mg·LPBU誘導(dǎo)的愈傷組織已出現(xiàn)芽點(diǎn),生長(zhǎng)狀態(tài)最好。在生長(zhǎng)發(fā)育狀態(tài)更好的愈傷組織中,2 個(gè)基因的表達(dá)量都出現(xiàn)了下調(diào),說(shuō)明miRNA396A 與miRNA396B 負(fù)調(diào)控尾巨桉愈傷組織內(nèi)源激素合成。細(xì)胞分裂素在高等植物中存在主要部位是細(xì)胞分裂活躍的器官和組織,CKX 是目前已知惟一的專(zhuān)一催化天然異戊烯類(lèi)CK 及其核苷的不可逆降解的黃素酶,它的合成由基因表達(dá)調(diào)控。通過(guò)降解細(xì)胞分裂素,調(diào)控植物體內(nèi)細(xì)胞分裂素平衡,進(jìn)而調(diào)控植物的生長(zhǎng)發(fā)育,同時(shí)與植物的抗逆性和產(chǎn)量有密切的聯(lián)系?;蚝突蛟?.0 mg·LPBU 誘導(dǎo)下的桉樹(shù)愈傷組織表達(dá)量最高,因?yàn)榧?xì)胞分裂素氧化酶通過(guò)氧化細(xì)胞分裂素從而下調(diào)植物細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞分裂素含量,由于環(huán)境中的細(xì)胞分裂素濃度大大增加,為了使愈傷組織內(nèi)的細(xì)胞分裂素水平達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài),降解掉多余的CK,和基因在轉(zhuǎn)錄成mRNA 時(shí)受到正向調(diào)控,促進(jìn)了它們的表達(dá)。同時(shí)細(xì)胞分裂素的含量是促進(jìn)愈傷組織芽分化的重要因素之一,樣品3 的愈傷組織和樣品1、2 在外觀(guān)上已有明顯區(qū)別,樣品1、2 的愈傷組織整體呈紅色,而樣品3的愈傷組織呈大面積綠色,已經(jīng)有分化出芽點(diǎn)的趨勢(shì),可見(jiàn)在小于2 mg·LPBU 濃度時(shí),升高培養(yǎng)基中的PBU 濃度可促進(jìn)芽的分化。

    本研究通過(guò)探究miRNA396 在不同生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期及在不同濃度細(xì)胞分裂素培養(yǎng)的尾巨桉愈傷組織表達(dá)效率差異,初步確立了miRNA396 在尾巨桉植物組織中的調(diào)控情況和基因的表達(dá)差異,為后續(xù)進(jìn)行尾巨桉miRNA 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的解析奠定了基礎(chǔ)。在此基礎(chǔ),可繼續(xù)進(jìn)行基因的表達(dá)效率差異測(cè)定的研究,從而確立調(diào)控網(wǎng)絡(luò)體系對(duì)尾巨桉愈傷組織誘導(dǎo)及不定芽分化的具體調(diào)控方法,進(jìn)一步促進(jìn)新型分裂素PBU 在尾巨桉高活性愈傷組織誘導(dǎo)及不定芽分化中的應(yīng)用?;蚓哂械慕M織表達(dá)特異性,即使是在同一個(gè)進(jìn)化分支上的基因表達(dá)模式也不盡相同,因此可以推測(cè)基因在進(jìn)化過(guò)程中分化出了不同的功能?;蚣易宓牟煌蓡T在植物生長(zhǎng)發(fā)育的不同階段都在相應(yīng)的組織部位中發(fā)揮著其特定的作用,但其具體作用還有待深入探究。miRNA396 在植物中的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)非常復(fù)雜,研究miRNA396 及其靶基因?qū)χ参锝M織生理分化等的影響具有重要意義。miRNA396 基因家族在多種植物中的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)正逐漸被解密,在尾巨桉中的表達(dá)與調(diào)控只是miRNA396 基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中極小的一部分。相信在未來(lái),miRNA 在植物發(fā)育中的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)究會(huì)成為眾多研究者所關(guān)注的熱點(diǎn)。

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