葛根素聯(lián)合γ突觸核蛋白-微小RNA對肺癌H1299細(xì)胞增殖凋亡的影響

鄒華蘭，曾健梅，冷興強，鐘晶宇

肺癌是對人類身體健康威脅最大的惡性腫瘤之一，盡管近幾十年來肺癌的治療技術(shù)有所進(jìn)步，但病人5年生存率仍然不高，如何有效提高肺癌病人的生存率一直是研究的熱點。葛根素是中藥葛根的有效成分之一，除了具有抗炎、抗氧化和降糖等藥理活性外，還在包括肺癌在內(nèi)的多種腫瘤中表現(xiàn)出較好的抗腫瘤活性。近年來有研究指出，葛根素聯(lián)合γ突觸核蛋白（synuclein gamma，SNCG）-siRNA可協(xié)同抑制膀胱癌細(xì)胞生長。SNCG是突觸核蛋白（synucleins）家族成員，參與神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，與帕金森病等神經(jīng)退行性疾病密切相關(guān)；此外，SNCG還在乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌和結(jié)直腸癌等腫瘤組織中異常表達(dá)，可影響細(xì)胞生物學(xué)功能，參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展。有研究報道，SNCG在肺癌組織中高表達(dá)，可通過激活A(yù)KT促進(jìn)癌細(xì)胞增殖。本研究自2019年2－6月研究葛根素聯(lián)合SNCG-siRNA抗肺癌的可行性，并探討其可能的分子機(jī)制，以期為肺癌的治療提供新線索。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 腫瘤增殖抗原（Ki67）、B淋巴細(xì)胞瘤-2（Bcl-2）蛋白和Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bax）抗體（Santa Cruz），SNCG、細(xì)胞周期蛋白D1（Cyclin D1）和甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）抗體（Ab‐cam）。脂質(zhì)體2000和Trizol試劑（Invitrogen）。二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱（Thorma），流式細(xì)胞儀（Becton Dickinson）公司，酶標(biāo)儀（Bio-Rad）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) H1299細(xì)胞采用添加有10%胎牛血清和100 U/mL青鏈霉雙抗的RPMI1640培養(yǎng)基在5%二氧化碳、飽和濕度和37℃恒溫培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。每天觀察，待細(xì)胞貼壁80%時，以0.25%胰蛋白酶消化2 min，按照1∶2～1∶3比例傳代。取生長狀況良好的第3代對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實驗。

1.3 葛根素濃度篩選實驗 采用MTT法檢測。將對數(shù)生長期的H1299細(xì)胞以每孔10個接種至96孔細(xì)胞板上后，于恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)過夜。次日，加入含葛根素終濃度分別為0、20、40、80、160和320μg/mL培養(yǎng)液，其中每個梯度設(shè)置5個復(fù)孔，并以無細(xì)胞的培養(yǎng)液作為空白對照。孵育24 h后，棄培養(yǎng)液，每孔加入濃度為5 g/L MTT工作液20μL，孵育4h后，每孔加入二甲基亞砜150μL，震蕩反應(yīng)10 min后，采用酶標(biāo)儀檢測各處理組細(xì)胞在570 nm處的光密度（OD）值。根據(jù)公式：存活率（%）=（藥物組OD－空白組OD）/（對照組OD－空白組OD）×100%計算出各處理細(xì)胞的存活率，并根據(jù)100%-存活率（%）值計算出葛根素作用24 h下的半抑制濃度IC50。

1.4 實驗分組和細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將對數(shù)生長期的H1299細(xì)胞以每孔10個接種至6孔細(xì)胞板上后，于恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)。實驗分為NC-siRNA組（轉(zhuǎn)染陰性對照NC-siRNA）、SNCG-siRNA組（轉(zhuǎn)染SNCG干擾序列SNCG-siRNA）、葛根素+NC-siRNA組（轉(zhuǎn)染NC-siRNA后給予150μg/mL葛根素處理24 h）和葛根素+SNCG-siRNA組（轉(zhuǎn)染SNCG-siRNA后給予150μg/mL葛根素處理24 h）。待細(xì)胞匯合度達(dá)75%時，參照脂質(zhì)體2000說明書步驟根據(jù)實驗分組進(jìn)行轉(zhuǎn)染。其中，SNCG-siRNA（正向引物：5’-UGACGGAAGCAGCUGAGAATT-3’，反向引物：5’-UUCUCAGCUGCUUCCGUCATT-3’）及NC-siRNA（正向引物：5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’，反向引物：5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’）由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成。轉(zhuǎn)染48h后收集NC-siRNA組和SNCG-siRNA組細(xì)胞，采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）和蛋白質(zhì)免疫印跡（Western blot）分別檢測細(xì)胞中SNCGmRNA和蛋白的表達(dá)水平以評價轉(zhuǎn)染效果。

1.5 SNCG mRNA表達(dá)的檢測 采用RT-PCR檢測。以Trizol試劑提取H1299細(xì)胞的總RNA后，以紫外分光光度計檢測RNA的濃度。參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄后，將逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA作為模板，根據(jù)定量PCR試劑盒說明書進(jìn)行PCR擴(kuò)增。其中，PCR引物（SNCG正向引物：5’-TGACCTCAGTGGCCGAGAA-3’，反 向 引 物：5’-GCCTCACCCTCCTGTTGG-3’；GAPDH正向引物：5’-AGACAGCCGCATCTTCTTGT-3’，反向引物：5’-TGATGGCAACAATGTCCACT-3’）由上海生工生物工程有限公司合成。以GAPDH為內(nèi)參，2法計算各組細(xì)胞中SNCGmRNA的表達(dá)水平。

1.6 SNCG、Ki67、CyclinD1、Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)的檢測 采用Western blot檢測。向待測的H1299細(xì)胞中加入RIPA裂解液提取總蛋白后，采用BCA法對總蛋白的濃度進(jìn)行定量。將蛋白樣品與等體積上樣緩沖液混勻后，置于沸水浴中煮沸5 min。參照SDS-PAGE凝膠配制試劑盒說明書制備SDSPAGE凝膠后，按照每孔80μg蛋白樣品的上樣量行電泳分離。電泳結(jié)束后，電轉(zhuǎn)至PVDF膜上。將膜浸入含5%脫脂奶粉的封閉液中封閉2 h后，以特異性 一 抗（SNCG 1∶1 000、Ki67 1∶500、CyclinD1 1∶1 000、Bcl-2 1∶800、Bax 1∶800和GAPDH 1∶1 000）4℃下孵育過夜。封閉液洗膜后，再以二抗（1∶2 000）室溫下孵育1 h。經(jīng)ECL顯影后，以GAPDH為內(nèi)參，采用凝膠成像系統(tǒng)掃描分析。

1.7 細(xì)胞增殖能力檢測 采用MTT法和平板克隆實驗檢測。（1）MTT實驗：將對數(shù)生長期的H1299細(xì)胞以每孔10個接種96孔細(xì)胞板上后，置于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)過夜。將其按照1.4進(jìn)行分組并處理后，采用MTT法檢測各組細(xì)胞的存活率，詳細(xì)步驟參照1.3。（2）平板克隆實驗：將對數(shù)生長期的H1299細(xì)胞以每孔10個細(xì)胞）接種至6孔細(xì)胞板上后，常規(guī)培養(yǎng)過夜。按照1.4分組處理后，繼續(xù)在培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。待有肉眼可見的集落出現(xiàn)時終止培養(yǎng)。棄培養(yǎng)液，用磷酸緩沖液洗滌細(xì)胞3次后，以甲醇和結(jié)晶紫分別對細(xì)胞進(jìn)行固定和染色，洗去染液后，室溫下干燥。采用顯微鏡每個樣品隨機(jī)選取6個視野檢測細(xì)胞的克隆數(shù)。其中，將超過15個細(xì)胞的集落作為一個有效克隆，以（克隆數(shù)/種植細(xì)胞數(shù)）×100%的值表示細(xì)胞的克隆形成能力。

1.8 細(xì)胞凋亡能力檢測 采用流式細(xì)胞儀檢測。收集處理結(jié)束后的NC-siRNA組、SNCG-siRNA組、葛根素+NC-siRNA組和葛根素+SNCG-siRNA組細(xì)胞，經(jīng)磷酸緩沖液洗滌2次后，參照Annexin-V/FITC凋亡試劑盒說明書上流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞的凋亡能力。

2 結(jié)果

2.1 葛根素對肺癌H1299細(xì)胞增殖的影響 與0 μg/mL處理組相比，20、40、80、160和320μg/mL葛根素刺激24 h后H1299細(xì)胞存活率均明顯降低（P＜0.05）。見表1。同時，計算出24 h作用時間下葛根素的IC50為150.40μg/mL。故后續(xù)選用濃度為150 μg/mL進(jìn)行實驗。

表1 不同濃度葛根素刺激后各組細(xì)胞的存活率/（%，x±s)

2.2 轉(zhuǎn)染SNCG-siRNA對肺癌H1299細(xì)胞中SNCG表達(dá)的影響 與NC-siRNA組相比，SNCGsiRNA組細(xì)胞中SNCG mRNA和蛋白的表達(dá)水平均明顯降低（P＜0.05）。見表2。

表2 轉(zhuǎn)染SNCG-siRNA后H1299細(xì)胞中SNCGmRNA和蛋白的表達(dá)/x±s

2.3 葛根素聯(lián)合SNCG-siRNA對肺癌H1299細(xì)胞增殖的影響 與NC-siRNA組相比，葛根素+NC-siR‐NA組、SNCG-siRNA組和葛根素+SNCG-siRNA組細(xì)胞存活率和克隆形成率均明顯降低（P＜0.05）；與葛根素+NC-siRNA或SNCG-siRNA處理組相比，葛根素+SNCG-siRNA處理組細(xì)胞存活率和克隆形成率進(jìn)一步降低（P＜0.05）。見表3。

2.4 葛根素聯(lián)合SNCG-siRNA對肺癌H1299細(xì)胞凋亡的影響 葛根素+NC-siRNA或SNCG-siRNA處理組以及葛根素+SNCG-siRNA處理組細(xì)胞凋亡率均明顯高于NC-siRNA組（P＜0.05）；且葛根素+SNCG-siRNA處理后的作用效果較葛根素+NC-siR‐NA或SNCG-siRNA處理更為顯著（P＜0.05）。見圖1和表3。

表3 各組細(xì)胞存活率、克隆形成率和凋亡率的比較/（%，x±s)

2.5 葛根素聯(lián)合SNCG-siRNA對H1299細(xì)胞中Ki67、CyclinD1、Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)的影響 與NC-siRNA組相比，葛根素+NC-siRNA或SNCG-siR‐NA處理組以及葛根素+SNCG-siRNA處理組細(xì)胞中Ki67、CyclinD1、Bcl-2蛋白的表達(dá)水平均明顯降低，而Bax蛋白的表達(dá)水平均明顯升高（P＜0.05）；與葛根素+NC-siRNA或SNCG-siRNA處理組相比，葛根素+SNCG-siRNA對H1299細(xì)胞中Ki67、CyclinD1、Bcl-2蛋白表達(dá)的抑制作用及對Bax蛋白表達(dá)的促進(jìn)作用更為明顯（P＜0.05）。見圖2和表4。

3 討論

由于中藥抗腫瘤具有多靶點、全方位和不良反應(yīng)小等優(yōu)勢，使得中4藥在腫5瘤治療中占據(jù)著重要地位。作為中草藥葛根的主要有效成分葛根素在抗腫瘤方面1的作用備受學(xué)者們的關(guān)注。Jiang K等研究指出，葛根素可通過調(diào)控mTOR/p70S6K抑制膀胱癌細(xì)胞增殖。Zhang等報道，葛根素可呈劑量依賴性通過MAPK信號通路誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果表明葛根素可抑制肺癌H1299細(xì)胞增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。這提示葛根素具有較好的抗肺癌的作用。

SNCG基因位于人10q23染色體上，其編碼的蛋白質(zhì)由127個氨基酸組成，在大腦丘腦和黑質(zhì)中高表達(dá)，在結(jié)腸、卵巢和心臟等部位低表達(dá)，而在肝、乳腺和腎等器官中幾乎不表達(dá)。Ji等在乳腺癌中首次分離并報道了SNCG，并指出SNCG在晚期乳腺癌組織中高表達(dá)，且其表達(dá)同乳腺癌病理分期呈顯著正相關(guān)。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，SNCG在結(jié)直腸癌、卵巢癌和膀胱癌等腫瘤中異常高表達(dá)，且可通過調(diào)控細(xì)胞增殖和凋亡等在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程 中 發(fā) 揮 著 重 要 作 用。Changru等指 出，RNA干擾介導(dǎo)的SNCG沉默可通過下調(diào)Akt/Erk的磷酸化抑制胃癌SGC7901細(xì)胞的體外和體內(nèi)生長。李文怡指出，沉默SNCG表達(dá)可抑制子宮內(nèi)膜癌HEC-1A細(xì)胞增殖、侵襲、遷移并誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯和凋亡。本研究表明RNA干擾SNCG表達(dá)可抑制肺癌H1299細(xì)胞增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。這提示SNCG在肺癌的發(fā)生發(fā)展過程中可能發(fā)揮著致癌基因的作用，而靶向干擾其表達(dá)可抑制肺癌的惡性進(jìn)展。

本研究以葛根素刺激SNCG干擾后的H1299細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，H1299細(xì)胞增殖和克隆形成能力下降以及細(xì)胞凋亡能力升高幅度較葛根素或SNCG干擾單獨處理更為明顯。結(jié)果表明，葛根素聯(lián)合SNCG干擾可協(xié)同抑制肺癌H1299細(xì)胞增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。Ki67是細(xì)胞增殖過程中不可或缺的核抗原，與有絲分裂密切相關(guān)，可作為肺癌細(xì)胞增殖的重要指標(biāo)；CyclinD1是一種重要的細(xì)胞周期蛋白，在細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期過程中發(fā)揮著重要的促進(jìn)作用；同時也是一種癌基因，在肺癌細(xì)胞增殖凋亡過程中發(fā)揮著重要作用；Bcl-2和Bax是Bcl-2家族成員，分別在肺癌細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮著抑制和促進(jìn)的作用。有報道證實，siRNA-SNCG通過降低Bcl-2表達(dá)來增加放射對乳腺癌MDA-MB231細(xì)胞毒性和凋亡；敲除SNCG可通過下調(diào)Cyclin D1、Ki67等蛋白的表達(dá)增強膠質(zhì)瘤移植瘤對紫杉醇的藥物敏感性。本研究進(jìn)一步檢測結(jié)果表明葛根素聯(lián)合SNCGsiRNA可協(xié)同下調(diào)Cyclin D1、Ki67、Bcl-2蛋白和上調(diào)Bax蛋白的表達(dá)。這提示，葛根素和SNCG-siRNA可能通過協(xié)同上調(diào)Bax和下調(diào)Cyclin D1、Ki67、Bcl-2蛋白的表達(dá)發(fā)揮協(xié)同抗肺癌的作用。

圖1 流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞凋亡

表4 各組細(xì)胞中Ki67、CyclinD1、Bcl-2和Bax蛋白的表達(dá)水平/x±s

圖2 Western blotting檢測各組細(xì)胞中Ki67、CyclinD1、Bcl-2和Bax蛋白的表達(dá)

綜上所述，葛根素聯(lián)合SNCG-siRNA可協(xié)同抑制肺癌H1299細(xì)胞增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制可能與共同下調(diào)Cyclin D1、Ki67、Bcl-2蛋白和上調(diào)Bax蛋白的表達(dá)有關(guān)。本研究僅是從細(xì)胞水平上、單種肺癌細(xì)胞系中闡述了葛根素和SNCG-siR‐NA聯(lián)合的作用效果及潛在機(jī)制，后續(xù)將在多種肺癌細(xì)胞系和動物水平上進(jìn)一步驗證。