肥胖2型糖尿病模型OLETF大鼠不同病程階段肝臟水通道蛋白9 mRNA的表達(dá)

段玉敏，袁振芳

水通道蛋白（aquaporin，AQP）是廣泛存在于多種細(xì)胞的細(xì)胞膜上的一大類跨膜蛋白，其主要作用是用來(lái)運(yùn)輸水分子。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的水通道蛋白有11個(gè)亞型（AQP0～AQP10）。本實(shí)驗(yàn)研究的AQP9主要是在肝細(xì)胞表面表達(dá)的一種特異性水-甘油通道蛋白，其與在脂肪細(xì)胞表面表達(dá)的特異性水-甘油通道蛋白AQP7在糖脂代謝過(guò)程中存在協(xié)同作用。既往研究證實(shí)AQP7和AQP9可能在肥胖和糖尿病發(fā)展的不同病程階段發(fā)揮了一定作用，目前這兩類蛋白與糖脂代謝的關(guān)系還不十分清楚。本研究自2019年3-9月采用肥胖的2型糖尿病大鼠模型-OLETF大鼠作為研究對(duì)象，從動(dòng)物角度揭示肝臟AQP9在肥胖和糖尿病病程發(fā)展中的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及實(shí)驗(yàn)方法 選取30只雄性O(shè)LETF（Otsuka Long-Evans Tokushima fatty）大鼠為實(shí)驗(yàn)組，同品系的18只LETO（Long-Evans Tokushi‐ma Otsuka）大鼠為正常對(duì)照組。給予常規(guī)飼料喂養(yǎng)，飲用清水至8周齡，從兩組中分別隨機(jī)抽取6只予50%葡萄糖按2 g/kg劑量口服行葡萄糖耐量試驗(yàn)（OGTT），同時(shí)測(cè)定體質(zhì)量、胰島素、三酰甘油、總膽固醇水平，試驗(yàn)后3 d稱重，給予2%戊巴比妥40 mg/kg腹腔內(nèi)注射處死取肝臟組織凍存。剩余24只OLETF大鼠隨機(jī)分成兩組，一組為未治療組（OLETF組）12只，給予等體積純凈水6.0 mL/kg灌胃；另一組為鹽酸二甲雙胍治療組（OLETF/M組）12只，給予鹽酸二甲雙胍300 mg·kg·d灌胃。同時(shí)對(duì)照組的12只LETO大鼠按照6.0 mL/kg給予等體積的純凈水灌胃。自8周起，所有實(shí)驗(yàn)大鼠均飲用100 g/L的蔗糖水代替普通飲用水，仍使用常規(guī)飼料喂養(yǎng)。在18周齡和28周齡，分別從三組中采用隨機(jī)數(shù)字表法抽取6只大鼠仍以50%葡萄糖按2 g/kg劑量口服行葡萄糖耐量試驗(yàn)。符合OGTT 120 min血糖＞11.1 mmol/L或血糖峰值＞16.71 mmol/L兩條中的任何一條診斷為糖耐量異常；OGTT 120 min血糖＞11.1 mmol/L和峰值血糖＞16.71 mmol/L兩個(gè)條件都符合診斷為糖尿??；同8周基線時(shí)一樣測(cè)定大鼠的各項(xiàng)生化指標(biāo)。OGTT試驗(yàn)后3 d處死取肝臟組織凍存。實(shí)驗(yàn)中充分保證動(dòng)物福利、給予動(dòng)物人道關(guān)懷，動(dòng)物處置符合倫理學(xué)原則。

1.2 基本生化指標(biāo)的測(cè)定 用氧化酶法測(cè)定血糖及血脂，血糖分別測(cè)定，血脂為同一批測(cè)定；用胰島素放射免疫分析試劑盒同一批測(cè)定血清胰島素。

1.3 肝臟組織AQP9 mRNA的表達(dá)用Real time PCR分批測(cè)定 取100 mg肝臟組織在液氮下研磨后用Trizol提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。取4μL cDNA（50μL體系）在ABIPrism 7600定量PCR儀上進(jìn)行Real time PCR，實(shí)驗(yàn)條件：預(yù)變性95℃10 min；95℃變性15 s，60℃退火1 min，共擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增曲線用7300 SDS軟件觀察，并進(jìn)行產(chǎn)物定量分析。試驗(yàn)組相對(duì)于對(duì)照組的變化倍數(shù)用2法表示。引物序列見(jiàn)表1。

表1 Real-time PCR引物序列

2 結(jié)果

2.1 三組大鼠體質(zhì)量、三酰甘油、總膽固醇指標(biāo)比較 見(jiàn)表2。

2.1.1 體質(zhì)量 隨周齡增加，OLETF組較LETO組肥胖加重，8周體質(zhì)量增加11.16%（P＜0.05），18周體質(zhì)量增加17.47%（P＜0.01），28周體質(zhì)量增加26.92%（P＜0.01），OLETF/M組與同周齡OLETF組大鼠比較，兩組體質(zhì)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與同周齡對(duì)照LETO組大鼠比較肥胖加重，未見(jiàn)鹽酸二甲雙胍對(duì)體質(zhì)量有明顯影響。

表2 三組大鼠體質(zhì)量、三酰甘油、總膽固醇指標(biāo)比較/±s

2.1.2 三酰甘油及膽固醇 三酰甘油水平：8周齡OLETF組與對(duì)照LETO組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，18周OLETF組較LETO組增高2.86倍（P＜0.01），28周OLETF組較LETO組增高7.58倍（P＜0.05）；而OLETF/M組在18周較LETO組僅增加2.31倍（P＜0.01），在28周較LETO組僅增加3.66倍（P＜0.05），18和28周OLETF/M組的三酰甘油水平均低于OLETF組（P＞0.05）。膽固醇水平：OLETF/M組在28周齡較OLETF組下降24.2%（P＜0.05），其余各周齡各組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 三組大鼠各周OGTT血糖及胰島素比較見(jiàn)表3。

2.2.1 血糖 實(shí)驗(yàn)期間對(duì)照組LETO大鼠血糖均正常；OLETF組在8周齡血糖正常，OLETF組及OLETF/M組在18周齡均達(dá)糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)，血糖水平OLETF/M組低于OLETF組，在OGTT 60 min時(shí)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。在28周齡，OLETF組血糖進(jìn)一步增高，糖尿病加重，OLETF/M組大鼠血糖下降，均恢復(fù)為糖耐量異常。

2.2.2 胰島素 8周齡各組大鼠胰島素水平相同；隨血糖增高，糖尿病加重，OLETF組和OLETF/M組的胰島素水平均高于LETO組，說(shuō)明OLETF大鼠胰島素抵抗加重。但OLETF與OLETF/M兩組間的胰島素在各點(diǎn)均差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，雖然在28周OLETF/M組服用鹽酸二甲雙胍使血糖水平緩解為糖耐量異常，但截至28周結(jié)束未觀察到二甲雙胍降胰島素的作用。

2.3 肝臟AQP9 mRNA的表達(dá) OLETF組肝臟AQP9 mRNA的表達(dá)在8周齡、18周齡及28周齡分別是同周齡LETO組的0.9倍、1.0倍和0.7倍，OLETF/M組肝臟AQP9 mRNA的表達(dá)則分別是同周齡LETO組的0.9倍、0.6倍及0.5倍。OLETF/M組肝臟AQP9 mRNA的表達(dá)低于OLETF組，但兩組之間及與同周齡LETO組間對(duì)比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討論

1997年Kuriyama等在分析人類脂肪組織基因序列時(shí)發(fā)現(xiàn)了一類水甘油通道蛋白-水通道蛋白9（AQP 9），它在肝臟、大腦、消化道、睪丸等多個(gè)組織分布，對(duì)水、多元醇、甘油、腺嘌呤、尿素、單羧酸酯、嘧啶、氨以及亞砷酸鹽等均具有通透性。AQP9基因最初是從脂肪組織中克隆得到的，它的生理功能是甘油進(jìn)出脂肪細(xì)胞的通道，參與三酰甘油的合成代謝及分解代謝以維持脂肪代謝的平衡。在全身各組織器官中，AQP9在肝臟中的表達(dá)水平最高，免疫熒光顯示AQP9蛋白主要定位于肝細(xì)胞血竇面。甘油是體內(nèi)聯(lián)系葡萄糖、脂肪、蛋白質(zhì)三大物質(zhì)代謝的樞紐，它既與脂肪酸作用參與三酰甘油等脂質(zhì)合成，也參與糖異生過(guò)程。生理?xiàng)l件下70%～90%的甘油最終在肝細(xì)胞內(nèi)氧化分解，而AQP9是肝細(xì)胞對(duì)甘油攝取的轉(zhuǎn)運(yùn)通道。

脂肪組織分解產(chǎn)生的甘油通過(guò)脂肪細(xì)胞表面的水通道蛋白7（AQP 7）釋放入血，進(jìn)入血液的甘油通過(guò)肝臟表面的AQP 9轉(zhuǎn)運(yùn)入肝細(xì)胞，在糖脂代謝過(guò)程中，AQP7與AQP9的協(xié)同作用至關(guān)重要。水通道蛋白7和9把脂肪分解產(chǎn)生的甘油轉(zhuǎn)運(yùn)到肝細(xì)胞胞漿內(nèi)，在甘油激酶作用下生成3-磷酸甘油，它是體內(nèi)多種能量物質(zhì)代謝的中間產(chǎn)物，并參與氧化供能，3-磷酸甘油通過(guò)糖異生生成葡萄糖或者被再次合成三酰甘油。AQP9基因被敲除的AQP9小鼠與野生型AQP9小鼠相比，血甘油及三酰甘油明顯升高，饑餓狀態(tài)下的血糖明顯下降，說(shuō)明AQP9參與了甘油的轉(zhuǎn)運(yùn)，在糖代謝過(guò)程中也發(fā)揮了重要作用。

表3 三組大鼠OGTT血糖及胰島素比較/±s

本研究選擇肥胖2型糖尿病模型OLETF大鼠，給予高糖飼養(yǎng)后取肝臟組織，大鼠在喂養(yǎng)到18周齡時(shí)全部達(dá)糖尿病標(biāo)準(zhǔn)，血清三酰甘油和胰島素均增加，是典型的2型糖尿病病人具有的肥胖、高脂血癥和胰島素抵抗的特點(diǎn)。與文獻(xiàn)報(bào)道相符。

實(shí)驗(yàn)觀察到OLETF大鼠在8周時(shí)肝臟AQP9 mRNA的表達(dá)是同周齡LETO組的0.9倍，在18周齡和28周齡，OLETF組肝臟AQP9 mRNA的表達(dá)分別是同周齡LETO組的1.0倍及0.7倍。同時(shí)在糖尿病發(fā)展過(guò)程中，LETO組AQP9 mRNA表達(dá)為逐漸上調(diào)趨勢(shì)，而OLETF組肝臟AQP9 mRNA表達(dá)則為先代償性上調(diào)而后下調(diào)趨勢(shì)。分析原因，這可能是由于LETO組大鼠隨著周齡及體質(zhì)量的增加，脂肪含量增加使脂肪組織分解代謝增強(qiáng)，需要釋放入血的甘油濃度增加，肝臟AQP9 mRNA表達(dá)代償性上調(diào)，可以促進(jìn)更多的甘油進(jìn)入肝臟合成三酰甘油。而OLETF組AQP9 mRNA表達(dá)先代償性上調(diào)而后下調(diào)，可能是因?yàn)?8周齡時(shí)因持續(xù)給予高糖飼養(yǎng)，大鼠體質(zhì)量增加了17.47%，脂肪細(xì)胞需釋放更多甘油引起AQP9代償性上調(diào)，釋放的甘油是糖異生的底物，大量甘油進(jìn)入肝臟合成葡萄糖，使OLETF大鼠血糖大幅升高，糖尿病加重。在28周齡，OLETF組大鼠的肥胖狀態(tài)及糖尿病加重，但肝臟AQP9表達(dá)卻呈現(xiàn)下調(diào)，既往國(guó)內(nèi)外動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及人體實(shí)驗(yàn)均證實(shí)，肥胖者體內(nèi)脂肪組織AQP7表達(dá)下調(diào)，故分析AQP 9下調(diào)可能是由于脂肪細(xì)胞AQP7失代償使表達(dá)減少，導(dǎo)致從脂肪細(xì)胞中排出的甘油減少，細(xì)胞內(nèi)甘油濃度增加，脂肪細(xì)胞內(nèi)脂肪合成增加，肥胖更加明顯，AQP7表達(dá)下調(diào)，從而使由脂肪細(xì)胞釋放的甘油減少進(jìn)而導(dǎo)致肝臟AQP9表達(dá)同時(shí)下調(diào)。

鹽酸二甲雙胍是臨床2型糖尿病病人治療的基礎(chǔ)用藥，已有證據(jù)表明鹽酸二甲雙胍可以改善肥胖及2型糖尿病病人的胰島素抵抗及脂代謝紊亂，且有較強(qiáng)的降糖效果，在不增加胰島素分泌的同時(shí)可以改善胰島素抵抗，使體質(zhì)量不變或減輕。本實(shí)驗(yàn)選取鹽酸二甲雙胍，意在探討其在改善胰島素抵抗，治療糖尿病的同時(shí)能否影響肝臟AQP9 mRNA的表達(dá)。用鹽酸二甲雙胍以300 mg·kg·d劑量給OLETF/M組大鼠灌胃，到28周齡，鹽酸二甲雙胍降低了OLETF/M組大鼠的血糖及血脂，與文獻(xiàn)報(bào)道相符，但OLETF/M組體質(zhì)量較同周齡OLETF組未見(jiàn)減輕，分析可能與飼養(yǎng)時(shí)間短有關(guān)，若延長(zhǎng)飼養(yǎng)時(shí)間兩組間可能會(huì)出現(xiàn)差異。鹽酸二甲雙胍使同周齡OLETF/M組肝臟AQP9 mRNA表達(dá)上調(diào)的幅度低于OLETF組（P＞0.05），雖兩組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但也表明鹽酸二甲雙胍既改善了糖脂代謝紊亂又抑制了肝臟組織AQP9的表達(dá)。為研究鹽酸二甲雙胍治療肥胖與胰島素抵抗的生理機(jī)制提供了新證據(jù)。

綜上所述，肝臟組織的AQP9參與了肥胖和糖尿病的發(fā)生發(fā)展，鹽酸二甲雙胍既可以改善OLETF大鼠的糖脂代謝紊亂，又可以抑制AQP9 mRNA的表達(dá)。對(duì)水甘油通道蛋白中甘油代謝機(jī)制的研究，可以為治療代謝綜合征提供新方法。