生長抑制特異性轉(zhuǎn)錄本5和微小RNA-142-3p在重癥急性胰腺炎并急性呼吸窘迫綜合征病人血清中的表達及臨床意義

何亞麗，劉宏

重癥急性胰腺炎（severe acute pancreatitis，SAP）是一種發(fā)病快、進展迅速、病死率較高的內(nèi)科疾病，其可進一步發(fā)展為全身炎癥反應綜合征，導致多個器官和系統(tǒng)功能障礙。急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）是SAP的常見且嚴重的并發(fā)癥，也是SAP病人死亡的主要原因。目前，臨床ARDS的診斷標準基于柏林定義，但AR‐DS柏林診斷標準的臨床操作較為復雜，因此，急需簡便、快捷診斷SAP合并ARDS的生物學指標。長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lnc RNA）和微小RNA（microRNA，miRNA）是兩類小分子非編碼RNA，參與調(diào)控免疫和炎癥反應、細胞凋亡等過程，在炎癥性疾病的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用。生長抑制特異性轉(zhuǎn)錄本5（growth arrest specific tran‐script 5，GAS5）是一種lnc RNA，研究顯示，其在動脈粥樣硬化病人斑塊和冠狀動脈鈣化病人外周血中均表達升高，其高表達與IL-6等炎癥因子相關，是潛在的診斷和預測血管疾病的生物學指標。miR-142-3p是一種miRNA，參與類風濕性關節(jié)炎、牙周炎等炎癥性疾病的發(fā)展。目前，GAS5和miR-142-3p在SAP合并ARDS病人中的表達變化還未知。本研究主要探討了GAS5和miR-142-3p在SAP合并ARDS病人血清中的表達水平，并分析了其表達對該疾病的診斷價值和預后關系，以期為SAP合并ARDS疾病的診斷和預后判斷提供新思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料 從2017年2月至2018年12月平頂山市第一人民醫(yī)院就診的重癥急性胰腺炎（SAP）病人中，以隨機數(shù)字表法，按是否并發(fā)ARDS各抽樣約40例為研究對象，實抽樣共83例，均符合2015中國急性胰腺炎多學科診治共識意見中SAP的診斷標準。ARDS則符合2011年柏林標準。所有被抽樣病人既往均無肺部慢性疾病及心功能不全，排除妊娠病人。其中并發(fā)ARDS病人構(gòu)成ARDS組，41例，男27例，女14例，年齡（54.26±7.31）歲；未并發(fā)ARDS病人構(gòu)成非ARDS組，42例，男22例，女20例，年齡（56.81±7.49）歲。另選取同時期40例健康體檢者資料作為健康對照組，其中男20例，女20例，年齡（55.84±7.93）歲。三組性別、年齡比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。病人或其近親屬自愿簽署知情同意書。本研究符合《世界醫(yī)學協(xié)會赫爾辛基宣言》相關要求。

1.2 實時熒光定量PCR（RT-qPCR）檢測血清中GAS5和miR-142-3p表達水平 采集ARDS組、非ARDS組病人確診后及健康對照組清晨空腹靜脈血于抗凝管中，3 500 r/min離心10 min，取上清-80℃保存?zhèn)溆谩rizol試劑提取總RNA，微量核酸儀檢測RNA濃度后，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。然后以cDNA為模板，進行PCR擴增。PCR擴增程序：95℃預變性5 min，95℃變性10 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共35個循環(huán)。GAS5以GAPDH為內(nèi)參，miR-142-3p以U6為內(nèi)參，采用2法計算GAS5和miR-142-3p的相對表達水平。引物設計：GAS5正向5'-GCAAGCCTA ACTCAAGCCATT-3'，反 向5'-CTC CACCATTTCAACTTCCAG-3'；miR-142-3p正 向5'-TGT AGTGTTTCCTACTTTATGGA-3'，反 向 5'-CCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3'；GAPDH正 向5'-GTCCGTGACGTCGAAGTCGT-3'，反 向 5'-CG‐CAAAGTCGTGCGTGCAGATC-3'；U6正 向5'-CTC‐GCTTCGGCAGCACA-3'，反 向5'-AACGCTTCAC‐GAATTTGCGT-3'。

2 結(jié)果

2.1 GAS5和miR-142-3p在SAP合并ARDS病人血清中表達水平 與健康對照組比較，非ARDS組和ARDS組病人血清GAS5表達升高（P＜0.05），miR-142-3p表達水平降低（P＜0.05）。與非ARDS組比較，ARDS組病人血清GAS5表達升高（P＜0.05），miR-142-3p表達水平降低（P＜0.05）。見表1。

2.2 SAP合并ARDS病人血清中GAS5與miR-142-3p相關性 LncBase Experimental v.2生物信息學軟件顯示，GAS5與miR-142-3p的核苷酸序列存在結(jié)合位點。Pearson相關性分析結(jié)果顯示，SAP合并ARDS病人血清GAS5與miR-142-3p呈負相關（r=-0.697，P＜0.001）。結(jié)果如圖1所示。

表1 重癥急性胰腺炎三組血清生長抑制特異性轉(zhuǎn)錄本5（GAS5）與微小RNA-142-3p（miR-142-3p）表達水平比較/±s

圖1 重癥急性胰腺炎合并急性呼吸窘迫綜合征病人血清中生長抑制特異性轉(zhuǎn)錄本5（GAS5）與微小RNA-142-3p（miR-142-3p）相關性：A為GAS5與miR-142-3p的核苷酸序列存在的結(jié)合位點；B為GAS5與miR-142-3p相關性

2.3 血清GAS5和miR-142-3p對SAP合并ARDS的診斷價值 分別探討血清GAS5和miR-142-3p對SAP合并ARDS的診斷價值，并采用SPSS的聯(lián)合應用理論模式（LogP模式），建立ROC分析模型。分析結(jié)果：GAS5與miR-142-3p聯(lián)合檢測診斷SAP合并ARDS的靈敏度、特異度及曲線下面積（area under the curve，AUC）均高于GAS5、miR-142-3p的單獨應用（Z分別為2.938，2.713，P分別為0.003，0.007）。結(jié)果如圖2和表2所示。

2.4 SAP合并ARDS組病人的血清GAS5和miR-142-3p表達水平與預后關系 41例SAP合并ARDS組病人，經(jīng)治療后26例存活，15例死亡。與存活病人比較，死亡病人SAP合并ARDS病人血清GAS5表達水平升高（P＜0.05），miR-142-3p表達水平降低（P＜0.05）。見表3。

圖2 生長抑制特異性轉(zhuǎn)錄本5（GAS5）、微小RNA-142-3p（miR-142-3p）及二者聯(lián)合檢測診斷重癥急性胰腺炎合并急性呼吸窘迫綜合征的受試者工作特征曲線（ROC）

表2 生長抑制特異性轉(zhuǎn)錄本5（GAS5）、微小RNA-142-3p（miR-142-3p）及二者聯(lián)合檢測診斷重癥急性胰腺炎合并急性呼吸窘迫綜合征的受試者工作特征曲線（ROC）分析

表3 重癥急性胰腺炎合并急性呼吸窘迫綜合征存活和死亡病人生長抑制特異性轉(zhuǎn)錄本5（GAS5）、微小RNA-142-3p（miR-142-3p）表達水平/±s

2.5 logistic回歸分析 建立非條件logistic回歸模型：（1）以SAP病人組為樣本（83例）：以是否并合并ARDS為因變量，賦值1=合并，0=未。以前述各研究過程中P＜0.10的指標/因素為自變量，即GAS5和miR-142-3p兩指標?；貧w過程采用逐步后退法，以進行自變量的選擇和剔除，設定α=0.10，α=0.05。兩個指標均為連續(xù)變量，直接輸入?；貧w結(jié)果：GAS5和miR-142-3p均被保留入回歸模型（P＜0.05）。提示GAS5和miR-142-3p是SAP合并ARDS的顯著影響因素（P＜0.05）。見表4。

表4 重癥急性胰腺炎合并急性呼吸窘迫綜合征（ARDS）logistic回歸分析結(jié)果

（2）以SAP合并ARDS組病人為樣本（41例），以預后情況（是否死亡）為應變量，賦值1=死亡，0=存活。以GAS5和miR-142-3p為自變量，仿上行l(wèi)ogis‐tic回歸。結(jié)果：GAS5和miR-142-3p也均被保留入回歸模型（P＜0.05）。提示GAS5和miR-142-3p是SAP合并ARDS病人預后的顯著影響因素（P＜0.05）。見表4。

3 討論

ARDS是SAP的嚴重并發(fā)癥，嚴重威脅病人生命健康。目前，ARDS缺乏簡便快捷的臨床診斷指標，尋找診斷SAP合并ARDS的生物學指標具有重要意義。Lnc RNA是一類長度超過200個核苷酸的小分子非編碼RNA，其可在轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后、表觀遺傳等方面調(diào)控基因的表達，影響細胞的增殖、凋亡、分化等生物學行為，與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關。miRNA是一類長度約為18～25個核苷酸的小分子單鏈非編碼RNA，其也參與調(diào)控炎癥反應，與炎性疾病的發(fā)生發(fā)展息息相關。研究表明，lnc RNA和miRNA在血清中具有高度穩(wěn)定性，且血清作為生物檢測樣本具有取材方便、無創(chuàng)傷性、可連續(xù)體外檢測等優(yōu)點，因此，血清lnc RNA和miRNA可作為疾病診斷和預后判斷的生物學指標。

GAS5可參與調(diào)控炎癥反應，在高血壓、動脈粥樣硬化等多種炎癥性疾病發(fā)展進程中起重要作用。李春玲等研究顯示，多發(fā)性骨髓瘤病人血清GAS5表達升高，與其診斷多發(fā)性骨髓瘤的AUC為0.782，可用于輔助診斷多發(fā)性骨髓瘤。陳桐等研究顯示，GAS5在糖尿病病人血清中表達降低，其診斷糖尿病的靈敏度為62.86%，特異度為77.78%，AUC為0.730，可作為診斷糖尿病的生物標志物。但目前，還未見GAS5表達與SAP合并ARDS疾病發(fā)生發(fā)展關系的相關報道。本研究顯示，SAP合并ARDS病人血清中GAS5表達高于單純SAP病人和健康健康對照組，其診斷SAP合并ARDS的靈敏性、特異度及ACU分別為82.5%、82.5%和0.805，是該疾病的獨立影響因素，提示其對該疾病具有較好的診斷價值。本研究還顯示，SAP合并ARDS死亡的病人血清GAS5水平明顯高于未死亡病人，提示GAS5高表達的病人預后較差，可作為預后判斷的生物學指標。

Lnc RNA與miRNA存在調(diào)控關系。生物信息學軟件預測顯示，GAS5與miR-142-3p的核苷酸序列存在結(jié)合位點，提示miR-142-3p可能是GAS5靶基因。研究顯示，miR-142-3p在骨關節(jié)炎小鼠關節(jié)軟骨組織中表達降低，上調(diào)miR-142-3p表達可降低脂多糖處理的軟骨細胞凋亡及炎性因子IL-1、IL-6和腫瘤壞死因子α（TNF-α）生成，是骨關節(jié)炎治療的潛在分子靶標。上調(diào)miR-142-3p可降低博來霉素誘導的MLE-12細胞凋亡及炎癥因子IL-1和TNF-α表達，為特發(fā)性肺纖維化治療提供了新的治療策略。但目前，miR-142-3p在SAP合并ARDS病人血清中的表達及其對該疾病診斷和預后的關系還未知。本研究顯示，SAP合并ARDS病人血清中miR-142-3p表達低于單純SAP病人和健康健康對照組，提示miR-142-3p可能參與SAP合并ARDS疾病的發(fā)生發(fā)展，分析原因可能為miR-142-3p表達水平降低可參與調(diào)控肺泡巨噬細胞凋亡及炎性因子的表達。提示GAS5可能通過靶向調(diào)控miR-142-3p表達從而參與SAP合并ARDS發(fā)生過程。ROC曲線分析顯示，miR-142-3p診斷SAP合并AR‐DS的靈敏性、特異度及ACU分別為84.4%、77.5%和0.859，具有較高的診斷價值。本研究還顯示，SAP合并ARDS死亡的病人血清miR-142-3p水平明顯低于未死亡病人，提示miR-142-3p低表達的病人預后較差。本研究Pearson相關性分析結(jié)果顯示，SAP合并ARDS病人血清中GAS5與miR-142-3p表達呈負相關，二者聯(lián)合檢測診斷對SAP合并ARDS的靈敏性、特異度及ACU分別為95.6%、92.5%和0.925，均顯著高于GAS5或miR-142-3p單獨診斷，提示聯(lián)合檢測血清GAS5與miR-142-3p對SAP合并ARDS診斷具有更高價值。

綜上所述，SAP合并ARDS病人血清中GAS5呈高表達，而miR-142-3p呈低表達，且二者間呈負相關，聯(lián)合檢測GAS5與miR-142-3p對該疾病具有較高診斷價值。血清GAS5、miR-142-3p是SAP合并ARDS發(fā)生發(fā)展的影響因素，可能為該疾病的診斷和預后判斷提供了新的生物學指標。