成纖維細胞生長因子受體2剪切突變體Ⅲc在膀胱癌中的表達以及與膀胱癌253J細胞多柔比星耐藥的關(guān)系

李紀華，景治安，毛長青，劉彥軍，孔春艷

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤。中國男性膀胱癌發(fā)病率高于女性，并且逐年上升。泌尿系腫瘤是膀胱癌最常見的亞型，占膀胱癌的90%以上。根據(jù)臨床和病理類型，膀胱癌主要分為兩類：淺表非肌層浸潤性膀胱癌和進行性肌肉浸潤性膀胱癌?；熓前螂装┑闹匾委煼椒ㄖ?。然而，腫瘤細胞通常以多種方式獲得耐藥性，使化療效果較差。此外，在腫瘤細胞獲得耐藥性后，其他生物學行為可能會發(fā)生變化，這可能對腫瘤復發(fā)和進展產(chǎn)生重要影響。成纖維細胞生長因子受體2（FGFR2）剪切突變體FGFR2Ⅲc在膀胱癌細胞中的表達促進間充質(zhì)-上皮細胞轉(zhuǎn)變（MET），并使病灶轉(zhuǎn)移能力增強。本研究選取143例膀胱癌組織標本，探討FGFR2Ⅲc與膀胱癌發(fā)展和膀胱癌253J細胞對多柔比星耐藥性的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016年1月至2018年1月鄭州市第一人民醫(yī)院保存的膀胱癌組織標本143例，納入標準：（1）均經(jīng)病理學確診；（2）病人臨床資料完整，對標本保存及用途知情同意；（3）組織標本獲取前未行放化療等治療。排除標準：（1）合并有其他惡性腫瘤；（2）復治病人。同時選取正常膀胱組織70例作為對照（來自開放手術(shù)的良性前列腺增生病人），膀胱癌組和正常膀胱組病人一般資料比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表1。組織取出后置于福爾馬林固定液中。本研究符合《世界醫(yī)學協(xié)會赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。

表1 膀胱癌組和正常膀胱組一般資料比較

1.2 膀胱癌253J細胞培養(yǎng)及耐藥細胞株建立

人膀胱癌253J細胞系由西安交通大學研究所提供，用含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，建立多柔比星耐藥253J/DOX細胞系。在實驗前，將253J/DOX細胞在不含多柔比星的正常培養(yǎng)基中培養(yǎng)1周。253J細胞系先在低濃度多柔比星（2×10g/L）的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，穩(wěn)定生長（3×10g/L）后逐漸增加藥物濃度，6個月后，在含有1×10g/L多柔比星的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

1.3 MTT法檢測

用胰蛋白酶消化321J細胞和253J/DOX細胞后，計數(shù)并調(diào)節(jié)細胞濃度，并以5 000細胞/孔的濃度接種在96孔板中用于常規(guī)過夜培養(yǎng)。棄去培養(yǎng)上清液，用含有不同濃度多柔比星的培養(yǎng)基培養(yǎng)，設(shè)置5個平行孔。48 h后，加入PBS 200μL，洗滌3次。每孔加入20μL MTT，在培養(yǎng)箱中孵育4 h；吸出PBS，每孔加入150μL二甲基亞砜（DMSO）。酶標儀波長設(shè)置為490 nm檢測吸光度。通過SPSS軟件計算半數(shù)最大抑制濃度（IC）。

1.4 細胞劃痕試驗 在調(diào)節(jié)253J細胞和253J/DOX細胞的細胞濃度后，將細胞以5×10細胞/孔的密度接種在6孔板中，用PBS洗滌細胞3次，并加入無血清DMEM培養(yǎng)基中24 h。然后用200μL槍頭垂直6孔板平面畫橫線，用PBS洗滌細胞3次，然后加入無血清培養(yǎng)基。在劃痕后0、8、16 h記錄照片。通過測量多個觀察點的劃痕寬度來計算劃痕愈合率。

1.5 實時熒光定量聚合酶鏈式反應（qRT-PCR）檢測 將逆轉(zhuǎn)錄反應產(chǎn)物濃度調(diào)節(jié)至0.2 g/L，通過SYBRGreen I嵌合熒光法在樣品上樣1μL進行實時PCR反應。GAPDH正向引物為5'-AT‐GGGGAAGGTGAAGGTCGG-3'，反向引物為5'-GACGGTGCCATGGAATTTGC-3'；FGFR2Ⅲc正向引物是5'-CCGGTGTTAACACCACGGACAAA-3'，反向引物是5'-CA GAACTGTCAACCATGCAGAGT‐GAAA-3'。

2 結(jié)果

2.1 膀胱癌組和正常膀胱組FGFR2Ⅲc mRNA表達比較 膀胱癌組FGFR2Ⅲc mRNA相對表達量（1.782±0.342）明顯高于正常膀胱組（1.082±0.200），差異有統(tǒng)計學意義（t=15.839，P=0.000）。

2.2 FGFR2Ⅲc mRNA表達與膀胱癌臨床病理特征關(guān)系 病理分級高級別、病理分期T2～T4期FG‐FR2Ⅲc mRNA相對表達量明顯高于低級別和Ta～T1期（P＜0.05），見表2。

2.3 不同病理分級、病理分期病人性別、年齡比較 不同病理分級、病理分期病人性別、年齡比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表3。

2.4 253J和耐多柔比星253J細胞FGFR2Ⅲc mRNA相對表達量等比較 耐多柔比星253J細胞FGFR2Ⅲc mRNA相對表達量和最大半數(shù)抑制濃度明顯高于253J細胞（P＜0.05），見表4。

2.5 253J和耐多柔比星253J細胞遷移率比較 耐多柔比星253J細胞遷移率（23.02±3.12）%明顯低于253J細胞（64.48±2.01）%（t=32.291，P=0.000）。

2.6 253J和耐多柔比星253J細胞凋亡率比較 耐多柔比星253J細胞凋亡率（23.22±5.50）%明顯低于253J細胞（43.32±4.44）%（t=20.331，P=0.000）。

表2 膀胱癌組織143例成纖維細胞生長因子受體2的剪切突變體Ⅲc（FGFR2Ⅲc）mRNA表達與膀胱癌病理特征關(guān)系/±s

表3 不同病理分級、病理分期病人性別、年齡比較

表4 253J和耐多柔比星253J細胞成纖維細胞生長因子受體2的剪切突變體Ⅲc（FGFR2Ⅲc）mRNA相對表達量比較/±s

3 討論

化療在膀胱癌的治療中起著重要作用。然而，腫瘤細胞可能由于天然表達或長期受到化學治療藥物的作用獲得各種抗藥性基因，從而降低治療效果甚至引起化療失敗。由多藥抗性基因MDR1編碼的蛋白質(zhì)產(chǎn)物P-gp是具有多種底物的轉(zhuǎn)運蛋白，并且是腫瘤中臨床化學抗性的主要原因之一。P-gp在膀胱癌等腫瘤中的表達可導致腫瘤細胞對許多傳統(tǒng)化療藥物產(chǎn)生耐藥性，并與病人預后不良密切相關(guān)。已有研究通過增加濃度方法建立了人膀胱癌253J的253J/DOX耐藥細胞系，與親代細胞相比，253J/DOX細胞中P-gp呈現(xiàn)高表達并且對多柔比星具有顯著耐藥性，該結(jié)果表明多柔比星耐藥253J細胞的耐藥性表型與P-gp相關(guān)，耐藥細胞系的建立可以為研究膀胱癌的化療耐藥性和腫瘤發(fā)展過程提供可靠的細胞模型。

FGFR是酪氨酸激酶受體，其通過與其相應的配體成纖維細胞生長因子（FGF）結(jié)合而介導細胞信號傳導。FGFR在腫瘤發(fā)展中起關(guān)鍵作用，并且研究已經(jīng)證實靶基因異常是由點突變，擴增和染色體易位引起的。在腫瘤進展等過程中，上皮產(chǎn)生的細胞可逐漸喪失上皮細胞的特征而獲得間質(zhì)細胞的相關(guān)表型，這種現(xiàn)象稱為上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）。腫瘤細胞的局部浸潤能力增強，但是向遠處轉(zhuǎn)移的能力減弱。間質(zhì)腫瘤細胞在該過程中的主要作用是通過降解細胞外基質(zhì)來幫助上皮腫瘤細胞實現(xiàn)遠處轉(zhuǎn)移。然而，在高級膀胱癌組織中，腫瘤細胞通常通過EMT失去上皮表型。Chaffer等發(fā)現(xiàn)FGFR2裂解突變體FGFR2Ⅲc在高級膀胱癌細胞中的表達使腫瘤細胞通過MET恢復上皮表型，然后形成腫瘤轉(zhuǎn)移病灶。

本次研究結(jié)果顯示，膀胱癌組和正常膀胱組FGFR2Ⅲc mRNA的表達明顯高于正常膀胱組。差異具有統(tǒng)計學意義。提示膀胱癌細胞可通過上調(diào)FGFR2Ⅲc表達獲得腫瘤病灶向遠處轉(zhuǎn)移。FGFR2Ⅲc mRNA的表達與膀胱癌的臨床病理特征相關(guān)，F(xiàn)GFR2Ⅲc mRNA在高級病理分級和病理分期T2～T4中的相對表達顯著高于低級和Ta-T1期。這表明FGFR2Ⅲc mRNA表達與腫瘤分期和分級密切相關(guān)，表明FGFR2Ⅲc參與膀胱癌的發(fā)病機制。FG‐FR2Ⅲc mRNA的相對表達和253J和耐多柔比星253J細胞的最大半抑制濃度顯著高于253J細胞。與253J和多柔比星耐藥的253J細胞的細胞遷移率相比，多柔比星耐藥的253J細胞的遷移率和凋亡率顯著低于253J細胞。分析原因是253J細胞對多柔比星產(chǎn)生耐藥性后，通過MET重新得到上皮細胞表型，使體外遷移能力下降。據(jù)推測，EMT和MET都是腫瘤細胞衍生的化療耐藥表型中常見的現(xiàn)象。在臨床化療期間，腫瘤細胞經(jīng)歷這種表型變化，導致局部上皮細胞和間質(zhì)細胞共存，這促進腫瘤細胞惡性生長和遠處轉(zhuǎn)移。在高級別膀胱腫瘤中，化療后耐藥細胞中FGFR2Ⅲc的高表達可能導致一些腫瘤細胞通過MET重新獲得上皮表型，進而形成轉(zhuǎn)移灶。

綜上所述，F(xiàn)GFR2Ⅲc mRNA在膀胱癌組織中表達上調(diào)，與病理分級和病理分期有關(guān)，同時與253J細胞耐多柔比星、遷移有一定關(guān)系。