siRNA靶向沉默人多梳基因2對鼻咽癌細(xì)胞增殖及細(xì)胞周期的影響

吳梅，楊麗，再努拉·艾未肉拉，唐亮

鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma，NPC）是常見的頭頸部惡性腫瘤，東南亞和我國華南地區(qū)是高發(fā)區(qū)。鼻咽癌對放化療敏感，腫瘤局部和淋巴結(jié)復(fù)發(fā)病人預(yù)后差，與腫瘤細(xì)胞的耐藥和惡性增殖密切相關(guān)，探索相關(guān)的鼻咽癌增殖相關(guān)的驅(qū)動基因及信號通路，將有利于推進(jìn)鼻咽癌的分子靶向治療。

人多梳基因（human polycomb，HPC）是多梳基因家族（The Polycomb Group of Protein，PcG）的成員，HPC有三個亞型，HPC1，HPC2，HPC3。HPC2又名染色框同源物4（chromobox homolog 4，CBX4），該基因定位于17q25.3，在不同腫瘤細(xì)胞中mRNA表達(dá)豐度差別很大，如在骨肉瘤（U2-OS）和結(jié)腸腺癌（SW480）含量高，在小細(xì)胞癌中的表達(dá)量卻很低。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，鼻咽癌組織中HPC2高表達(dá)與病人不良預(yù)后密切相關(guān)，但其在鼻咽癌發(fā)生發(fā)展中的作用尚不清楚。因此，本研究旨在探討HPC2在鼻咽癌細(xì)胞增殖中的作用及對細(xì)胞周期的影響。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞和實驗試劑

人鼻咽癌細(xì)胞株5-8F由江西省委腫瘤轉(zhuǎn)移與精準(zhǔn)治療重點實驗室饋贈。RP‐MI-1640培養(yǎng)基和RNAi Max均購自Invitrogen公司。陰性對照siRNA及HPC2靶序列siRNA購自廣州銳博公司，#1-siRNA序 列（正向鏈）5’-AGAUGAAGAUAGUCAAGAA-3’；（反 向 鏈）5-UUCUUGACUAUCUUCA

UCU-3；#2-siRNA序 列（正向鏈）5’-AGUAC‐GAGCUCAACAGCAA-3’；（反 向 鏈）5-UUGCU‐GUUGAGCUCGUACU-3；scrambled為無干擾功能的對照序列。Nexcelom全自動計數(shù)儀進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)。

1.2 實驗方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 復(fù)蘇5-8F細(xì)胞，使用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，在5%二氧化碳、37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前1 d，胰酶消化對數(shù)生長期的細(xì)胞，接種細(xì)胞于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基的6孔板，使細(xì)胞在轉(zhuǎn)染日能夠達(dá)到70%融合度。采用細(xì)胞瞬時轉(zhuǎn)染（轉(zhuǎn)染試劑RNAi max），實驗分為對照組（scrambled）（轉(zhuǎn)染無功能對照siRNA）和兩個si-RNA組（轉(zhuǎn)染靶向HPC2的特異性siRNA）。各孔加入Optimum培養(yǎng)基1.5 mL，各孔按用EP管配制如下轉(zhuǎn)染液體系，A管：RNAimax 5μL+Optimum 250μL，輕彈混勻孵育5 min，B管：siRNA 5μL+Optimum 250μL，輕彈混勻并孵育5 min，A管液體加入到B管中，混勻后在室溫條件繼續(xù)孵育20 min。緩慢滴加入相應(yīng)的細(xì)胞孔中，將6孔板輕微水平晃動，搖勻轉(zhuǎn)染液。放置入5%二氧化碳，37℃孵育箱中，間隔6 h后換液，DMEM培養(yǎng)基中加入10%胎牛血清繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.2 RT-qPCR及Western blot法檢測HPC2的siRNA干擾效率 RNA提取和RT-qPCR程序簡要步驟，用TRIzol法（Thermo Fisher Scientific，Inc.）提取細(xì)胞系總RNA，紫外分光光度計測RNA的純度和濃度。利用逆轉(zhuǎn)錄酶合成第一鏈cDNA。HPC2引物序列：正向引物5’-GCAGAGTGGAGTATCTGGTG

A-3’；反 向 引 物5’-AGCTTGGCACGGTTGT‐CAG-3’；GAPDH引物序列：正向引物5’-GGAGC‐GAGATCCCTCCAAAAT-3’反向引物5’-GGCTGTT‐GTCATACTTCTCATGG-3’。引物均購自中美泰和生物公司。在基因擴(kuò)增儀CFX96（Bio-Rad Laborato‐ries，Inc）實 時 熒 光 定 量PCR檢 測，使 用SYBR?Green mix（Takara生物公司）進(jìn)行qPCR反應(yīng)，反應(yīng)的條件：在95℃，預(yù)變性15 min，共40個循環(huán)（95℃變性15 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s）。擴(kuò)增產(chǎn)物用2法計算，每個樣品校準(zhǔn)到內(nèi)參基因GAPDH的相對表達(dá)水平。

檢測轉(zhuǎn)染siRNA-HPC2后的5-8F細(xì)胞的HPC2蛋白表達(dá)，簡要步驟如下：細(xì)胞經(jīng)RIPA裂解液充分裂解后，收集并提取細(xì)胞的總蛋白，采用BCA法（試劑盒購自南京凱基Cat.no，23227）測定樣品蛋白含量；配平后用上樣緩沖液（4×loading buffer）加熱變性，上樣量為每孔30μg，經(jīng)10%SDS-PAGE電泳分離，電轉(zhuǎn)膠中蛋白至PVDF膜，將膜用5%脫脂奶粉在室溫下封閉1 h，用PBST清洗膜，一抗稀釋液配抗體HPC2（Bethly公司，Cat.no，A302-355A；1∶1000）和內(nèi)參β-Actin（Bioworld公司，Cat.no，AP0060；1∶2 000），加入至孵育盒中的膜條帶上，4℃孵育過夜，充分洗膜，加稀釋的二抗（1∶10 000）室溫孵育1 h，搖床上洗膜3次，用化學(xué)發(fā)光法（ECL：Cat no.P0018F，碧云天公司）顯影后記錄呈圖片，用Image lab軟件比較蛋白相對表達(dá)量，實驗過程重復(fù)3次。

1.2.3 CCK8法檢測細(xì)胞增殖活性 將對照組和兩組轉(zhuǎn)染siRNA后的5-8F細(xì)胞懸液以每孔1×10接種于96孔板，每組5個復(fù)孔，于5%二氧化碳，37℃恒溫箱培養(yǎng)，分別收集0、24、48、72 h和96 h共5個時間點的細(xì)胞，檢測前用多孔移液器在每孔中加入CCK-8試劑（Cat no.C0038，碧云天公司）10μL，培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2 h，多功能酶標(biāo)儀測定450 nm波長處的吸光度（OD）值，實驗重復(fù)3次。

1.2.4 平板克隆形成實驗 將每組細(xì)胞按3×10個/孔接種于6孔培養(yǎng)板，每組設(shè)3個復(fù)孔，2周后觀察克隆形成情況。皿底的細(xì)胞用PBS輕柔清洗，經(jīng)4%多聚甲醛固定，1%結(jié)晶紫室溫染色1 h，經(jīng)PBS潤洗、干燥后，在顯微鏡下（放大倍數(shù)，×100）計數(shù)細(xì)胞克隆數(shù)并拍照，≥50個細(xì)胞計為1個克隆，計數(shù)克隆形成總數(shù)，實驗重復(fù)3次。

1.2.5 細(xì)胞周期測定 三組5-8F細(xì)胞分別接種于6孔培養(yǎng)板，采用胸腺嘧啶核苷雙阻斷法將各組細(xì)胞同步化至G0期，解除阻滯后，分別收集各組在0、3、6 h共3個時間點的細(xì)胞，離心，去掉上清液，PBS洗滌后，輕柔重懸呈單細(xì)胞懸液，將各組細(xì)胞固定于70%預(yù)冷乙醇中，在-20℃冰箱過夜。檢測前，去除固定液，加入4 mL的PBS混勻，離心棄上清，加入含有50μg/mL碘化丙啶PI，RNase（50μg/mL）Triton（1%通透細(xì)胞膜）液200μL，室溫避光孵育15 min。上機(jī)檢測各組細(xì)胞周期分布，實驗重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 鼻咽癌5-8F細(xì)胞中siRNA轉(zhuǎn)染效率及細(xì)胞活性檢測

#1siRNA，#2 siRNA轉(zhuǎn)染組與對照組5-8F細(xì)胞HPC2的mRNA相對表達(dá)量分別為（0.94±0.05）（0.25±0.06），（0.20±0.04），與對照組相比，兩個轉(zhuǎn)染組HPC2的mRNA豐度降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=199.909，P=0.000）。相應(yīng)地，轉(zhuǎn)染組的HPC2蛋白表達(dá)水平較對照組下調(diào)。見圖1。

兩個轉(zhuǎn)染組在第2、3、4、5天細(xì)胞活性的吸光度OD值 分 別 為（0.147±0.04、0.150±0.05），（0.255±0.03、0.200±0.05），（0.436±0.04、0.327±0.05），（0.631±0.03、0.479±0.04），均低于對照組，尤其在第4、5天的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。

圖1 Western-blotting檢測siRNA對各組5-8F細(xì)胞HPC2蛋白表達(dá)

2.2 平板克隆形成

#1siRNA，#2 siRNA轉(zhuǎn)染組每孔細(xì)胞克隆形成數(shù)量分別為（65.0±16.5）個/孔和（52.5±14.6）個/孔，低于scrambled對照組（182.6±17.3）個/孔，差 異 有 統(tǒng) 計 學(xué) 意 義（F=59.644，P=0.000）。

2.3 細(xì)胞周期G1/S時相轉(zhuǎn)換

利用流式細(xì)胞儀分別檢測三組5-8F細(xì)胞在0、3、6 h時間點的周期分布。分析顯示：在0點時各組細(xì)胞約95%同步化至G1期。在3h時間點各組G1/S時相轉(zhuǎn)換逐漸增多，在6 h時間點顯示：對照組、#1siRNA，#2 siRNA轉(zhuǎn)染組處于G1期的細(xì)胞所占的比例分別為（8.56±0.91）%、（26.57±1.29）%、（23.41±1.01）%；處于S期分別為（20.34±0.89）%、（32.48±1.03）%、（30.50±0．93）%；處于G2/M期分別為（71.97±1.20）%、（41.34±1.26）%、（46.38±1.24）%。轉(zhuǎn)染組與對照組相比，處于G1期的細(xì)胞占比多，轉(zhuǎn)染組G1/S時相轉(zhuǎn)換減緩，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=236.968，P=0.000）。

3 討論

腫瘤細(xì)胞無限增殖和細(xì)胞周期調(diào)節(jié)紊亂是惡性腫瘤的重要特征，PcG多梳蛋白組在細(xì)胞自我更新，細(xì)胞周期調(diào)控，腫瘤形成中發(fā)揮著重要作用。HPC2是重要的PcG成員，編碼蛋白含558個氨基酸，羧基端是該蛋白發(fā)揮抑制功能必需的結(jié)構(gòu)域。據(jù)報道HPC2生理功能包括調(diào)節(jié)胚胎定向發(fā)育，胸腺上皮增殖，維持胸腺功能，介導(dǎo)造血干細(xì)胞更新分化，參與脂肪組織熱生成。HPC2與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。

小泛素樣修飾分子E3（small ubiquitin-like mod‐ifier E3，SUMO E3）具有泛素連接酶活性，這是HPC2區(qū)別于其他PcG蛋白的一個重要特點。HPC2對底物有SUMO化作用，可以介導(dǎo)HIF-1α的SUMO化，誘導(dǎo)肝細(xì)胞癌血管生成，促進(jìn)腫瘤進(jìn)展。介導(dǎo)KDM5B翻譯后的SUMO化修飾，抑制細(xì)胞周期及DNA修復(fù)基因的功能。

越來越多的證據(jù)表明，HPC2在不同腫瘤中的作用具有腫瘤特異性且功能極其復(fù)雜。HPC2能促進(jìn)肝癌細(xì)胞肺轉(zhuǎn)移；與骨肉瘤的生長密切相關(guān)；通過調(diào)節(jié)BMI1促進(jìn)肺癌增殖轉(zhuǎn)移。CBX4可以在轉(zhuǎn)錄水平發(fā)揮基因轉(zhuǎn)錄抑制作用，如乳腺癌中結(jié)合到mi137啟動子抑制其表達(dá)，激活Notch1通路，促進(jìn)腫瘤生長轉(zhuǎn)移。與此相反的是，CBX4通過招募HDAC3至RUNX2啟動子抑制其轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而抑制腸癌轉(zhuǎn)移。本研究發(fā)現(xiàn)：通過siRNA靶向敲低鼻咽癌5-8F細(xì)胞內(nèi)源性HPC2后，細(xì)胞的增殖活性較對照顯著降低。腫瘤細(xì)胞克隆形成率反映的是細(xì)胞群體依賴性和增殖能力兩個重要性狀，本研究發(fā)現(xiàn)沉默HPC2組的細(xì)胞克隆形成數(shù)目明顯減少，表明鼻咽癌5-8F的增殖能力減弱。

HPC2可以通過多途徑介導(dǎo)惡性腫瘤細(xì)胞周期調(diào)控。miR-497-5p通過直接靶向CBX4，降低CDK2和細(xì)胞周期蛋白A2的表達(dá)，將細(xì)胞阻滯于S期，從而抑制宮頸癌細(xì)胞增殖。p38MAPK通過磷酸化HPC2介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄抑制，調(diào)節(jié)細(xì)胞周期進(jìn)程，參與了砷酸鹽誘導(dǎo)骨肉瘤U2OS細(xì)胞G2期阻滯。本研究流式細(xì)胞周期檢測發(fā)現(xiàn)：HPC2沉默后，5-8F細(xì)胞周期G1/S時相轉(zhuǎn)換較對照組明顯減緩，以上證據(jù)表明HPC2參與了鼻咽癌細(xì)胞的增殖及周期調(diào)控。在鼻咽癌中HPC2的下游靶基因以及具體信號調(diào)控機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。

總之，本研究結(jié)果顯示靶向沉默HPC2表達(dá)抑制了鼻咽癌細(xì)胞增殖及克隆形成能力，延緩了G1/S時相轉(zhuǎn)換。本研究的局限性是只選5-8F細(xì)胞系進(jìn)行了初步的體外實驗。今后的實驗將構(gòu)建HPC2過表達(dá)的鼻咽癌細(xì)胞模型，進(jìn)一步在其他表型方面探索，最終通過動物體內(nèi)實驗驗證HPC2在鼻咽癌中的生物學(xué)功能，為鼻咽癌的分子靶向治療提供實驗依據(jù)。