miR-187通過(guò)靶向胰島素生長(zhǎng)因子-1受體基因?qū)θ巳橄侔┘?xì)胞增殖和凋亡的影響

孫建立，馬志強(qiáng)

乳腺癌（breast cancer，BC）是全球女性面臨的最嚴(yán)重威脅之一，乳腺癌的發(fā)病率和死亡率分別高達(dá)24.2%和15%，在女性惡性腫瘤中排名第一。目前治療乳腺癌的主要方式是外科手術(shù)聯(lián)合放療及化療等綜合治療，但患者的預(yù)后仍較差。并且，乳腺癌發(fā)生和進(jìn)展的分子機(jī)制尚不清楚，給診斷和治療帶來(lái)了巨大的挑戰(zhàn)。近年來(lái)，癌癥的分子標(biāo)志已成為乳腺癌研究的重要影響因素。微小RNA（microRNA，miRNA）被認(rèn)為是一類(lèi)新的內(nèi)源性分子，是非蛋白質(zhì)編碼的小RNA分子，可通過(guò)直接切割靶mRNA或通過(guò)抑制其翻譯來(lái)負(fù)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄后基因的表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，異常的miRNA表達(dá)與各種人類(lèi)癌癥如乳腺癌、結(jié)腸癌和肺癌等腫瘤的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)。已有研究證實(shí)，miR-187在肺癌、胃癌、卵巢癌等中異常表達(dá)，參與腫瘤的進(jìn)展，與患者預(yù)后及總體生存率密切相關(guān)。近期報(bào)道顯示，miR-187在乳腺癌中表達(dá)下調(diào)，但關(guān)于其在乳腺癌中的作用尚不清楚。胰島素生長(zhǎng)因子-1受體（insulinlike growth factor-1 receptor，IGF-1R）基因與多種惡性腫瘤進(jìn)展有關(guān)，有研究顯示，其可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、分化、周期進(jìn)程還可抑制細(xì)胞凋亡。楊曉民等人發(fā)現(xiàn)，IGF-1R基因可促進(jìn)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞增殖和遷移。近期Han等研究發(fā)現(xiàn)，miR-187通過(guò)靶向肝細(xì)胞癌中的IGF-1R抑制腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。提示miR-187可能通過(guò)靶向IGF-1R在乳腺癌中發(fā)揮作用。因此，本研究旨在探究miR-187靶向IGF-1R調(diào)控乳腺癌細(xì)胞增殖和凋亡的分子機(jī)制，以期為乳腺癌的靶向治療提供分子標(biāo)志。

1 材料與方法

1.1 材料

人正常乳腺上皮細(xì)胞株HBL-100及人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231、MDA-MB-453、MCF-7、SK-BR-3（美國(guó)ATCC細(xì)胞庫(kù)）；DMEM培養(yǎng)基（美國(guó)Hyclone公司）；青霉素-鏈霉素、胎牛血清（杭州四季青生物材料有限公司）；RNA提取試劑盒、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000（美國(guó)Invitrogen公司）；miR-187 mimics及對(duì)照mimics-NC（上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、qRT-PCR檢測(cè)試劑盒（日本TaKaRa公司）；MTT試劑（美國(guó)Sigma公司）；Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（美國(guó)BD公司）；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒（美國(guó)Pro‐mega公司）；細(xì)胞裂解液、BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒、ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒（碧云天生物技術(shù)研究所）；PCNA抗體、Cleaved Caspase-3抗體、IGF-1R抗體和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗（美國(guó)Abcam公司）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

常規(guī)復(fù)蘇人正常乳腺上皮細(xì)胞HBL-100和人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231、MDA-MB-453、MCF-7、SK-BR-3，分別采用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基（含1%青霉素-鏈霉素雙抗）培養(yǎng)，并放置在體積分?jǐn)?shù)5%二氧化碳、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每天觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，及時(shí)更換新鮮培養(yǎng)基，收集處于對(duì)數(shù)增殖期的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染和分組

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞以胰酶消化，計(jì)數(shù)后接種到6孔板中，接種密度為2×10個(gè)/孔，于37℃繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)匯合度達(dá)60%時(shí)，利用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑分別將miR-187 mimics、陰性對(duì)照mimics-NC轉(zhuǎn)染至MDA-MB-231細(xì)胞，分別記為miR-187組和miR-NC組，同時(shí)設(shè)置未轉(zhuǎn)染的MDAMB-231細(xì)胞為空白對(duì)照組。每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，各組細(xì)胞在37℃培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞測(cè)定相應(yīng)指標(biāo)。

1.4 qRT-PCR檢測(cè)細(xì)胞中miR-187的相對(duì)表達(dá)水平

分別收集處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HBL-100、MDAMB-231、MDA-MB-453、MCF-7、SK-BR-3細(xì)胞以及轉(zhuǎn)染48 h后各組MDA-MB-231細(xì)胞，分別參照RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取細(xì)胞中總RNA，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，并以cDNA為模板，以U6為內(nèi)參，使用qRT-PCR檢測(cè)試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件為：94℃4 min，94℃30 s，56℃30 s，72℃20 s，共設(shè)40個(gè)循環(huán)。采用2法計(jì)算各細(xì)胞中miR-187相對(duì)表達(dá)水平。所用引物如下：

U6-F 5，-TGCGGGTGCTCGCTTCGGCAGC-3’，U6-R 5，-CCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3’。miR-187-F 5，-TCGTGGGTCGTGTCTTGTGTTGC-3’，miR-187-R 5，-GCAGGGTCCGAGGTATTC-3’。

1.5 蛋白質(zhì)印跡法（Western blotting）檢測(cè)

分別收集轉(zhuǎn)染48 h后各組MDA-MB-231細(xì)胞，加入適量細(xì)胞裂解液，在冰上提取總蛋白，以BCA法檢測(cè)蛋白濃度，取等量蛋白樣品行10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，設(shè)置電壓為110 V，蛋白分離后電轉(zhuǎn)至PVDF膜上，將膜放置在含5%脫脂奶粉中封閉1 h，再分別加入PCNA一抗（1∶800稀釋?zhuān)?，Cleaved Caspase-3一抗（1∶800稀釋?zhuān)琁GF-1R一抗（1∶800稀釋?zhuān)?℃過(guò)夜孵育，TBST洗膜后再加入二抗（1∶3 000稀釋?zhuān)覝叵路跤? h。TBST洗膜后，采用ECL化學(xué)發(fā)光，顯色，轉(zhuǎn)移至暗室，使用凝膠成像系統(tǒng)成像拍照，以GAPDH為內(nèi)參，使用Image J軟件分析各條帶灰度值，計(jì)算目的蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

1.6 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力

轉(zhuǎn)染48 h后分別向各組MDA-MB-231細(xì)胞加入MTT溶液10μL，在37℃繼續(xù)孵育4 h，取出培養(yǎng)板，去上清，再向每孔細(xì)胞中加入150μL二甲基亞砜，避光振蕩反應(yīng)10 min，待沉淀完全溶解后，使用酶標(biāo)儀上檢測(cè)細(xì)胞光密度值（OD值），波長(zhǎng)為450 nm。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況

采用0.25%胰蛋白酶消化轉(zhuǎn)染后48 h各組MDA-MB-231細(xì)胞，離心收集細(xì)胞，加入100μL Binding buffer結(jié)合緩沖液，重懸細(xì)胞并制成1×10個(gè)/毫升的細(xì)胞懸液，向100μL細(xì)胞懸液中加入Annexin V-FITC 5μL，混勻后孵育15 min，再向細(xì)胞懸液中加入PI染液5μL，避光孵育15 min，立即上流式細(xì)胞儀檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)

TargetScan等在線數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)miR-187與IGF-1R 3’-UTR存在靶向結(jié)合位點(diǎn)，提示IGF-1R可能是miR-187的直接靶基因。根據(jù)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果分別擴(kuò)增與miR-187結(jié)合的IGF-1R 3’-UTR序列及突變序列，即IGF-1R-Wt和IGF-1R-Mut，分別構(gòu)建到熒光素酶報(bào)告載體上，該部分實(shí)驗(yàn)由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司完成。將構(gòu)建好的重組載體質(zhì)粒分別與miR-187 mim‐ic及對(duì)照mimics-NC共轉(zhuǎn)染MDA-MB-231細(xì)胞，48 h后使用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒分別測(cè)定海腎熒光素酶活性和螢火蟲(chóng)熒光素酶活性，計(jì)算相對(duì)熒光素酶活性，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用單因素方差分析比較多組間差異，采用SNK-q檢驗(yàn)分析比較兩兩組間差異，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-187在乳腺癌細(xì)胞中呈低表達(dá)

qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，與人正常乳腺上皮細(xì)胞HBL-100（1.00±0.10）相比，乳腺癌MDA-MB-231、MDA-MB-453、MCF-7、SK-BR-3細(xì) 胞miR-187的 表 達(dá) 水 平［（0.11±0.01）、（0.26±0.02）、（0.42±0.04）、（0.34±0.03）］均顯著下調(diào)（F=133.939，P＜0.05）。乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞中miR-187的表達(dá)水平最低，后續(xù)選取MDA-MB-231細(xì)胞用于轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。

2.2 轉(zhuǎn)染miR-187 mimics對(duì)在MDA-MB-231細(xì)胞中miR-187和IGF-1R表達(dá)的影響

qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，與miR-NC組和空白對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染miR-187 mimics后MDA-MB-231細(xì)胞中miR-187的表達(dá)水平顯著上調(diào)（t=22.293，22.497，均P＜0.01）。Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示，與miR-NC組和空白對(duì)照組相比，miR-187組MDA-MB-231細(xì)胞中IGF-1R蛋白表達(dá)水平明顯下調(diào)（t=15.173，16.016，，均P＜0.01）。見(jiàn)圖1和表1。

圖1 Western blotting檢測(cè)各組MDA-MB-231細(xì)胞中IGF-1R蛋白表達(dá)水平

表1 轉(zhuǎn)染miR-187 mimics對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞中miR-187和IGF-1R蛋白表達(dá)水平的影響/±s

2.3 過(guò)表達(dá)miR-187對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞增殖能力的影響

MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示，與miR-NC組和空白對(duì)照組相比，miR-187組MDA-MB-231細(xì)胞OD值 顯 著 降 低（t=11.941，11.023，均P＜0.01）。Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示，與miR-NC組和空白對(duì)照組相比，miR-187組MDA-MB-231細(xì)胞中PCNA蛋白表達(dá)水平明顯下調(diào)（t=12.247，11.635，均P＜0.01）。見(jiàn)圖2和表2。

圖2 Western blotting檢測(cè)各組MDA-MB-231細(xì)胞中PCNA蛋白表達(dá)水平

表2 過(guò)表達(dá)miR-187對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞OD值及PCNA蛋白表達(dá)的影響/±s

2.4 過(guò)表達(dá)miR-187對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞凋亡的影響

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，與miR-NC組和空白對(duì)照組相比，miR-187組MDA-MB-231細(xì)胞凋亡率明顯升高（t=15.414，15.013，均P＜0.01）。West‐ern blotting檢測(cè)結(jié)果顯示，與miR-NC組和空白對(duì)照組相比，miR-187組MDA-MB-231細(xì)胞中Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)水平明顯上調(diào)（t=24.333，23.847，均P＜0.01）。見(jiàn)圖3和表3。

A

2.5 miR-187對(duì)IGF-1R靶向調(diào)控關(guān)系驗(yàn)證

Tar‐getScan等生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，miR-187與IGF-1R基因3’UTR存在靶向結(jié)合位點(diǎn)，如圖4所示。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示，miR-187能夠抑制野生型IGF-1R-Wt的相對(duì)熒光素酶活性（t=12.277，P=0.0003），而對(duì)突變型IGF-1R-Mut的相對(duì)熒光素酶活性無(wú)影響（t=0.408，P=0.704）。

表3 過(guò)表達(dá)miR-187對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞凋亡率和Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)水平的影響/±s

3 討論

乳腺癌是女性癌癥相關(guān)死亡率的主要原因，雖然乳腺癌的診斷和系統(tǒng)治療方法已經(jīng)取得進(jìn)展，但患者的預(yù)后仍然很差。近年來(lái)，大量研究報(bào)道m(xù)iRNA在癌癥中表達(dá)失調(diào)，參與腫瘤的發(fā)展?；趍iRNA數(shù)據(jù)和疾病的組織特異性，Liang等提出了一種名為miTS的新方法來(lái)預(yù)測(cè)乳腺癌的潛在治療方法，表明miRNA在乳腺癌中起著至關(guān)重要的作用。證據(jù)表明，miR-187在人類(lèi)多種惡性腫瘤中異常表達(dá)，且通過(guò)靶向不同基因參與腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的調(diào)控。如Lin等研究，miR-187在宮頸癌組織和細(xì)胞系中表達(dá)下調(diào)，過(guò)表達(dá)miR-187可通過(guò)靶向HPV16 E6抑制宮頸癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。在骨肉瘤中，miR-187在骨肉瘤臨床組織樣本及骨肉瘤細(xì)胞中的表達(dá)水平顯著降低，上調(diào)miR-187可通過(guò)靶向MAPK12在體外抑制細(xì)胞生長(zhǎng)和侵襲。另外有研究顯示miR-187可發(fā)揮致癌基因的作用，如在非小細(xì)胞肺癌中，miR-187在非小細(xì)胞肺癌組織和細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，且其可通過(guò)靶向PTRF促進(jìn)細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和遷移。Li等實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，miR-187在胃癌中呈高表達(dá)，體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)均證實(shí)了miR-187可通過(guò)抑制FOXA2促進(jìn)胃癌的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，miR-187在乳腺癌細(xì)胞中呈低表達(dá)，提示其可能具有抑制乳腺癌發(fā)生和進(jìn)展的作用。這與以往關(guān)于miR-187發(fā)揮抑癌基因作用的研究類(lèi)似。

為進(jìn)一步探究miR-187在乳腺癌中的作用，本實(shí)驗(yàn)選擇miR-187表達(dá)水平最低的乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-187 mimics，以探究過(guò)表達(dá)miR-187對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞增殖和凋亡的影響。qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-187 mimics能夠顯著上調(diào)MDA-MB-231細(xì)胞中miR-187的表達(dá)。MTT實(shí)驗(yàn)表明，過(guò)表達(dá)miR-187可抑制MDA-MB-231細(xì)胞增殖能力。PCNA目前已被廣泛認(rèn)為是腫瘤細(xì)胞處于增殖狀態(tài)的分子指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)West‐ern blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，增殖細(xì)胞核抗原PCNA的表達(dá)水平明顯降低。因此進(jìn)一步證實(shí)了過(guò)表達(dá)miR-187可抑制MDA-MB-231細(xì)胞增殖。流式細(xì)胞術(shù)和Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)miR-187能夠提高細(xì)胞凋亡率及Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)水平，表明過(guò)表達(dá)miR-187可促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞凋亡。此外，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)miR-187后IGF-1R蛋白表達(dá)水平明顯下降，提示miR-187參與調(diào)控乳腺癌細(xì)胞增殖和凋亡可能與抑制IGF-1R的表達(dá)有關(guān)。IGF-1R基因編碼的蛋白是一種酪氨酸蛋白受體，在細(xì)胞轉(zhuǎn)化、凋亡及有絲分裂等細(xì)胞生物學(xué)行為中發(fā)揮重要作用。最近研究顯示，IGF-1R與乳腺癌中呈高表達(dá)，且與乳腺癌細(xì)胞增殖、凋亡等密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)生物信息學(xué)及雙熒光素酶報(bào)告基因驗(yàn)證了IGF-1R是miR-187的靶基因。表明過(guò)表達(dá)miR-187可通過(guò)靶向調(diào)控IGF-1R的表達(dá)抑制乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

注：1—GAPDH;2—Cleaved Caspase-3;3—對(duì)照組；4—miR-NC;5—miR-187。

圖4 miR-187與IGF-1R基因3’UTR存在靶向結(jié)合位點(diǎn)示意圖

綜上，本研究結(jié)果表明miR-187在乳腺癌細(xì)胞中呈低表達(dá)，且過(guò)表達(dá)miR-187可抑制乳腺癌MDAMB-231細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，該過(guò)程與靶向調(diào)控IGF-1R基因有關(guān)。miR-187和IGF-1R可能作為乳腺癌基因治療的新靶點(diǎn)。