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    黃芪多糖對(duì)系統(tǒng)性紅斑狼瘡小鼠免疫調(diào)節(jié)的影響

    2021-05-10 07:42:18魏瑜趙珍張傳標(biāo)熊江磊
    安徽醫(yī)藥 2021年5期

    魏瑜,趙珍,張傳標(biāo),熊江磊

    系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus,SLE)是一種自身免疫介導(dǎo)的多器官受累的彌漫性結(jié)締組織病,發(fā)病原因復(fù)雜,發(fā)病機(jī)制尚未闡明。目前此病尚無有效的治療方法,糖皮質(zhì)激素治療法是目前臨床較常用的方法,但是5年內(nèi)尚有15%的人死亡。近些年臨床研究表明,中醫(yī)治療法取得了較好的效果。黃芪多糖是黃芪的主要成分,臨床藥理作用廣泛,對(duì)免疫功能的調(diào)節(jié)作用顯著。徐濤等報(bào)道,在常規(guī)治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者的基礎(chǔ)上加用黃芪多糖,結(jié)果發(fā)現(xiàn)黃芪多糖可降低系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者血中T細(xì)胞因子的活性,改善系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者的輔助性T細(xì)胞1/輔助性T細(xì)胞2(Th1/Th2)細(xì)胞比例失衡。本研究擬采用黃芪多糖治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡MRL/lpr小鼠,旨在探討其療效及分子機(jī)制,為臨床治療提供參考依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料與主要試劑 黃芪多糖(上海谷研實(shí)業(yè)有限公司,批準(zhǔn)文號(hào)Z20040085,批次89250-26-0),4%多聚甲醛(上海威奧生物科技有限公司),T盒轉(zhuǎn)錄因子(T-bet)單克隆抗體,GATA結(jié)合蛋白3(GATA3)單克隆抗體(艾美捷科技有限公司),抗核抗體(ANA)、抗雙鏈脫氧核糖核酸抗體(Anti-dsDNA)、抗小核糖核蛋白/Sm抗體(Anti-snRNP/Sm),ELISA檢測(cè)試劑盒(上海古朵生物科技有限公司),TRIzol?Reagent(廈門慧嘉生物科技有限公司)。小型蛋白垂直電泳轉(zhuǎn)印系統(tǒng)1658033(北京智杰方遠(yuǎn)科技有限公司),Spectra‐Max?QuickDrop?超微量分光光度計(jì)[美谷分子儀器(上海)有限公司],Eppendorf CryoCube F740i超低溫冰箱(Eppendorf艾本德中國(guó)有限公司)。

    1.2 主要方法

    1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 MRL/lpr狼瘡模型鼠20只,SPF級(jí),雌性,6~8周齡,體質(zhì)量范圍25~30 g,由南京生物醫(yī)藥研究院提供,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)為32002100001274。C57BL/6J野生鼠10只,SPF級(jí),雌性,6~8周齡,體質(zhì)量范圍為25~30 g,由南京生物醫(yī)藥研究院提供,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證編號(hào)為44007200034870。本研究符合一般動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理學(xué)原則。

    1.2.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及處理 所有實(shí)驗(yàn)鼠喂養(yǎng)1周,隨后依據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法將20只MRL/lpr狼瘡模型小鼠分為模型組和藥物組,每組各10只,10只C57BL/6J野生鼠作為對(duì)照組。藥物組腹腔注射黃芪多糖,劑量為50 mg·kg·d),對(duì)照組和模型組均腹腔注射同等劑量的生理鹽水治療,藥物組劑量參照相關(guān)研究文獻(xiàn)并根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)調(diào)整所確定的。治療時(shí)間為10周。本次研究起止時(shí)間為2019年2—6月。

    1.2.3 自身抗體水平的檢測(cè) 治療結(jié)束后1 d,三組小鼠眼眶取血1 mL,離心取血清置于4℃冰箱備用。依據(jù)ANA、Anti-dsDNA抗體、Anti-snRNP/Sm抗體ELISA檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行操作檢測(cè)上述3種自身抗體水平。

    1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Th1細(xì)胞與Th2細(xì)胞數(shù)量 治療結(jié)束后1 d,麻醉后處死三組小鼠,取小鼠脾臟。剪取100 mg脾臟組織,研磨后離心并制備脾單細(xì)胞懸液,再依次加入5μL佛波酯(1μg/mL)、6μL離子霉素(50μg/mL)和莫能菌素5μL(0.1 mg/mL),置于細(xì)胞培養(yǎng)箱刺激6 h。使用適量PBS洗滌后將制備好的單細(xì)胞懸液加入專用的流式管中,分別加FITC標(biāo)記小鼠抗人分化簇3單克隆抗體(CD3-FITC)和APC標(biāo)記小鼠抗人分化簇8單克隆抗體(CD8-APC)各0.5μL,37℃避光孵育30 min;細(xì)胞通透打孔后,分別加FITC標(biāo)記小鼠抗人干擾素-γ單克隆抗體(IFN-γ-FITC)和FITC標(biāo)記小鼠抗人白細(xì)胞介素4單克隆抗體(IL-4-FITC)各1μL,37℃避光孵育30 min。使用流式細(xì)胞儀測(cè)定Th1(CD8IFN-γ)細(xì)胞與Th2(CD8IL-4)細(xì)胞。

    1.2.5 T-bet、GATA3蛋白水平的檢測(cè) 治療結(jié)束后1 d,麻醉后處死三組小鼠,取小鼠脾臟。剪取100 mg脾臟組織,使用勻漿器勻漿后離心取上清并測(cè)定蛋白濃度。組織蛋白進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)后轉(zhuǎn)印至聚偏氟乙烯(PVDF)膜,使用5%牛奶進(jìn)行封閉,洗滌后孵育T-bet單克隆抗體或GATA3單克隆抗體4℃12 h,洗滌后孵育HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠lgG室溫2 h,洗滌后進(jìn)行ECL顯色后曝光,掃描條帶后,使用Image J圖像分析軟件進(jìn)行分析,依據(jù)目的蛋白/內(nèi)參蛋白的比值計(jì)算T-bet及GATA3蛋白表達(dá)水平。

    1.2.6 T-bet、GATA3 mRNA表達(dá)水平檢測(cè) 治療結(jié)束后1 d,麻醉后處死三組小鼠,取小鼠脾臟。剪取100 mg脾臟組織,加入Trizol試劑后使用勻漿器勻漿,加入等體積異丙醇沉淀RNA,采用75%乙醇洗滌RNA,干燥后測(cè)定RNA濃度,依據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA并逆轉(zhuǎn)錄為總cDNA,進(jìn)行熒光定量反應(yīng),檢測(cè)T-bet及GATA3 mRNA表達(dá)水平。引物序列 如 下:T-bet,正 向 引 物5’-TACGCATCTGTT‐GATACGAC-3’,反向引物5’-ACTCCGCTTCATA‐ACTGTGT-3’;GATA3,正向引物:5’-TCTCACTCTC‐GAGGCAGCATGA-3’;反 向 引 物:5’-GCTAC‐CATCTCGCCGCCACAG-3’GAPDH:正向引物:5’-GTCGTACCACAGGCATTGTGATGG-3’;反向引物:5’-GCAATGCCTGGGTACATGGTGG-3’。

    2 結(jié)果

    2.1 各組小鼠自身抗體水平的比較 表1顯示,模型組和藥物組小鼠血清ANA抗體、Anti-dsDNA抗體和Anti-snRNP/Sm抗體水平均明顯高于對(duì)照組;與模型組比較,藥物組血清小鼠ANA抗體、Anti-dsD‐NA抗體和Anti-snRNP/Sm抗體水平均顯著降低(均P<0.05),見表1。

    2.2 各組小鼠Th1、Th2細(xì)胞的比較 與對(duì)照組相比,模型組及藥物組Th1亞群比例明顯降低,Th2亞群比例明顯升高(P<0.05);與模型組相比,藥物組Th1亞群比例明顯升高,Th2亞群比例明顯降低(P<0.05),見表2、圖1。

    2.3 各組小鼠T-bet和GATA-3蛋白水平比較 與對(duì)照組小鼠比較,模型組和藥物組小鼠的T-bet蛋白表達(dá)水平顯著降低,GATA-3蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05);與模型組小鼠相比,藥物組小鼠T-bet蛋白表達(dá)水平明顯升高,GATA-3蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.05),見圖2、表3。

    表1 MRL/lpr狼瘡模型鼠自身抗體水平的分組比較/±s

    表2 MRL/lpr狼瘡模型鼠Th1、Th2細(xì)胞亞群比例的比較/(%,±s)

    2.4 各組小鼠T-bet和GATA-3 mRNA水平比較與對(duì)照組小鼠比較,模型組和藥物組小鼠的T-bet mRNA表達(dá)水平顯著降低,GATA-3 mRNA表達(dá)水平顯著升高(P<0.05);與模型組小鼠相比,藥物組小鼠T-bet mRNA表達(dá)水平明顯升高,GATA-3 mRNA表達(dá)水平明顯降低(P<0.05),見表4。

    圖1 MRL/lpr狼瘡模型鼠20只Th1、Th2細(xì)胞亞群比例的比較:A為各組Th1細(xì)胞水平;B為各組Th2細(xì)胞水平:A為對(duì)照組Th1細(xì)胞水平;B為模型組Th1細(xì)胞水平;C為藥物組Th1細(xì)胞水平;D為對(duì)照組Th2細(xì)胞水平;E為模型組Th2細(xì)胞水平;F為藥物組Th2細(xì)胞水平

    圖2 各組小鼠T-bet和GATA-3蛋白水平比較

    表3 MRL/lpr狼瘡模型鼠T-bet和GATA-3蛋白水平比較/±s

    表4 MRL/lpr狼瘡模型鼠T-bet和GATA-3 mRNA水平比較/±s

    3 討論

    SLE是由T、B細(xì)胞功能紊亂及細(xì)胞因子表達(dá)異常所導(dǎo)致的累及多器官、多系統(tǒng)的自身免疫性疾病,易反復(fù)發(fā)作。黃芪多糖具有廣泛的藥理學(xué)作用,一方面可通過促進(jìn)未成熟T淋巴細(xì)胞活化,刺激T、B淋巴細(xì)胞功能;另一方面可直接增強(qiáng)體液免疫功能,促進(jìn)IgG等抗體的生成,增加脾臟和胸腺的質(zhì)量。凌昊等報(bào)道,黃芪多糖可改善Th1/Th2平衡失調(diào),調(diào)節(jié)免疫功能,因此本研究采用黃芪多糖作用于雌性MRL/lpr小鼠,探討其對(duì)免疫功能的調(diào)節(jié)作用及作用機(jī)制。

    王醫(yī)林等發(fā)現(xiàn)SLE患者外周血中25(OH)D水平與T淋巴細(xì)胞亞群及IFN-α密切相關(guān),其可能是通過調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞亞群及IFN-α治療SLE。ANA抗體、Anti-dsDNA抗體、Anti-snRNP/Sm抗體是篩查SLE疾病的常用指標(biāo)。ANA是自身免疫性疾病的血清標(biāo)志物,在SLE陽(yáng)性率約95%~100%。Anti-dsDNA抗體是SLE特異性抗體,與疾病活動(dòng)程度有關(guān),可用于病情監(jiān)測(cè)。Anti-snRNP/Sm抗體是SLE的標(biāo)記性抗體,但其敏感度較低。有研究表明,MRL/lpr小鼠給予S-腺苷同型半胱氨酸水解酶抑制劑(DZNep)治療后可降低dsDNA抗體的產(chǎn)生和淋巴細(xì)胞的增殖,改善MRL/lpr小鼠的狼瘡樣疾病。雌性MRL/lpr小鼠是目前研究中常用的經(jīng)典模型小鼠,該模型小鼠由于Fas基因缺失,機(jī)體不能清除自身反應(yīng)性淋巴細(xì)胞,從而出現(xiàn)自身免疫性疾病癥狀。本研究中發(fā)現(xiàn),模型組和藥物組小鼠血清ANA抗體、Anti-dsDNA抗體和Anti-snRNP/Sm抗體水平均明顯高于對(duì)照組。提示了雌性MRL/lpr小鼠病程進(jìn)展與人類相似,適合用于藥物研究。藥物干預(yù)后,發(fā)現(xiàn)與模型組比較,藥物組血清小鼠ANA抗體、Anti-dsDNA抗體和Anti-snRNP/Sm抗體水平均顯著降低。結(jié)果提示了黃芪多糖可下調(diào)自身抗體水平,緩解血管炎癥,進(jìn)而發(fā)揮治療的作用,其機(jī)制可能為黃芪多糖具有免疫調(diào)節(jié)功能,通過調(diào)節(jié)B細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞的功能,下調(diào)自身抗體的表達(dá)水平。

    除了抗體介導(dǎo)的反應(yīng),在系統(tǒng)性紅斑狼瘡中存在T細(xì)胞DNA甲基化異常,有助于CD4+輔助性T淋巴細(xì)胞(CD4+T)的活化;CD4+T細(xì)胞通過提供共刺激反應(yīng)信號(hào)與所分泌的細(xì)胞因子參與SLE疾病進(jìn)展。CD4T淋巴細(xì)胞主要分為Th1、Th2和Th3亞群,其中Th1和Th2細(xì)胞亞群主要參與體液免疫和細(xì)胞免疫。Th1及Th2細(xì)胞所分泌的細(xì)胞因子可介導(dǎo)機(jī)體的免疫功能。Th1/Th2失衡會(huì)導(dǎo)致類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、1型糖尿病及SLE等免疫相關(guān)性疾病,而Th1/Th2型細(xì)胞因子的異??赡苁荢LE的致病因素。王元元等發(fā)現(xiàn)系統(tǒng)性紅斑狼瘡小鼠Th1/Th2比例降低,且經(jīng)過地塞米松或者甘草酸處理后,Th1/Th2比例升高;也有研究報(bào)道,發(fā)現(xiàn)系統(tǒng)性紅斑狼瘡存在相反的Th1/Th2失衡現(xiàn)象,即Th1水平升高,Th2水平降低。存在這種爭(zhēng)議的主要原因是系統(tǒng)性紅斑狼瘡本身就是一種自身免疫病,其發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚,而且與疾病本身疾病嚴(yán)重程度,器官受累程度均有密切關(guān)系。本研究通過流式細(xì)胞分析技術(shù)檢測(cè)各組小鼠的Th1細(xì)胞和Th2細(xì)胞,模型組Th1亞群比例降低,Th2亞群比例升高,藥物干預(yù)后,藥物組Th1亞群比例升高,Th2亞群比例明顯降低。提示了:①M(fèi)RL/lpr小鼠中由于Th1細(xì)胞和Th2細(xì)胞的相關(guān)調(diào)控因子表達(dá)異常,Th1/Th2細(xì)胞比例失調(diào);②黃芪多糖可改善Th1/Th2失衡,調(diào)節(jié)免疫功能,發(fā)揮治療作用。

    研究發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)錄因子T-bet與GATA3在輔助T淋巴細(xì)胞分化發(fā)育中起到了重要的作用。其中T-bet蛋白是重要的Th1轉(zhuǎn)錄因子,在Th1細(xì)胞的分化及功能中扮演重要的角色,可有效抑制Th2細(xì)胞因子合成,并使完全分化的Th2逆轉(zhuǎn)為Th1。GA‐TA3蛋白在Th2細(xì)胞分化過程中發(fā)揮重要作用,可誘導(dǎo)Th2的生成,對(duì)CD8T淋巴細(xì)胞分化成熟產(chǎn)生抑制作用。本研究發(fā)現(xiàn),與對(duì)照組相比,MRL/lpr狼瘡小鼠脾臟T-bet蛋白和mRNA表達(dá)水平降低,而GATA3蛋白和mRNA表達(dá)水平升高,這與Th1/Th2細(xì)胞比例的變化是一致的,且經(jīng)黃芪多糖處理后,藥物組小鼠T-bet蛋白和mRNA表達(dá)水平明顯升高,GATA-3蛋白和mRNA表達(dá)水平顯著降低,提示了:①M(fèi)RL/lpr小鼠T-bet蛋白與GATA-3蛋白的表達(dá)是異常的。②黃芪通過上調(diào)T-bet蛋白的表達(dá),干預(yù)T淋巴細(xì)胞分化的上游環(huán)節(jié),促進(jìn)Th1型免疫應(yīng)答,下調(diào)GATA-3蛋白的表達(dá),抑制Th2型免疫反應(yīng)。

    綜上所述,黃芪多糖對(duì)MRL/lpr小鼠具有免疫功能的調(diào)節(jié)作用,并初步探討其可能的機(jī)制是影響T-bet、GATA-3的表達(dá)水平,調(diào)節(jié)Th1/Th2細(xì)胞的平衡,進(jìn)而下調(diào)自身抗體水平發(fā)揮治療作用。

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