羽扇豆醇聯(lián)合槲皮素對(duì)膀胱癌5637細(xì)胞的抑制作用

韓澤平，麥正均，黎毓光，呂鈺冰，何思華，周嘉彬，何金花

膀胱癌（bladder cancer）是泌尿系統(tǒng)最常見的惡 性腫瘤之一，每年約有55萬新發(fā)病例和20萬死亡病例，嚴(yán)重危害著人類的生命健康。膀胱癌初期癥狀較隱匿，絕大部分患者被確診時(shí)已為中晚期，手術(shù)切除腫物聯(lián)合化療是其主要治療方法，但容易復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，5年生存率僅約50%，而且化療不良反應(yīng)多，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，因此尋找新的治療藥物極為必要。

近年來中草藥逐漸受到人們的關(guān)注，部分天然草本及其有效成分具有抗癌、提高患者免疫力、減輕不良反應(yīng)以及延長(zhǎng)生存期等作用。而且，協(xié)同藥物組合治療比單藥療法更有成效，更有增效減毒，劑量降低的優(yōu)勢(shì)。近年研究報(bào)道，中藥單體化合物羽扇豆醇（lupeol）與槲皮素（quercetin）（圖1）具有多種抗腫瘤作用，包括有效抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、減少腫瘤的惡性轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)移等。本研究自2019年6月至2020年1月利用噻唑藍(lán)（MTT）法分別檢測(cè)羽扇豆醇與槲皮素聯(lián)合用藥對(duì)膀胱癌細(xì)胞增殖及遷移能力的影響，為中藥聯(lián)合應(yīng)用治療膀胱癌提供理論依據(jù)。

圖1 中藥單體結(jié)構(gòu)：A為羽扇豆醇的結(jié)構(gòu)；B為槲皮素的結(jié)構(gòu)

1 材料與方法

1.1 試劑和主要儀器

羽扇豆醇購(gòu)自南京狄爾格醫(yī)藥科技有限公司；槲皮素、二甲基亞砜（DMSO）、四甲基偶氮唑鹽（MTT）購(gòu)自SIGMA公司；胎牛血清（FBS）購(gòu)自Gibco公司；RPMI1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶、磷酸鹽緩沖液（PBS）購(gòu)自HyClone公司；青霉素/鏈霉素（P/S）購(gòu)自美國(guó)Thermo scientific公司；RTPCR試劑盒購(gòu)自美國(guó)GeneCopoeia公司；miRNeasy Mini Kit試劑盒購(gòu)自德國(guó)Qiagen公司；PCR引物購(gòu)自中國(guó)上海吉瑪生物公司；CO培養(yǎng)箱和Bio-Tek酶標(biāo)儀ELX-800購(gòu)自美國(guó)Biotech公司；1300B2生物安全柜購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；750D照相機(jī)購(gòu)自日本Canon公司；ABI 7900 Real-time PCR儀購(gòu)自美國(guó)ABI公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和藥物處理

膀胱癌5637細(xì)胞購(gòu)自沛瑜生物制品有限公司，細(xì)胞培養(yǎng)于含10%FBS、1%P/S的RPMI1640培養(yǎng)基中，置于37℃、飽和濕度、體積分?jǐn)?shù)為5%的二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。使用0.25%胰蛋白酶消化傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。羽扇豆醇使用無水乙醇和DMSO（1∶1）溶解，配制成10μmol/L的貯存液；槲皮素使用DMSO溶解，配制成10μmol/L的貯存液，置-20℃保存，用RPMI1640完全培養(yǎng)基稀釋至相應(yīng)的工作濃度。

1.3 噻唑藍(lán)（MTT）法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力

1.3.1 單獨(dú)用藥 選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的膀胱癌5637細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶消化后制成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度至1×10個(gè)/毫升，細(xì)胞懸液移200微升/孔至96孔板培養(yǎng)24 h。分別加入不同濃度的羽扇豆醇（10、20、40、60、80、100、120μmol/L）和槲皮素（5、10、20、40、80μmol/L）干預(yù)膀胱癌細(xì)胞48 h，每種濃度5個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)48 h后，每孔加入MTT 20μL，在5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中孵育4 h，終止培養(yǎng)，吸棄上清，每孔加入150μL DMSO，并于搖床震蕩10 min后，于490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度A值。計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率、IC及IC，細(xì)胞增殖抑制率=（A－A）/（A－A）×100%。

1.3.2 聯(lián)合用藥 根據(jù)1.3.1實(shí)驗(yàn)計(jì)算出兩種藥物作用于膀胱癌5637細(xì)胞的IC。分別設(shè)羽扇豆醇IC組、槲皮素IC組及聯(lián)合作用組，分別給予藥物相應(yīng)處理48 h后運(yùn)用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制率，并運(yùn)用金正均法計(jì)算出Q值評(píng)價(jià)聯(lián)合用藥時(shí)兩藥間的相互作用。

1.4 集落形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞克隆形成能力

用胰酶消化細(xì)胞，再用完全培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞數(shù)為400個(gè)/孔，接種于12孔板中，設(shè)羽扇豆醇IC組、槲皮素IC組、聯(lián)合作用組及空白對(duì)照組，每孔補(bǔ)足完全培養(yǎng)基至1 mL，在5%二氧化碳、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，每組設(shè)3個(gè)平行孔。棄去培養(yǎng)液，用PBS浸洗兩次，然后用95%乙醇固定10 min，然后風(fēng)干，再用0.1%結(jié)晶紫染色10 min，蒸餾水沖洗3次，風(fēng)干后拍照。然后每孔加入10%冰醋酸2 mL，靜止30 min，待結(jié)晶充分溶解，混勻后取100μL于96孔板中，酶標(biāo)儀讀取560 nm波長(zhǎng)處吸光度A值，計(jì)算克隆形成率?？寺⌒纬陕?（A－A）/A×100%。每組試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力

取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的5637細(xì)胞，計(jì)數(shù)后每孔以5.0×10個(gè)/毫升的細(xì)胞懸液2 mL接種至6孔板中，待細(xì)胞貼壁后，用200μL槍頭沿孔的縱行直徑劃痕，并在該劃痕左右0.5 cm處各劃一條，劃痕后用PBS洗3次，去除脫落的細(xì)胞。設(shè)羽扇豆醇IC組、槲皮素IC組、聯(lián)合作用組及空白對(duì)照組，分別加入相應(yīng)藥物的低濃度血清（2%）培養(yǎng)基，放入5%二氧化碳、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，按照0、6、12、18 h時(shí)間點(diǎn)選取同一視野進(jìn)行拍照。利用Image J軟件對(duì)各組進(jìn)行劃痕分析，計(jì)算遷移率。遷移率（%）=（T0時(shí)面積－Tt時(shí)面積）/T0時(shí)面積×100%。每組試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 qRT-PCR檢測(cè)miR-145的表達(dá)水平

取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的5637細(xì)胞，計(jì)數(shù)后每孔以5.0×10個(gè)/毫升的細(xì)胞懸液2 mL接種至6孔板中培養(yǎng)24 h，細(xì)胞分組同前，藥物干預(yù)48 h后收集細(xì)胞。按照試劑盒說明提取各組細(xì)胞的總RNA，并按試劑說明書配制逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系合成cDNA。用2μL cDNA作為模板配制25μL RT-PCR的反應(yīng)體系，反應(yīng)在ABI 7300 Real-time PCR儀上進(jìn)行，反應(yīng)條件為：95℃10 min，95℃15 s，60℃30 s，72℃30 s，共40個(gè)循環(huán)。內(nèi)參為U6，設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。miR-145的相對(duì)表達(dá)量用2法計(jì)算。miR-145正向引物：5’-ACACTC‐CAGCTGGGGTCCAGTTTTCCCAGGA-3’，反向引物：5’-TGGTGTCGTGGAGTCG-3’；U6正向引物：5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，反向引物：5’-AAC‐GCTTCACGAATTTGCGT-3’。

2 結(jié)果

2.1 羽扇豆醇和槲皮素單獨(dú)對(duì)膀胱癌5637細(xì)胞的作用

MTT法結(jié)果顯示，不同濃度羽扇豆醇對(duì)膀胱癌5637細(xì)胞均有抑制作用，隨著羽扇豆醇濃度的增加，抑制率升高，計(jì)算得48 h的IC值為50.02μmol/L，IC為35.40μmol/L。槲皮素也能抑制膀胱癌細(xì)胞的增殖，呈明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系，槲皮素作用48 h后的IC、IC值分別為44.42μmol/L、29.86μmol/L。本研究選取接近IC濃度的羽扇豆醇（35μmol/L）和槲皮素（30μmol/L）進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 羽扇豆醇與槲皮素聯(lián)合對(duì)膀胱癌細(xì)胞的抑制作用

羽扇豆醇與槲皮素兩種藥物的IC濃度聯(lián)合能明顯抑制膀胱癌細(xì)胞的增殖作用，抑制作用明顯強(qiáng)于兩者單獨(dú)作用（P＜0.05），計(jì)算得兩者IC聯(lián)合作用的Q值為1.167，Q值大于1.15，提示羽扇豆醇與槲皮素聯(lián)合干預(yù)膀胱癌5637細(xì)胞產(chǎn)生協(xié)同作用。

2.3 羽扇豆醇與槲皮素聯(lián)合對(duì)膀胱癌細(xì)胞的克隆形成作用

從圖2所見，藥物處理7 d后，與對(duì)照組相比，羽扇豆醇與槲皮素均能抑制膀胱癌5637細(xì)胞的克隆形成，在兩種藥物IC聯(lián)合作用下克隆能力抑制的更加明顯。溶解結(jié)晶紫后于酶標(biāo)儀讀取各孔560 nm吸光度，各組間吸光度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=112.47，P=0.000）。代入公式計(jì)算后，藥物聯(lián)合組的克隆抑制率［（74.64±1.70）%］明顯高于單用羽扇豆醇［（32.11±5.27）%］（t=13.30，P=0.000）及單用槲皮素［（50.23±5.18）%］（t=7.75，P=0.001）的克隆抑制率，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，均P＜0.05。且單用槲皮素組的抑制率高于單用羽扇豆醇（t=4.274，P=0.013）。

圖2 平板法檢測(cè)羽扇豆醇與槲皮素對(duì)膀胱癌5637細(xì)胞克隆形成能力

2.4 羽扇豆醇與槲皮素對(duì)膀胱癌5637細(xì)胞遷移能力的影響

劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與陰性對(duì)照組相比，羽扇豆醇組、槲皮素組及聯(lián)合組均有效抑制膀胱癌5637細(xì)胞的遷移能力（圖3）。其中聯(lián)合組的抑制作用最為顯著，18 h的遷移率僅為（37.64±2.49）%，明 顯 低 于 對(duì) 照 組（76.83±4.21）%（t=-13.878，P=0.000）、羽扇豆醇組（61.05±5.07）%（t=-7.178，P=0.002）及 槲 皮 素 組（51.11±2.46）%（t=-6.665，P=0.003）。單用羽扇豆醇組的遷移率與單用槲皮素的遷移率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.055，P=0.058）。

圖3 羽扇豆醇與槲皮素對(duì)膀胱癌5637細(xì)胞遷移能力的劃痕實(shí)驗(yàn)圖像（HE染色×40）

2.5 羽扇豆醇與槲皮素對(duì)膀胱癌5637細(xì)胞miR-145表達(dá)的影響

羽扇豆醇和槲皮素單獨(dú)干預(yù)5637細(xì)胞48 h后，均可使miR-145的相對(duì)表達(dá)量升高（P＜0.01），但兩者間的miR-145相對(duì)表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。聯(lián)合組的miR-145相對(duì)表達(dá)量顯著高于其余各組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

3 討論

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，現(xiàn)今治療手段主要以手術(shù)和化療為主，但復(fù)發(fā)率較高，且常規(guī)化療藥物對(duì)患者有一定程度的副作用，尋找新的抗癌藥物尤為必要。在腫瘤治療方面，傳統(tǒng)中藥具有全面、低毒、促進(jìn)免疫調(diào)節(jié)等特點(diǎn)，優(yōu)于放化療。隨著中藥驅(qū)邪扶正的機(jī)理及促進(jìn)人體免疫力的研究進(jìn)展，中藥在預(yù)防癌癥和治療早期癌癥，甚至中晚期抗癌的應(yīng)用方面將具有明顯的優(yōu)勢(shì)。

羽扇豆醇是一種五環(huán)三萜類化合物，分子量426.72，分子式C30H50O，廣泛存在于多種水果、蔬菜和中藥等植物當(dāng)中。據(jù)報(bào)道，羽扇豆醇具有多種藥理學(xué)活性作用，包括抗癌、抗炎、心臟病、抗糖尿病等。研究報(bào)道，羽扇豆醇可誘導(dǎo)小鼠黑色素瘤和人白血病細(xì)胞的分化并抑制其增殖；抑制小鼠二期皮膚癌的發(fā)展進(jìn)程，抑制胰腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和誘導(dǎo)凋亡；在體內(nèi)外對(duì)前列腺癌都有增值抑制和誘導(dǎo)凋亡的作用，然而關(guān)于羽扇豆醇對(duì)膀胱癌作用的研究甚少。槲皮素是一種黃酮類化合物，分子量302，分子式C15H10O7，廣泛存在于許多植物的花、葉、果實(shí)當(dāng)中。槲皮素具有多種藥理活性作用，包括抗纖維化作用、抗炎、降低血壓、保護(hù)心肌缺血再灌注損傷、抗病毒、鎮(zhèn)痛等。此外，槲皮素對(duì)鼻咽癌、肝癌、前列腺癌、白血病、胃癌及視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤等多種腫瘤細(xì)胞均有抑制的作用，是頗具應(yīng)用前景的抗癌藥物之一。

腫瘤的聯(lián)合用藥是指利用不同藥物之間的協(xié)同作用以取得比單一藥物更好的效果，通過減低藥物劑量達(dá)到減少藥物毒副作用目的，并增強(qiáng)藥物療效，有效抑制腫瘤生長(zhǎng)，防止腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。本研究檢測(cè)了不同濃度的羽扇豆醇和槲皮素單獨(dú)作用于膀胱癌細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率，結(jié)果顯示兩種藥物單獨(dú)作用于膀胱癌細(xì)胞均具有增值抑制作用，并且抑制率與藥物濃度呈依賴性。為了減少藥物的毒副作用，本研究降低藥物作用濃度，采用羽扇豆醇與槲皮素的IC濃度聯(lián)合干預(yù)膀胱癌5637細(xì)胞。根據(jù)MTT實(shí)驗(yàn)得出兩種藥物的IC，將兩種藥物IC聯(lián)合算出Q值來判斷兩種藥物聯(lián)合效果，結(jié)果顯示Q值為1.167，大于1.15，表明羽扇豆醇與槲皮素聯(lián)合作用產(chǎn)生協(xié)同作用，聯(lián)合作用組對(duì)細(xì)胞的抑制增殖效果明顯高于單獨(dú)作用組。進(jìn)一步的研究證明了，與單獨(dú)用藥組比較，聯(lián)合組可顯著抑制5637細(xì)胞克隆形成能力及細(xì)胞遷移能力。

微小RNA（microRNAs，miRNAs，miR）是一類長(zhǎng)度為18～22個(gè)堿基對(duì)組成的非編碼RNA，大量研究證實(shí)miRNA的異常表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的增殖、分化、凋亡及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，微小RNA-145（microRNA-145，miR-145）在多種腫瘤組織中呈低表達(dá)，起著抑癌基因的作用，當(dāng)原癌基因被激活時(shí)，miR-145的表達(dá)被抑制，不能發(fā)揮其正常功能，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。多項(xiàng)研究證實(shí)，miR-145在膀胱癌中明顯下調(diào)，上調(diào)其表達(dá)可有效抑制膀胱癌細(xì)胞增殖并可促進(jìn)細(xì)胞凋亡。據(jù)報(bào)道，多種藥物或基因治療手段可通過激活miR-145通路，上調(diào)膀胱癌細(xì)胞中miR-145的表達(dá)水平，進(jìn)而抑制膀胱癌的發(fā)生與發(fā)展。qRT-PCR結(jié)果顯示，羽扇豆醇與槲皮素單獨(dú)作用及聯(lián)合作用5637細(xì)胞均可使miR-145表達(dá)升高，且聯(lián)合作用組升高最為顯著。另外，miR-145是膀胱癌在內(nèi)的多種癌癥上皮間葉轉(zhuǎn)化（epithelial mesenchvmal transition，EM）調(diào)節(jié)劑，其表達(dá)增高也可抑制癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。本研究中，羽扇豆醇與槲皮素聯(lián)合作用5637細(xì)胞后，使胞內(nèi)miR-145相對(duì)表達(dá)量明顯增高從而達(dá)到抑癌效果，但其具體分子機(jī)制有待進(jìn)一步研究。