不同培養(yǎng)基組分對(duì)牛支原體生長(zhǎng)的影響

嚴(yán)明帥，徐業(yè)芬，張馮禧，索朗斯珠，牛家強(qiáng)

（1.西藏農(nóng)牧學(xué)院動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，西藏 林芝860000；2.西藏農(nóng)牧學(xué)院西藏高原動(dòng)物疫病研究自治區(qū)高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西藏 林芝860000）

牛支原體歸屬于支原體科支原體屬，是造成牛呼吸道疾病的重要病原之一［1］。除了可以導(dǎo)致?tīng)倥７窝?、關(guān)節(jié)炎和奶牛乳腺炎外，還可以造成角膜結(jié)膜炎、中耳炎、生殖道炎癥、流產(chǎn)與不孕等疾?。?］。牛群感染以后很難徹底根除，帶菌狀態(tài)可達(dá)數(shù)月甚至數(shù)年，其主要傳播途徑通過(guò)飛沫經(jīng)呼吸道傳播，還可以通過(guò)近距離接觸、生殖道接觸和吮吸乳汁等途徑傳播［3］。Hale等［4］在1961年首次從患乳腺炎的病牛中分離到牛支原體，此后在歐洲等地流行并對(duì)養(yǎng)牛業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。在中國(guó)，陳嘉棣等［5］在1983年首次從患有乳房炎的牛乳中分離到牛支原體，之后有零星報(bào)道牛支原體的感染。辛九慶等［6］在2008年從患肺炎的犢牛肺臟中分離到牛支原體，此后牛支原體在中國(guó)部分地區(qū)普遍流行，并造成一定的經(jīng)濟(jì)損失，石磊等［7］、冉智光等［8］、姚永進(jìn)等［9］相繼報(bào)道于患病肉牛及奶牛體內(nèi)分離并鑒定得到牛支原體，除原發(fā)性感染發(fā)病外，牛支原體還可以與其他病原造成混合感染，對(duì)中國(guó)養(yǎng)牛業(yè)危害極大。

牛支原體胞質(zhì)內(nèi)含有雙股DNA和核糖體，基因組很小，大約為1 080 kb［10］，其基因組攜帶的信息量和生物的合成以及代謝能力十分有限，因此培養(yǎng)牛支原體的人工培養(yǎng)基中需要添加其生存所必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)［11］，除了在培養(yǎng)基中添加脂肪酸和核酸前體外，還需要加入一定量的血清，為其生長(zhǎng)提供所需的膽固醇和脂肪酸，還要添加葡萄糖和丙酮酸作為其能量來(lái)源［12］。目前實(shí)驗(yàn)室用于培養(yǎng)牛支原體經(jīng)常使用的培養(yǎng)基存在培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)、成本較高等問(wèn)題，不利于牛支原體的大量培養(yǎng)［13］。本試驗(yàn)選用3種類(lèi)型的血清和4個(gè)廠家生產(chǎn)的瓊脂，按照含量為5%～15%的血清添加量制備9種液體培養(yǎng)基；在添加血清類(lèi)型和含量的基礎(chǔ)上制備4種固體培養(yǎng)基，來(lái)驗(yàn)證其對(duì)牛支原體的生長(zhǎng)影響，為今后牛支原體培養(yǎng)基的篩選和疫苗的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌株來(lái)源

牛支原體分離株由西藏高原動(dòng)物疫病研究自治區(qū)高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分離、鑒定與保存［14］。

1.2 主要試劑

PPLO Broth、Yeast Extract、Agar均 購(gòu) 自BD公司；丙酮酸鈉購(gòu)自青島海博生物技術(shù)有限公司；馬血清購(gòu)自Hyclone公司、豬血清購(gòu)自上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司、胎牛血清購(gòu)自廣州蕊特生物科技有限公司；氫氧化鈉購(gòu)自天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；青霉素鈉購(gòu)自山東聖旺藥業(yè)股份有限公司；瓊脂購(gòu)自上海某公司、成都某公司、香港某公司。

1.3 試驗(yàn)用溶液的制備

0.1 moL/L NaOH溶液：用天平稱(chēng)取4 g NaOH，之后轉(zhuǎn)移到燒杯內(nèi)，加入少量去離子水使其溶解，完全溶解后轉(zhuǎn)移到容量瓶中定容至1 000 mL，搖勻后4℃保存，備用。

0.4%酚紅溶液：用天平稱(chēng)取酚紅0.4 g放入研缽內(nèi)、逐滴加入0.1 moL/L的NaOH溶液10 mL，研磨使其完全溶解，然后加入到容量瓶中用去離子水定容至100 mL，經(jīng)濾紙過(guò)濾后4℃保存，備用。

40萬(wàn)U/mL青霉素溶液：向400萬(wàn)U的青霉素粉末中加10 mL去離子水，混勻后4℃保存，備用。

1.4 培養(yǎng)基的制備

牛支原體培養(yǎng)基的配制：PPLO Broth 21 g/L，Yeast Extract 5 g/L，丙酮酸鈉1 g/L，dd H2O 880 mL，116℃高壓滅菌18 min，冷卻至50～60℃，加入10X MEM 10 mL，40萬(wàn)U/mL青霉素2 mL/L，0.4%酚紅溶液4.5 mL/L，4℃保存，備用。血清量的添加參照郭澍強(qiáng)［15］的研究結(jié)果，按照5%、10%、15%的血清濃度依次制備了9種液體培養(yǎng)基，具體見(jiàn)表1。在此基礎(chǔ)上，用4個(gè)廠家生產(chǎn)的瓊脂依次制備了4種固體培養(yǎng)基，分別編號(hào)為10（BD公司）、11（香港某公司）、12（上海某公司）和13（成都某公司）。

1.5 OD值測(cè)定法

將復(fù)蘇的牛支原體菌液按1∶10比例分別接種于液體培養(yǎng)基1～9，每種培養(yǎng)基設(shè)3個(gè)重復(fù)，置37℃5% CO2恒溫箱中培養(yǎng)，每隔12 h分別從各培養(yǎng)基中取樣，在630 nm波長(zhǎng)下測(cè)定其OD值，最后分別各取平均值作為培養(yǎng)基OD值［13］。

1.6 固體培養(yǎng)基評(píng)價(jià)指標(biāo)

取復(fù)蘇后牛支原體菌液50μL，分別接種于4種固體培養(yǎng)基（10、11、12、13），每種培養(yǎng)基設(shè)3個(gè)重復(fù)，置37℃5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～5 d，以其固體培養(yǎng)基的外觀、菌落生長(zhǎng)情況、菌落形態(tài)特征作為培養(yǎng)基的性能評(píng)價(jià)指標(biāo)［16］，具體情況見(jiàn)表2。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

應(yīng)用SPSS 21.0軟件對(duì)OD值檢測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析，若P＞0.05，則差異不顯著；若P＜0.05，則差異顯著；若P＜0.01，則差異極顯著。

表2 固體培養(yǎng)基性能指標(biāo)評(píng)價(jià)數(shù)值

2 結(jié)果與分析

2.1 血清類(lèi)型和濃度對(duì)牛支原體生長(zhǎng)的影響

接種了牛支原體的9種液體培養(yǎng)基，置37℃5% CO2恒溫箱中培養(yǎng)，每隔12 h取菌液，進(jìn)行OD值測(cè)定，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3、表4、表5、表6、表7、表8。結(jié)果表明：牛支原體在9種液體培養(yǎng)基中均在培養(yǎng)至60 h時(shí)其OD值達(dá)到最大；在添加相同血清濃度的情況下，經(jīng)顯著性分析顯示，培養(yǎng)基1與4、7相比差異顯著（P＜0.05），培養(yǎng)基4與7相比差異不顯著（P＞0.05）；培養(yǎng)基2與5、8相比差異顯著（P＜0.05），培養(yǎng)基5與8相比差異不顯著（P＞0.05）；培養(yǎng)基3與6、9相比差異顯著（P＜0.05），培養(yǎng)基6與9相比差異不顯著（P＞0.05）。該檢測(cè)結(jié)果說(shuō)明牛支原體在添加了馬血清的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)狀態(tài)優(yōu)于添加了豬血清和胎牛血清的培養(yǎng)基。

在添加相同類(lèi)型血清的情況下，培養(yǎng)基2、3與1相比差異顯著（P＜0.05），而培養(yǎng)基2與3相比差異不顯著（P＞0.05）；培養(yǎng)基4、5、6之間相比差異不顯著（P＞0.05）；培養(yǎng)基7、8、9之間相比差異不顯著（P＞0.05）。該檢測(cè)結(jié)果說(shuō)明血清濃度對(duì)牛支原體生長(zhǎng)造成的影響不大，基于培養(yǎng)基成本考慮選擇添加10%血清的培養(yǎng)基作為今后培養(yǎng)牛支原體的使用量。

表3 添加5%血清的培養(yǎng)基在不同時(shí)間點(diǎn)的OD值檢測(cè)結(jié)果

表4 添加10%血清的的培養(yǎng)基在不同時(shí)間點(diǎn)的OD值檢測(cè)結(jié)果

表5 添加15%血清的的培養(yǎng)基在不同時(shí)間點(diǎn)的OD值檢測(cè)結(jié)果

表6 添加了馬血清的培養(yǎng)基在不同時(shí)間點(diǎn)的OD值檢測(cè)結(jié)果

表7 添加了豬血清的培養(yǎng)基在不同時(shí)間點(diǎn)的OD值檢測(cè)結(jié)果

表8 添加了胎牛血清的培養(yǎng)基在不同時(shí)間點(diǎn)的OD值檢測(cè)結(jié)果

2.2 不同廠商瓊脂對(duì)牛支原體生長(zhǎng)影響

接種了牛支原體菌液的4種固體培養(yǎng)基培養(yǎng)3～5 d，肉眼觀測(cè)培養(yǎng)基外觀及菌落生長(zhǎng)狀況，并在低倍鏡下觀察菌落形態(tài)，性能指標(biāo)評(píng)價(jià)結(jié)果見(jiàn)表9。結(jié)果表明，培養(yǎng)基10外觀良好，表面平整，無(wú)裂縫；牛支原體生長(zhǎng)良好、菌落數(shù)目多，呈均勻一致；低倍鏡觀察菌落形態(tài)呈典型的“油煎蛋樣”；培養(yǎng)基性能指標(biāo)得分為9分。培養(yǎng)基11外觀正常，表面凹凸不平；培養(yǎng)基上有牛支原體生長(zhǎng)，但菌落數(shù)目較少，分布不均勻；低倍鏡下菌落形態(tài)不典型；培養(yǎng)基性能指標(biāo)得分為7分。培養(yǎng)基12外觀較差，表面凹凸不平；培養(yǎng)基上有牛支原體生長(zhǎng)，但菌落數(shù)目少，分布不均勻；低倍鏡下菌落形態(tài)不典型；培養(yǎng)基性能指標(biāo)得分為5分；培養(yǎng)基13外觀正常，但表面有裂縫；培養(yǎng)基上有牛支原體生長(zhǎng)、但菌落數(shù)目稀少，分布一般；低倍鏡下菌落形態(tài)不典型；培養(yǎng)基性能指標(biāo)得分為6分。以上結(jié)果說(shuō)明，由BD公司生產(chǎn)的瓊脂所制備的培養(yǎng)基性能指標(biāo)最優(yōu)。

表9 4種固體培養(yǎng)基性能指標(biāo)評(píng)分結(jié)果

3 小結(jié)與討論

本試驗(yàn)選用3種類(lèi)型的血清，按照5%、10%、15%的血清濃度依次制備了9種液體培養(yǎng)基，采用OD值檢測(cè)法對(duì)牛支原體生長(zhǎng)情況進(jìn)行研究，結(jié)果表明，牛支原體在添加了馬血清的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)狀態(tài)優(yōu)于添加了豬血清和胎牛血清的培養(yǎng)基。且10%與15%血清濃度對(duì)牛支原體生長(zhǎng)造成的影響不大，基于培養(yǎng)基成本考慮選擇添加10%血清的培養(yǎng)基作為今后牛培養(yǎng)支原體的使用量。在此基礎(chǔ)上，用4個(gè)廠商瓊脂依次制備了4種固體培養(yǎng)基，分別進(jìn)行了牛支原體生長(zhǎng)試驗(yàn)。結(jié)果表明，添加BD公司的瓊脂所制備的固體培養(yǎng)基最適宜牛支原體的生長(zhǎng)。

牛支原體病在全世界范圍內(nèi)流行，患病牛和帶菌牛是該病的主要傳染源，牛群一旦感染很難徹底清除，牛的發(fā)病率為50%～100%，病死率可達(dá)10%～50%，給養(yǎng)牛業(yè)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失［17］。在臨床治療過(guò)程中，藥物的治療效果不佳，因此，疫苗對(duì)該病的防控起到關(guān)鍵的作用，而選出生長(zhǎng)快、滴度高的培養(yǎng)基是疫苗生產(chǎn)過(guò)程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，目前所使用的培養(yǎng)基存在培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)、成本高和效率低，不適用于牛支原體的大量培養(yǎng)［18］。為此探索高效率的培養(yǎng)基為牛支原體的大量培養(yǎng)提供參考，并開(kāi)發(fā)有效疫苗防控牛支原體病，保障養(yǎng)牛業(yè)的健康、快速發(fā)展。

對(duì)牛支原體分離培養(yǎng)時(shí)要求較高，不僅要無(wú)菌采集病變的組織樣本，且在對(duì)樣本的處理及培養(yǎng)全過(guò)程都要求嚴(yán)格無(wú)菌操作，增加了分離難度。牛支原體的基因組很小，只有典型細(xì)菌基因組的20%～40%，合成物質(zhì)的能力和攜帶的信息量有限，因此，需要通過(guò)宿主細(xì)胞獲取生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，且體外培養(yǎng)時(shí)對(duì)培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)成分要求很高，培養(yǎng)條件也很苛刻［19］。培養(yǎng)基中需加入血清、酵母粉、MEM等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，并在37℃5% CO2環(huán)境中恒溫培養(yǎng)3～5 d［20］，在液體培養(yǎng)基中呈現(xiàn)澄清透明無(wú)沉淀或少許沉淀的黃色，固體培養(yǎng)基中的菌落在低倍鏡下可觀察到典型的“煎蛋狀”或“臍狀”的菌落形態(tài)［21］。培養(yǎng)基中還需加入抗生素，以達(dá)到抑菌作用［22］。目前所用的培養(yǎng)基雖然能夠提供膽固醇、氨基酸和維生素等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，但存在培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)、效率低等弊端，因此需要改良出培養(yǎng)成本低、效率高的培養(yǎng)基，不僅用于牛支原體的大量培養(yǎng)，且對(duì)今后疫苗的研發(fā)有著重要的意義。本次試驗(yàn)選用3種動(dòng)物的血清，按照5%、10%、15%的血清濃度依次制備了9種液體培養(yǎng)基，采用OD值檢測(cè)法比較牛支原體在9種液體培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況，結(jié)果表明，牛支原體在9種液體培養(yǎng)基中均可生長(zhǎng)，在培養(yǎng)至60 h時(shí)其OD值達(dá)到最大。在添加血清濃度相同的情況下，添加馬血清培養(yǎng)基的OD值與添加豬血清或胎牛血清培養(yǎng)基的OD值相比差異顯著，說(shuō)明牛支原體在添加了馬血清的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)狀態(tài)優(yōu)于添加了豬血清和胎牛血清的培養(yǎng)基。在添加相同類(lèi)型血清的情況下，添加豬血清或胎牛血清的各培養(yǎng)基之間的OD值相比差異不顯著，而添加馬血清的各培養(yǎng)基之間的OD值相比，添加量10%和15%與5%相比差異顯著，而10%與15%相比差異不顯著，說(shuō)明血清濃度對(duì)牛支原體生長(zhǎng)造成的影響不大，基于培養(yǎng)基成本考慮選擇添加10%血清的培養(yǎng)基作為今后培養(yǎng)牛支原體的使用量。

瓊脂雖然無(wú)營(yíng)養(yǎng)成分只是作為培養(yǎng)基的凝固劑和載體，但是培養(yǎng)基的凝膠強(qiáng)度過(guò)高，會(huì)造成菌落生長(zhǎng)偏小，而培養(yǎng)基凝膠強(qiáng)度過(guò)低時(shí)，會(huì)影響培養(yǎng)基的外觀，造成培養(yǎng)基表面不平整、不均勻有裂縫［23］。另一方面，不同廠商生產(chǎn)瓊脂采用的原料也不相同，目前市場(chǎng)上主要使用的是石花菜和江蘺，由2種原料生產(chǎn)出的瓊脂粉凝固點(diǎn)有很大的差異，并且不同廠商或同一廠商不同批號(hào)生產(chǎn)的瓊脂其凝固強(qiáng)度也存在很大差異，將會(huì)對(duì)培養(yǎng)基的性能影響很大，從而影響微生物的生長(zhǎng)和形態(tài)特征［24］。本次試驗(yàn)在血清添加種類(lèi)和濃度的基礎(chǔ)之上，選用4種廠商生產(chǎn)的瓊脂制備固體培養(yǎng)基，接種一定濃度的牛支原體放入37℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，通過(guò)比較4種固體培養(yǎng)基的外觀、牛支原體生長(zhǎng)情況和菌落形態(tài)，結(jié)果表明，由BD公司生產(chǎn)的瓊脂制備的固體培養(yǎng)基的性能指標(biāo)最好，不僅固體培養(yǎng)基外觀良好，而且牛支原體生長(zhǎng)良好、菌落形態(tài)典型，適宜牛支原體固體培養(yǎng)基的制備。