土壤高效解鉀菌的篩選鑒定及煙草栽培應(yīng)用效果評價

高加明，張健行，佘夢林，王 冬，陳守文，馬 昕

（1.湖北省煙草專賣局，武漢430000；2.無錫藥明康德新藥開發(fā)股份有限公司，江蘇 無錫214100；3.湖北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，武漢430062）

煙草是中國重要的經(jīng)濟作物之一，煙葉生長期間各種營養(yǎng)元素尤其是鉀元素的供應(yīng)對煙葉的產(chǎn)量和品質(zhì)具有關(guān)鍵影響［1］。鉀元素缺乏會導(dǎo)致煙葉尖端和葉緣處呈黃綠色暈斑或者紅銅色、棕褐色壞點，葉片發(fā)軟，葉緣下卷，頁面凹凸不平，嚴(yán)重時部分葉肉呈黃色，葉緣干枯殘破［2］。目前，針對煙草的缺鉀癥一般采取地施鉀肥或者葉片噴施磷酸二氫鉀溶液的方法進行矯正和防治［3］。然而，傳統(tǒng)化肥的大量施用容易造成土壤板結(jié)、酸化、微生物類群失衡［4］、土傳病害加重［5］等嚴(yán)重的土壤問題，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來了一定的損失。在該情況下，生物鉀肥作為新型環(huán)保肥料逐步進入人們的視野［6］。

生物鉀肥是一種新型的鉀細(xì)菌肥料，其主要成分為解鉀細(xì)菌［7］。該肥料能夠利用解鉀細(xì)菌在土壤中的繁殖與活動對含鉀礦物進行分解，將難溶性鉀轉(zhuǎn)化為可供植物吸收利用的可溶性鉀［8］。目前所報道的解鉀菌主要有膠質(zhì)芽孢桿菌（Bacillus mucilagi?nosus）、環(huán)狀芽孢桿菌（Bacillus circulans）和土壤芽孢桿菌（Bacillus edaphic）等，而其中又以膠質(zhì)芽孢桿菌的解鉀效率及環(huán)境適應(yīng)能力最強［9，10］。近年來的研究表明，解鉀菌分解礦物的機理具有多樣性，包括分泌有機酸、降解酶類以及通過分泌胞外多糖對礦物顆粒進行吸附、包裹后再通過菌體代謝產(chǎn)物溶蝕等多種方法［11］。解鉀菌對作物生長的影響主要表現(xiàn)為提供作物生長所需的鉀等礦質(zhì)營養(yǎng)，促進生長、改善作物品質(zhì)、增強作物抗逆性等。Postma等［12］將解鉀菌施用于土壤后，土壤速效鉀含量從86.57 mg/kg上升至99.60 mg/kg。陳彥春等［13］在煙草大田施用生物鉀肥后，煙葉株高、葉寬、葉面積顯著增加，煙葉產(chǎn)量提高了17.2%。韋忠等［14］的研究結(jié)果表明，添加生物鉀肥處理的煙葉煙堿、總氮含量最低，煙葉含鉀量顯著提升，且致香物質(zhì)增多。

解鉀細(xì)菌因其獨特的生物活性已成為生態(tài)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的優(yōu)勢菌株，且常被制作成菌肥應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)［15］，但目前大部分解鉀菌仍然面臨著解鉀能力弱、定殖時間短、密度低、對作物促生效果不穩(wěn)定等問題。本研究旨在通過篩選高效解鉀菌株，并考察其在煙草根際土壤中的定殖穩(wěn)定性、釋鉀效果和對煙草的促生效果，為解鉀細(xì)菌菌肥的開發(fā)及其在煙草種植中的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品及原料

1）菌種篩選土壤。湖北省武漢市華中農(nóng)業(yè)大學(xué)實驗田表層土壤、華中農(nóng)業(yè)大學(xué)獅子山林地表層土壤、湖北省恩施州煙田表層土壤等，樣品編號后放置4℃冰箱保存。

2）煙草盆栽土壤。煙草盆栽土壤取自華中農(nóng)業(yè)大學(xué)實驗田的黃棕壤，土壤取回后121℃滅菌1 h，晾干后搗碎過篩，稱重后裝盆。經(jīng)測定其各項營養(yǎng)元素濃度分別為有機質(zhì)36.3 g/kg、總氮1.1 g/kg、全鉀13.5 g/kg、速效磷39.8 mg/kg、緩效鉀1 065.6 mg/kg、速效鉀132.7 mg/kg、pH 7.2。

1.1.2 培養(yǎng)基

1）解鉀菌分離培養(yǎng)基。蔗糖5.0 g/L，NaH2PO4·12H2O 2.0 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，CaCO30.5 g/L，瓊脂20.0 g/L，pH 7.0～7.5。

2）解鉀菌篩選培養(yǎng)基。蔗糖10.0 g/L，（NH4）2SO41.0 g/L，NaH2PO4·12H2O 2.0 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，NaCl 0.1 g/L，酵母粉0.5 g/L，CaCO31.0 g/L，鉀長石粉（200目）20.0 g/L，pH 7.2。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株篩選及鑒定取10.0 g土壤樣品至90 mL

無菌水的三角瓶中，180 r/min振蕩30 min，稀釋后涂布在解鉀菌分離培養(yǎng)基上，37℃恒溫培養(yǎng)3～4 d。待長出菌落后，挑選長勢較好的菌落接種到解鉀菌篩選培養(yǎng)基平板中，30℃恒溫培養(yǎng)7 d，從中挑取長勢良好的菌株接種到斜面培養(yǎng)基（解鉀菌分離培養(yǎng)基）中保存。

將初篩獲得的菌株以5%接入解鉀菌篩選液體培養(yǎng)基，30℃、180 r/min培養(yǎng)7 d。振蕩10 min后121℃滅菌20 min，隨后8 000 r/min離心15 min，上清液稀釋50倍，使用原子吸收光譜儀測可溶性鉀元素含量，然后計算菌株實際解鉀量，計算公式：菌株實際解鉀量=菌株發(fā)酵液含鉀量-對照上清液含鉀量。選取其中解鉀能力最強的菌株進行生理生化及分子生物學(xué)鑒定。菌株的生理生化鑒定參照《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊》第九版，并以膠質(zhì)芽孢桿菌LS1作為對照菌株。菌株的分子生物學(xué)鑒定參照《精編分子生物學(xué)實驗指南》第四版［16］。

1.2.2 解鉀菌肥的配制以麥麩為菌肥載體，烘干、磨碎過40目篩。121℃30 min連續(xù)滅菌6次。選擇200目的白云母粉為含鉀礦物。礦粉用去離子水清洗2遍，定量濾紙過濾后，烘干，收集礦粉。將解鉀菌NGW1發(fā)酵液（發(fā)酵時間48 h，90%以上芽孢，調(diào)節(jié)體積使芽孢數(shù)為8×109CFU）加至100 g載體中，充分?jǐn)嚢?，調(diào)節(jié)pH至6.5～7.5。載體中的生物量理論上為8×107CFU/g。白云母礦粉依據(jù)試驗設(shè)計添加。

1.2.3 盆栽試驗設(shè)計對解鉀菌NGW1進行了利福平抗性誘導(dǎo)，使之可以在200μg/mL的利福平濃度下生長，有利于定殖數(shù)量檢測。煙草盆栽試驗共設(shè)4個處理，每個處理重復(fù)9次，試驗所施肥料有基肥、微生物有機肥、礦物鉀肥?；拾蛩?、過磷酸鈣、硫酸鉀，其N∶P∶K=1∶1∶3，礦物鉀肥為200目白云母粉。土壤于121℃30 min條件下間歇滅菌4次。每個花盆1 kg土壤，煙苗移栽時各處理按照表1添加肥料，其中基肥溶于水后添加，解鉀菌NGW1菌肥添加至煙草根圍。煙苗移栽后0、10、30、45、60 d取煙草植株及根際土壤樣品。煙草植株測量農(nóng)藝性狀后，取煙葉105℃殺青10 min，隨后60℃烘干至恒重。區(qū)分不同部位煙葉，將葉脈除去，標(biāo)記，磨碎過40目篩，編號，用于后續(xù)檢測。土壤樣品一部分用于定殖計數(shù)，另一部分自然風(fēng)干后過40目篩，編號用于后續(xù)檢測。

表1 不同盆栽處理的肥料施用量 （單位：g/盆）

1.2.4 數(shù)據(jù)處理采用Excel 2019和MEGA 7.0軟件進行數(shù)據(jù)處理、分析和作圖，用SPSS Statistics 19軟件、Duncan’s新復(fù)極差法檢驗數(shù)據(jù)的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 解鉀菌的篩選

經(jīng)過篩選獲得10株在解鉀菌篩選培養(yǎng)基平板中生長良好的菌株（表2），表中LS1為實驗室保藏的具有解鉀能力的膠質(zhì)芽孢桿菌菌株。進一步通過液體培養(yǎng)檢測各菌株的解鉀能力，結(jié)果顯示（表3），NGW1菌株發(fā)酵液上清含鉀量為53.80μg/mL，顯著高于其他菌株，表明在測試菌株中NGW1菌株的解鉀能力最強，故選用NGW1菌株用于后續(xù)研究。

表2 不同菌株在解鉀菌分離培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)

表3 不同菌株在液體培養(yǎng)基中分解鉀長石的效果（單位：μg/mL）

2.2 菌株生理生化及分子生物學(xué)鑒定

為明確NGW1菌株的種屬分類，進一步對該菌株進行了生理生化特征鑒定和16S rDNA基因序列分析。結(jié)果顯示（表4），NGW1菌株的生理生化特征與膠質(zhì)芽孢桿菌LS1菌株一致。通過將NGW1菌株的16S rDNA基因序列與Genbank的核酸序列進行同源性比對（Blastn），結(jié)果顯示，菌株NGW1同Bacil?lus mucilaginosus（AB255669）的相似性達(dá)99%。同相近種屬模式菌株16S rDNA基因序列進行序列比對，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖1），菌株NGW1同膠質(zhì)芽孢桿菌屬于同一個聚類。

表4 菌株NGW1的生理生化特點

根據(jù)形態(tài)特征、生理生化特性和16S rDNA基因序列分析方法，菌株NGW1被鑒定為膠質(zhì)芽孢桿菌（Bacillus mucilaginosus），命 名 為B.mucilaginosusNGW1，GenBank序列號為KR297246。

圖1 基于16S rDNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3 膠質(zhì)芽孢桿菌NGW1對盆栽煙草生長的影響

2.3.1 解鉀菌NGW1及含鉀礦物對煙草農(nóng)藝性狀的影響為考察解鉀菌NGW1對煙草生長是否有促進作用，測定了不同處理下盆栽煙草的農(nóng)藝性狀。結(jié)果顯示（表5），整個煙草盆栽時期，ML1、ML2和ML3處理的煙草植株的有效葉數(shù)、株高、最大葉寬、莖圍均高于CK。

移栽30 d時，CK植株的株高、最大葉長、最大葉寬和莖圍分別為（20.50±2.12）cm、（15.70±2.11）cm、（11.50±1.42）cm和（2.70±0.53）cm，其中添加解鉀菌的3個處理植株的株高和莖圍均顯著高于CK，且以ML3處理的植株長勢最好，其株高、最大葉長、最大葉寬和莖圍分別為（26.30±3.12）cm、（15.31±2.30）cm、（12.32±0.63）cm和（4.07±0.45）cm，相比于CK，ML3處理的株高、莖圍分別提高28.29%和50.74%。

移栽45 d時，CK植株的株高、最大葉長、最大葉寬和莖圍分別為（23.40±1.69）cm、（17.17±0.81）cm、（12.62±0.91）cm和（3.11±0.38）cm。隨著菌株的生長，添加解鉀菌肥的3個處理植株的株高、最大葉長、最大葉寬和莖圍數(shù)據(jù)均優(yōu)于CK。長勢最好的ML3處理植株的株高、最大葉長、最大葉寬和莖圍分別為（30.33±2.31）cm、（19.87±1.50）cm、（14.98±0.58）cm和（4.51±0.41）cm，比CK分別提高29.62%、15.73%、18.70%和45.02%。

移栽60 d時，添加解鉀菌的3個處理植株的多項農(nóng)藝性狀數(shù)據(jù)仍顯著大于CK，其中生長最好的ML3處理的株高、最大葉長、最大葉寬和莖圍分別為（35.34±2.52）cm、（22.33±1.53）cm、（17.65±2.08）cm和（4.63±0.45）cm，比CK分別提高51.61%、20.05%、29.11%和25.82%。

表5 不同處理對盆栽煙草農(nóng)藝性狀的影響

2.3.2 解鉀菌NGW1及含鉀礦物對土壤和煙葉含鉀量的影響為考察解鉀菌在盆栽土壤中的解鉀能力以及解鉀菌肥施加是否能促進煙草吸收和積累鉀元素，檢測了不同盆栽處理中土壤和煙葉的含鉀量。結(jié)果顯示（圖2），添加解鉀菌肥的各處理土壤總含鉀量均高于CK。在30、45、60 d時，CK土壤總含鉀量分別為13 448.6、13 372.6、13 371.2 mg/kg。30 d時添加解鉀菌肥的ML1、ML2、ML3處理土壤總含鉀量分別為13 453.6、13 472.8、13 475.5 mg/kg，60 d時土壤總含鉀量分別為13 383.6、13 404.8、13 405.5 mg/kg（圖2A）。在0 d時，各處理土壤緩效鉀初始含量均為1 065.6 mg/kg（圖2B），在30、45、60 d時，CK土壤的緩效鉀含量分別為1 078.6、1 105.8、1 068.7 mg/kg，添加解鉀菌肥的ML1、ML2、ML3處理土壤的緩效鉀含量在45 d達(dá)最高，分別為1 128.6、1 163.2、1 169.8 mg/kg，均顯著高于CK（圖2B）（P＜0.05）。在30～60 d時速效鉀含量呈下降趨勢，這可能是由于所施鉀肥主要是速效鉀，在短期內(nèi)煙草不能消耗完全，多余的速效鉀向緩效鉀轉(zhuǎn)換，當(dāng)土壤中的速效含鉀量不足時，緩效鉀又開始轉(zhuǎn)換為速效鉀供植物利用。在整個觀測周期內(nèi)，各處理中土壤速效鉀一直呈下降趨勢（圖2C）。0 d時，速效鉀初始含量均為132.7 mg/kg，在團棵期（30 d）、成熟期（60 d）和采摘期（90 d）CK土壤速效鉀含量分別為110.6、69.5、68.7 mg/kg；90 d時ML1、ML2、ML3處理的土壤速效含鉀量分別為89.2、87.6、80.4 mg/kg，均顯著高于CK。該結(jié)果表明解鉀菌肥的施用有利于將礦物中的不可利用鉀轉(zhuǎn)換成為速效鉀。

圖2 不同盆栽試驗處理對土壤總鉀（A）、緩效鉀（B）、速效鉀（C）含量的影響

在煙草移栽后60 d內(nèi)，煙葉的含鉀量呈不斷下降趨勢，30～60 d時CK、ML1、ML2、ML3處理的中上部煙葉含鉀量分別下降57.90%、48.40%、45.70%、45.10%，下降幅度由高至低排序為CK、ML1、ML2、ML3（圖3A）；CK、ML1、ML2、ML3處理的下部葉含鉀量分別下降20.30%、11.10%、9.80%、9.20%，下降幅度由高至低排序為CK、ML1、ML2、ML3（圖3B），說明添加解鉀菌NGW1及礦粉可以減緩葉片中鉀流失速度。60 d時這4個處理的中上部煙葉含鉀量分別為1.49%、1.81%、1.85%、1.90%，添加解鉀菌的處理ML1、ML2、ML3中上部煙葉含鉀量分別比CK高21.48%、24.16%、27.52%（圖3A）。60 d時這4個處理的下部葉含鉀量為1.43%、1.52%、1.56%、1.57%，添加解鉀菌的處理ML1、ML2、ML3下部煙葉含鉀量分別比CK高6.29%、9.09%、9.79%（圖3B）。以上數(shù)據(jù)說明解鉀菌有利于煙葉中鉀素積累。ML2和ML3處理的中上部煙葉含鉀量與ML1相比差異不顯著，下部煙葉含鉀量與ML1相比差異顯著，分別高出ML1處理2.63%、3.29%，說明在添加解鉀菌基礎(chǔ)上添加礦粉有利于煙葉含鉀量的進一步提高。

圖3 不同處理對盆栽煙草中上部葉（A）和下部葉（B）含鉀量的影響

2.3.3 膠質(zhì)芽孢桿菌NGW1在煙草根際土壤中的定殖為考察解鉀菌NGW1能否在煙草根際穩(wěn)定定殖，測定了NGW1菌株在盆栽煙草植株根際的活菌數(shù)。結(jié)果顯示（表6），添加菌肥后1 d，盆栽根際土壤計數(shù)結(jié)果顯示3個處理中，NGW1菌株數(shù)量為4.46×107～5.11×107CFU/g。添加菌肥后20 d，ML1、ML2和ML3處理的NGW1細(xì)胞數(shù)量下降2個數(shù)量級，分別為（1.72±0.39）×105CFU/g、（2.47±0.21）×105CFU/g、（2.59±0.31）×105CFU/g。添加菌肥30 d時，3個處理的根際活菌數(shù)分別回升至（4.67±0.46）×105CFU/g、（4.50±0.46）×105CFU/g、（5.33±0.12）×105CFU/g。在30～60 d時段內(nèi)，根際活菌數(shù)逐步降低，至檢測結(jié)束時（60 d）3個添加菌肥處理的土壤根際活菌數(shù)分別為（2.27±0.31）×105CFU/g、（2.77±0.15）×105CFU/g、（3.15±0.23）×105CFU/g。以上數(shù)據(jù)說明，以麥麩為載體配制的膠質(zhì)芽孢桿菌菌肥能夠與化學(xué)肥料混合施用，NGW1菌株在煙草根際能夠穩(wěn)定定殖且具有較高的定殖密度。

表6 NGW1菌株在盆栽煙草根際的定殖情況

3 討論

煙草是喜鉀植物，因此鉀對煙草有重要的生理作用［17，18］，其含量是評價煙葉品質(zhì)的重要指標(biāo)。由于土壤鉀素供應(yīng)的限制，煙葉中的鉀難以達(dá)到高含量。中國規(guī)定煙葉含鉀量2%以上為優(yōu)質(zhì)煙。李強等［19］分析了中國煙葉的含鉀量，結(jié)果表明，河南、黑龍江等地區(qū)煙葉平均含鉀量僅為1.31%～1.45%，與優(yōu)質(zhì)煙草相比存在一定差距，促進煙草對鉀元素的吸收利用對國內(nèi)煙草品質(zhì)的提升具有重要意義。本研究CK中上部煙葉含鉀量為1.49%，下部煙葉含鉀量為1.43%，與河南、黑龍江等地區(qū)煙葉平均含鉀量相近，添加解鉀菌NGW1后各部位煙葉含鉀量均顯著上升，表明該菌肥可以有效促進有效鉀含量較低地區(qū)煙草對鉀元素的吸收利用。此外，本研究的結(jié)果還顯示，隨著煙草生長時間的增長，煙葉的鉀含量逐漸減少，且煙葉鉀含量的流失主要發(fā)生在30～45 d的時間段內(nèi)，該現(xiàn)象與化黨領(lǐng)等［20］總結(jié)的鉀在煙草中的分配規(guī)律相符，其認(rèn)為鉀在煙葉中所占比例較低，約占總吸鉀量的46%～49%；隨著煙草株齡的增長，鉀在煙葉中所占比例逐漸減少，而鉀在煙莖中所占比例逐漸升高，這一現(xiàn)象在煙草進入成熟期后尤為明顯。

含鉀量的提升除了促進煙葉品質(zhì)的提升外，還對煙草植株的生長具有顯著的促進作用。本研究中施用解鉀菌的ML1、ML2和ML3處理的有效葉數(shù)、株高、最大葉寬、莖圍都顯著高于CK，其中又以對株高的促進幅度最大。目前的研究顯示，鉀離子是煙株生命活動中60多種酶的活化劑。這些酶部分參與細(xì)胞的呼吸作用，如氧化還原酶；部分參與物質(zhì)的合成代謝，如轉(zhuǎn)移酶、合成酶。鉀離子還參與煙株光合作用產(chǎn)生的同化物質(zhì)的合成，如糖類合成、脂類合成、蛋白質(zhì)合成等。鉀元素對光合作用等同化途徑的促進作用對煙草植株的生長具有關(guān)鍵的影響。司叢叢等［21］的研究還表明鉀元素可以提高作物的抗逆性。馬新明等［22］的研究表明煙草鉀離子含量與煙草各級側(cè)根的數(shù)量與生長速度呈正相關(guān)，說明鉀離子可以促進煙草根系生長。由此可見，解鉀菌對煙葉品質(zhì)和產(chǎn)量的提升作用是通過促進多種相關(guān)代謝途徑來實現(xiàn)的。

綜上所述，本研究分離的膠質(zhì)芽孢桿菌NGW1菌株能夠通過促進土壤中礦物鉀元素的釋放，提升土壤中的緩效鉀、速效鉀含量，并促進煙草植株對鉀元素的吸收，顯著提升煙草株高、最大葉長、最大葉寬、莖圍等農(nóng)藝性狀指標(biāo)，提高煙葉產(chǎn)量及品質(zhì)。