基于指紋圖譜和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的南柴胡質(zhì)量標(biāo)志物預(yù)測(cè)分析

曲中原，吳 雙，鄭 巖，羅龍?zhí)?，邴一凡，鄒 翔，李 雪，李文蘭, 2

基于指紋圖譜和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的南柴胡質(zhì)量標(biāo)志物預(yù)測(cè)分析

曲中原1，吳 雙1，鄭 巖1，羅龍?zhí)?，邴一凡1，鄒 翔2*，李 雪1，李文蘭1, 2

1. 哈爾濱商業(yè)大學(xué)藥學(xué)院 中藥學(xué)專業(yè)教研室，黑龍江 哈爾濱 150076 2. 哈爾濱商業(yè)大學(xué)藥學(xué)院 藥物工程技術(shù)研究中心，黑龍江 哈爾濱 150076

基于指紋圖譜和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析南柴胡中潛在的質(zhì)量標(biāo)志物（quality marker，Q-Marker）并測(cè)定其含量。運(yùn)用高效液相色譜法建立南柴胡藥材指紋圖譜，確認(rèn)共有峰并進(jìn)行指認(rèn)，再運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法構(gòu)建“活性成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)，預(yù)測(cè)Q-Marker，并測(cè)定其含量。建立了12批南柴胡藥材指紋圖譜，確認(rèn)了13個(gè)共有峰，通過柴胡皂苷對(duì)照品指認(rèn)5個(gè)色譜峰，分別為柴胡皂苷a、柴胡皂苷b2、柴胡皂苷c、柴胡皂苷d、柴胡皂苷f；經(jīng)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)確認(rèn)以上5種成分為活性成分，可作用于14個(gè)核心靶點(diǎn)、20條關(guān)鍵通路發(fā)揮抗炎、抗抑郁、抗腫瘤作用，初步預(yù)測(cè)柴胡皂苷a、柴胡皂苷b2、柴胡皂苷c、柴胡皂苷d、柴胡皂苷f為南柴胡潛在的Q-Marker，南柴胡藥材中其總質(zhì)量分?jǐn)?shù)不低于0.10%。南柴胡Q-Marker預(yù)測(cè)分析為藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考，為闡明其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

南柴胡；質(zhì)量標(biāo)志物；指紋圖譜；網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)；柴胡皂苷a；柴胡皂苷b2；柴胡皂苷c；柴胡皂苷d；柴胡皂苷f

柴胡始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，被列為上品[1]，因其藥用價(jià)值和良好的臨床療效，一直被廣泛應(yīng)用。柴胡為常用解表藥，能入少陽(yáng)經(jīng)，長(zhǎng)于疏解半表半里之邪，在抗擊新冠冠狀病毒肺炎的良方清肺排毒湯、清肺達(dá)原顆粒和柴胡達(dá)胸合劑中，對(duì)外感發(fā)熱、寒熱往來等癥起到了關(guān)鍵的治療作用。此外，柴胡疏肝解郁，以其為君藥的逍遙丸、柴胡舒肝丸等在臨床療效顯著。我國(guó)含柴胡的中成藥品種超過500個(gè)，原藥材年需量在6000 t左右[2]。柴胡基原為傘形科植物柴胡DC.和狹葉柴胡Willd.，以根入藥，分別習(xí)稱“北柴胡”和“南柴胡”[3]。上世紀(jì)90年代柴胡野生品資源已瀕臨枯竭，目前市場(chǎng)以北柴胡為主流商品，家種和野生并存，且以家種為主。隨著黑龍江省大慶林甸種植技術(shù)的推廣，南柴胡家種品種植區(qū)域擴(kuò)大，市場(chǎng)流通逐漸增多。《中國(guó)藥典》2020年版柴胡的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)主要體現(xiàn)在對(duì)北柴胡藥材質(zhì)量的評(píng)價(jià)，尚無南柴胡質(zhì)量?jī)?yōu)劣評(píng)價(jià)[3]。柴胡皂苷成分是柴胡主要藥效物質(zhì)基礎(chǔ)[4-5]，但南柴胡與北柴胡在柴胡皂苷的種類和含量上有較大差異[6]。針對(duì)日漸增多的南柴胡家種品流入市場(chǎng)，急需確定藥效相關(guān)成分評(píng)價(jià)南柴胡的質(zhì)量。

劉昌孝院士[7]于2016年提出的中藥質(zhì)量標(biāo)志物（quality marker，Q-Marker）概念，將中藥有效性-物質(zhì)基礎(chǔ)-質(zhì)量控制標(biāo)志性成分相關(guān)聯(lián)，為中藥的質(zhì)量控制研究指明了方向[8]。基于中藥是依靠其所含的多種化學(xué)成分發(fā)揮藥效作用，本研究建立能體現(xiàn)南柴胡化學(xué)成分整體性的指紋圖譜，對(duì)藥效明確的皂苷類成分進(jìn)行指認(rèn)[9-10]，再運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法確定活性成分，發(fā)現(xiàn)潛在的Q-Marker，并預(yù)測(cè)其治療疾病的作用靶點(diǎn)及機(jī)制[11-12]，進(jìn)一步測(cè)定Q-Marker的含量，為建立南柴胡家種品優(yōu)劣評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)提供參考。

1 材料

1.1 藥材

南柴胡（批號(hào)S1、S2）采自黑龍江省黑河市嫩江縣種植點(diǎn)，南柴胡（批號(hào)S3、S4）采自內(nèi)蒙古自治區(qū)呼和浩特市興安盟種植點(diǎn)，南柴胡（批號(hào)S5、S6）采自黑龍江省齊齊哈爾市龍江縣種植點(diǎn)，南柴胡（批號(hào)S7、S8、S9、S12）采自黑龍江省大慶市林甸縣種植點(diǎn)，栽培藥材均為3年生，于9月份采集。南柴胡（批號(hào)S10、S11，產(chǎn)地分別為黑龍江省大慶市泰康縣、大同區(qū)）為野生品，購(gòu)自黑龍江省哈爾濱三棵樹中藥材專業(yè)市場(chǎng)。以上藥材經(jīng)哈爾濱商業(yè)大學(xué)藥學(xué)院金哲雄教授鑒定均為傘形科植物狹葉柴胡Willd.的干燥根，標(biāo)本保存于哈爾濱商業(yè)大學(xué)中藥標(biāo)本館。

1.2 藥品與試劑

柴胡皂苷a對(duì)照品（批號(hào)110777-201711）、柴胡皂苷d對(duì)照品（批號(hào)110778-201711）購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%；柴胡皂苷b2對(duì)照品（批號(hào)AB213S）、柴胡皂苷c對(duì)照品（批號(hào)AB214S）購(gòu)自天津一方科技有限公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%；柴胡皂苷f對(duì)照品（批號(hào)P14N7F24838，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；乙腈、甲醇（色譜純）購(gòu)自德國(guó)Merck公司；純凈水購(gòu)自廣州屈臣氏有限公司。

1.3 儀器

U3000高效液相色譜儀（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）；萬分之一電子天平（北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；JM電子天平（諸暨市超澤衡器設(shè)備有限公司）；SK3310HP型超聲波清洗器（上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司）；FW100型高速萬能粉碎機(jī)（天津市泰斯特儀器有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 南柴胡高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜的建立

2.1.1 色譜條件 Waters Sun fire C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相為乙腈（A）-水（B），梯度洗脫：0～5 min，25%～37% A；5～10 min，37% A；10～50 min，37%～90% A；50～55 min，90% A；55～60 min，90%～25% A；檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm；體積流量為1 mL/min；柱溫為30 ℃；進(jìn)樣量為10 μL。

2.1.2 供試品溶液的制備 取12批南柴胡藥材，粉碎后過4號(hào)篩，精密稱定5.0 g南柴胡粉末，置具塞錐形瓶中，加入50 mL含5%濃氨試液的甲醇溶液，密塞，30 ℃超聲30 min，濾過，用20 mL甲醇分2次洗滌容器及藥渣，洗液與濾液合并，回收溶劑；殘?jiān)蛹状既芙猓D(zhuǎn)移至5 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻后濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.1.3 混合對(duì)照品溶液的制備 精密稱定柴胡皂苷a、柴胡皂苷b2、柴胡皂苷c、柴胡皂苷d、柴胡皂苷f對(duì)照品，置于25 mL量瓶中，加甲醇振搖溶解，定容，制得混合對(duì)照品溶液，柴胡皂苷a、柴胡皂苷b2、柴胡皂苷c、柴胡皂苷d和柴胡皂苷f的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.92、2.40、0.86、1.38、1.96 mg/mL。

2.1.4 方法學(xué)考察

（1）參照峰選擇：柴胡皂苷d是南柴胡的主要成分，其峰面積適中，色譜峰保留時(shí)間（R）穩(wěn)定，因此選擇柴胡皂苷d作為參照峰，計(jì)算各共有峰的相對(duì)峰面積和相對(duì)保留時(shí)間。

（2）精密度試驗(yàn)：取南柴胡S9批次供試品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖。各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD小于0.75%，相對(duì)峰面積RSD小于3.55%，表明儀器精密度良好。

（3）重復(fù)性試驗(yàn)：平行制備6份南柴胡S9批次供試品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖。各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD小于0.62%，相對(duì)峰面積RSD小于3.60%，表明該方法重復(fù)性良好。

（4）穩(wěn)定性試驗(yàn)：取南柴胡S9批次供試品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件分別于0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。各共有峰的相對(duì)峰面積和相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于2.00%，表明供試品在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.5 指紋圖譜的建立與評(píng)價(jià) 將12批南柴胡的色譜圖依次導(dǎo)入國(guó)家藥典委員會(huì)研制的《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》（2012.130723版本）中，進(jìn)行全譜峰匹配，確定共有峰并進(jìn)行分析，建立指紋圖譜見圖1，其相似度分析結(jié)果見表1，除野生品S11與對(duì)照指紋圖譜相似度較低外，其余各批次南柴胡與對(duì)照指紋圖譜相似度為0.803～0.962。

圖1 12批南柴胡藥材指紋圖譜

表1 12批南柴胡藥材指紋圖譜相似度分析

2.1.6 指紋圖譜共有峰指認(rèn) 對(duì)12批南柴胡藥材指紋圖譜進(jìn)行分析，通過各色譜峰R以及色譜行為的比較，確認(rèn)13個(gè)共有峰，采用R對(duì)照法共指認(rèn)了5個(gè)共有峰，見圖2。

2.2 基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)南柴胡Q-Marker

2.2.1 “活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 將“2.1.6”項(xiàng)下指認(rèn)的柴胡皂苷a、柴胡皂苷b2、柴胡皂苷c、柴胡皂苷d、柴胡皂苷f作為南柴胡潛在質(zhì)量標(biāo)志物候選活性成分，通過檢索中藥系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)庫(kù)TCMSP（http://tcmspw.com/tcmsp.php）、PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/）、Pharm Mapper 數(shù)據(jù)庫(kù)（http://lilab.ecust.edu.cn/ pharmmapper/index.php）查找5個(gè)活性成分的作用靶點(diǎn)；通過Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.uniprot.org/）將預(yù)測(cè)出的靶點(diǎn)名稱轉(zhuǎn)換為對(duì)應(yīng)的基因名。將各數(shù)據(jù)庫(kù)篩選出的靶點(diǎn)合并，除去重復(fù)靶點(diǎn)，最終得到與5個(gè)活性成分相關(guān)的75個(gè)靶點(diǎn)；將5個(gè)候選活性成分和75個(gè)靶點(diǎn)通過Cytoscape 3.2.1構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)圖，如圖3所示。

2.2.2 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析 將“2.2.1”項(xiàng)下篩選出的75個(gè)靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING 11.0數(shù)據(jù)庫(kù)（https://string-db.org/cgi/input.pl）進(jìn)行PPI分析，物種設(shè)置為“Homo sapiens”，蛋白交互參數(shù)評(píng)分值設(shè)置為“high confidence＞0.7”，隱藏網(wǎng)絡(luò)中無聯(lián)系的節(jié)點(diǎn)，其余參數(shù)設(shè)置不變，獲得核心靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)圖見圖4，將度值大于2倍中位數(shù)值作為篩選條件，篩選得到14個(gè)核心靶點(diǎn)，分別為絲裂原活化蛋白激酶1（mitogen-activated protein kinase 1，MAPK1）、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子2（fibroblast growth factor 2，F(xiàn)GF2）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（caspase 3，CASP3）、MAPK8、B淋巴細(xì)胞瘤2（B-cell lymphoma 2，BCL2）、BCL2L1、信號(hào)傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transducers and activators of transcription 3，STAT3）、蛋白磷酸酶2催化亞基α（protein phosphatase2 catalytic subunit alpha，PPP2CA）、原癌基因蛋白MYC、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶1（cyclin dependent kinase 1，CDK1）、CDK2、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤基因1（retinoblastoma 1，RB1）、表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）。

1-柴胡皂苷c 2-柴胡皂苷f 4-柴胡皂苷a 5-柴胡皂苷b2 6-柴胡皂苷d 14-柴胡皂苷b1

2.2.3 基因本體（gene ontology，GO）功能富集分析和京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）富集分析 GO分析分為生物過程（biological process，BP）、細(xì)胞組分（cellular component，CC）、分子功能（molecular function，MF）3個(gè)部分，使用David數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)14個(gè)核心靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能分析，以＜0.05為篩選條件，共獲得125條結(jié)果，其中96條與BP有關(guān)、9條與CC有關(guān)、19條與MF有關(guān)。根據(jù)值由大到小排序，取前20條結(jié)果，進(jìn)行可視化分析，如圖5所示，BP主要與細(xì)胞凋亡、細(xì)胞增殖、線粒體膜通透性、RNA聚合酶II啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄等有關(guān)；CC主要涉及細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)、線粒體等；MF主要涉及蛋白質(zhì)結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶活性、組蛋白激酶活性等。使用David數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)14個(gè)核心靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG分析，共得到51條結(jié)果，根據(jù)值由大到小排序，取前20條通路，進(jìn)行可視化分析，如圖6所示，南柴胡主要通過作用于癌癥、胰腺癌、磷脂酰肌醇3-激酶-蛋白激酶B（phosphatidylinositol 3-kinase-protein kinase B，PI3K-Akt）等信號(hào)通路發(fā)揮藥效作用。

圖3 “活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖

圖4 PPI網(wǎng)絡(luò)

圖5 GO功能分析

圖6 前20條KEGG分析

2.2.4 “活性成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析 根據(jù)查找得到的5個(gè)活性成分、14個(gè)核心靶點(diǎn)和20條通路相互關(guān)系，運(yùn)用Cytoscape 3.2.1軟件構(gòu)建“活性成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖，見圖7。

2.3 南柴胡中柴胡皂苷類成分的含量測(cè)定

2.3.1 線性關(guān)系考察 分別精密量取“2.1.3”項(xiàng)下的混合對(duì)照品溶液0.2、1.0、2.0、4.0、6.0、10.0 mL置10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，靜置，得到一系列不同質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品稀釋液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖。以進(jìn)樣質(zhì)量為橫坐標(biāo)（），峰面積為縱坐標(biāo)（），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程，結(jié)果見表2。

2.3.2 方法學(xué)考察

（1）精密度試驗(yàn)：取南柴胡S9批次供試品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖。柴胡皂苷a、柴胡皂苷b2、柴胡皂苷c、柴胡皂苷d、柴胡皂苷f保留時(shí)間的RSD分別為0.42%、0.35%、0.88%、0.28%、0.37%；峰面積RSD分別為2.24%、3.11%、2.51%、3.13%、1.98%，表明儀器精密度良好。

菱形為活性成分，圓形為靶點(diǎn)，三角形為通路

表2 線性關(guān)系考察結(jié)果

（2）穩(wěn)定性試驗(yàn)：取南柴胡S9批次供試品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件分別于0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣分析，柴胡皂苷a、柴胡皂苷b2、柴胡皂苷c、柴胡皂苷d、柴胡皂苷f保留時(shí)間的RSD分別為0.26%、0.35%、1.18%、0.37%、0.68%；峰面積的RSD分別為2.18%、1.67%、2.36%、2.46%、1.66%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

（3）重復(fù)性試驗(yàn)：平行制備6份南柴胡S9批次供試品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定。柴胡皂苷a、柴胡皂苷b2、柴胡皂苷c、柴胡皂苷d、柴胡皂苷f保留時(shí)間的RSD分別為0.58%、0.22%、0.53%、0.28%、0.39%；平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為196.41、129.41、172.51、108.92、623.18 μg/g，RSD分別為2.09%、1.77%、1.88%、1.79%、2.02%，表明該方法重復(fù)性良好。

（4）加樣回收率試驗(yàn)：精密稱定6份已知5種成分含量的南柴胡S9批次粉末，每份約2.5 g，根據(jù)樣品中各成分含量，按1∶1比例精密加入相應(yīng)對(duì)照品，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定。柴胡皂苷a、柴胡皂苷b2、柴胡皂苷c、柴胡皂苷d、柴胡皂苷f的加樣回收率分別為98.50%、98.47%、99.83%、97.53%、97.17%，RSD分別為3.47%、4.32%、3.65%、3.87%、3.98%，表明實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確。

2.3.3 樣品測(cè)定 分別精密稱取12批南柴胡藥材粉末，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，測(cè)定峰面積，計(jì)算樣品中柴胡皂苷a、柴胡皂苷b2、柴胡皂苷c、柴胡皂苷d、柴胡皂苷f的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。結(jié)果見表3，12批南柴胡藥材中5種柴胡皂苷總質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.10%～0.44%。

表3 12批南柴胡藥材中柴胡皂苷類成分的含量

3 討論

中藥質(zhì)量關(guān)乎中醫(yī)臨床的療效，更關(guān)乎中藥行業(yè)高質(zhì)量發(fā)展，因此需要不斷對(duì)中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)體系進(jìn)行完善，使其具有科學(xué)性、先進(jìn)性和實(shí)用性。中藥成分復(fù)雜、療效多樣，單一化學(xué)對(duì)照難以體現(xiàn)中藥的特點(diǎn)和優(yōu)勢(shì)。中藥Q-Marker研究方法的提出，為整合現(xiàn)有化學(xué)和藥理研究基礎(chǔ)，厘清中藥與臨床作用密切相關(guān)的化學(xué)物質(zhì)提供了新思路[7]。目前，不同中藥的Q-Marker和同一中藥不同功效的Q-Marker研究均取得了新的進(jìn)展。不同基原的中藥在化學(xué)成分上存在較大差異，開展多基原藥材的Q-Marker研究是一項(xiàng)系統(tǒng)工程。本研究對(duì)柴胡的基原之一狹葉柴胡的Q-Marker進(jìn)行研究，為建立南柴胡質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)奠定基礎(chǔ)。

柴胡和狹葉柴胡的根分別習(xí)稱為北柴胡和南柴胡，北柴胡的稱謂在明朝時(shí)出現(xiàn)，南柴胡性狀與北柴胡不同，其產(chǎn)區(qū)與北柴胡基本相同，在我國(guó)大部分地區(qū)均有分布，主產(chǎn)于東北、華北、華東及西北地區(qū)，以黑龍江省、內(nèi)蒙古自治區(qū)、河北省產(chǎn)量較大[13-15]。《東北植物志》第3分冊(cè)最早將南柴胡的中文學(xué)名定為狹葉柴胡[16]。肖培根在《東北植物藥圖志》詳細(xì)描述了南柴胡的形態(tài)特征[17]。新中國(guó)成立后，由于中醫(yī)藥事業(yè)的發(fā)展，柴胡需求量連年增長(zhǎng)，人類生產(chǎn)活動(dòng)對(duì)柴胡生境的破壞以及過度采挖，導(dǎo)致柴胡野生資源逐漸枯竭。20世紀(jì)80年代，北柴胡變野生為家種取得成功，逐漸成為柴胡的主流商品，而南柴胡在市場(chǎng)上逐漸銷聲匿跡[18]。近年黑龍江省大慶市林甸縣南柴胡仿野生栽培獲得成功，3年生柴胡家種品表面呈紅棕色或紅褐色，近根頭部有許多細(xì)而緊密的環(huán)紋，有顯著敗油氣，具有柴胡野生品的性狀特征，受到市場(chǎng)的認(rèn)可。該種植技術(shù)已在我國(guó)東北地區(qū)、內(nèi)蒙古自治區(qū)進(jìn)行推廣種植，目前已有大量的柴胡家種品進(jìn)入藥材市場(chǎng)。針對(duì)目前南柴胡質(zhì)量評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)中優(yōu)劣評(píng)價(jià)方法尚未建立，本研究采集了黑龍江省大慶市林甸縣、齊齊哈爾市龍江縣、黑河市嫩江縣產(chǎn)區(qū)以及內(nèi)蒙古自治區(qū)呼和浩特市興安盟產(chǎn)區(qū)10份柴胡家種品及2份野生品開展鑒定與評(píng)價(jià)研究，預(yù)測(cè)南柴胡的Q-Marker。

本研究首先建立12批南柴胡藥材指紋圖譜，對(duì)其化學(xué)成分進(jìn)行表征。南柴胡主要有效成分柴胡皂苷均為五環(huán)三萜皂苷，位于較低波長(zhǎng)的紫外吸收區(qū)，紫外吸收較差，色譜圖上吸收峰較低。雖然HPLC采用蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（ELSD）可對(duì)柴胡皂苷類成分有更高的響應(yīng)值[19]，但由于ELSD檢測(cè)器靈敏度低，易丟失很多指紋峰，因此本研究采用HPLC-二極管陣列檢測(cè)器（PDA）法建立了南柴胡色譜指紋圖譜，確定了13個(gè)共有峰，通過對(duì)照品指認(rèn)出5個(gè)色譜峰，分別為柴胡皂苷a、柴胡皂苷b2、柴胡皂苷c、柴胡皂苷d、柴胡皂苷f，北柴胡色譜圖與栽培南柴胡有較大差異，表明本研究建立的以5種柴胡皂苷為代表的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)化合物群所表征的指紋圖譜可用于南柴胡的定性鑒別。進(jìn)一步采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對(duì)指認(rèn)出的5種柴胡皂苷進(jìn)行藥效成分篩選與靶點(diǎn)預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)柴胡皂苷a、柴胡皂苷b2、柴胡皂苷c、柴胡皂苷d、柴胡皂苷f主要作用于MAPK1、FGF2、CASP3、MAPK8等14個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)，通過PI3K-Akt、Ras、MAPK和缺氧誘導(dǎo)因子-1（hypoxia inducible factor-1，HIF-1）等信號(hào)通路發(fā)揮抗抑郁、抗炎、抗腫瘤作用。PI3K-Akt信號(hào)通路是治療抑郁癥的重要信號(hào)通路[20-22]。Seo等[23]發(fā)現(xiàn)柴胡皂苷能夠通過激活PI3K/Akt/糖原合成酶激酶-3β（glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β）信號(hào)通路發(fā)揮抗抑郁作用。大腦前額葉皮質(zhì)中樹突棘是神經(jīng)元接收來自通信輸入的突起，樹突棘消除增加、形成減少與抑郁相關(guān)行為的產(chǎn)生有關(guān)[24]。Ras信號(hào)通路介導(dǎo)并調(diào)節(jié)成人大腦中樹突棘形成，柴胡皂苷能否通過Ras信號(hào)通路促進(jìn)樹突棘再生仍需后續(xù)研究。炎癥是一種機(jī)體應(yīng)對(duì)感染、組織損傷或細(xì)胞應(yīng)激的反應(yīng)，會(huì)激活PI3K-Akt、MAPK等多條信號(hào)通路[25]。柴胡皂苷d能夠通過調(diào)控PI3K-Akt信號(hào)通路，上調(diào)BCL2蛋白表達(dá)，從而減輕胃黏膜炎性損傷[26]；柴胡皂苷a能夠抑制脂多糖誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞中MAPK和核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信號(hào)通路活化及炎癥介質(zhì)產(chǎn)生，從而發(fā)揮抗炎作用[27-28]。PI3K/Akt、Ras和MAPK信號(hào)通路與癌癥密切相關(guān)[29-30]。柴胡皂苷d能夠抑制NF-κB/MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激活，抑制骨肉瘤SAOS-2細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，并促進(jìn)SAOS-2細(xì)胞凋亡[31]；柴胡皂苷d可激活人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞MAPK信號(hào)通路，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[32]；柴胡皂苷d可通過調(diào)控PI3K/Akt/雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）通路抑制胰腺星狀細(xì)胞自噬，改善胰腺纖維化[33]。HIF-1α是腫瘤細(xì)胞低氧反應(yīng)的重要媒介，可上調(diào)VEGF表達(dá)。柴胡皂苷d可通過抑制STAT3激活，下調(diào)HIF-1α和COX-2表達(dá)，從而抑制肝癌SMMC-7721細(xì)胞增殖[34]；柴胡皂苷d能夠通過抑制HIF-1α表達(dá)，對(duì)缺氧狀態(tài)下的肝癌細(xì)胞起到放射增敏作用[35]。

綜上，本研究基于指紋圖譜和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，確定柴胡皂苷a、柴胡皂苷b2、柴胡皂苷c、柴胡皂苷d、柴胡皂苷f為南柴胡潛在Q-Marker，為南柴胡質(zhì)量評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)的提升及其相關(guān)制劑的質(zhì)量控制提供參考。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1] 尚志鈞校注. 神農(nóng)本草經(jīng) [M]. 北京: 學(xué)苑出版社, 2002: 54-55.

[2] 劉瀟瀟, 陳馥, 林錦鋒, 等. 含柴胡中成藥的質(zhì)量控制方法探討 [J]. 中國(guó)藥學(xué)雜志, 2019, 54(17): 1452-1456.

[3] 中國(guó)藥典[S]. 一部. 2020: 293-295.

[4] 林飛武, 王自善, 戎珍, 等. 柴胡的藥理作用、化學(xué)成分及開發(fā)利用研究 [J]. 亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥, 2020, 16(10): 202-205.

[5] 宋登鵬, 王雪芹, 王永慧, 等. 柴胡皂苷類化合物體內(nèi)代謝途徑及其代謝產(chǎn)物的研究進(jìn)展 [J]. 藥物評(píng)價(jià)研究, 2019, 42(7): 1460-1466.

[6] 冒興建, 周云中. 南、北柴胡根與莖葉主要成分的比較 [J]. 江蘇藥學(xué)與臨床研究, 1999, 7(1): 42-44.

[7] 劉昌孝, 陳士林, 肖小河, 等. 中藥質(zhì)量標(biāo)志物（Q-Marker）: 中藥產(chǎn)品質(zhì)量控制的新概念 [J]. 中草藥, 2016, 47(9): 1443-1457.

[8] 張鐵軍, 白鋼, 陳常青, 等. 基于“五原則”的復(fù)方中藥質(zhì)量標(biāo)志物（Q-Marker）研究路徑 [J]. 中草藥, 2018, 49(1): 1-13.

[9] 謝培山. 中藥色譜指紋圖譜鑒別的概念、屬性、技術(shù)與應(yīng)用 [J]. 中國(guó)中藥雜志, 2001, 26(10): 653-655.

[10] 張慧, 陳燕, 汪佳楠, 等. 指紋圖譜技術(shù)在中藥配方顆粒質(zhì)量評(píng)價(jià)及過程控制中的應(yīng)用 [J]. 中國(guó)中藥雜志, 2018, 43(19): 3822-3827.

[11] 周文霞, 程肖蕊, 張永祥. 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué): 認(rèn)識(shí)藥物及發(fā)現(xiàn)藥物的新理念 [J]. 中國(guó)藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志, 2012, 26(1): 4-9.

[12] Wang Y L, Cui T, Li Y Z,. Prediction of quality markers of traditional Chinese medicines based on network pharmacology [J]., 2019, 11(4): 349-356.

[13] 王暉, 張改霞, 楊成民, 等. 歷代本草所用柴胡物種辨析 [J]. 中草藥, 2018, 49(20): 4928-4934.

[14] 謝宗萬. 中藥材品種論述 [M]. 上海: 上?？茖W(xué)技術(shù)出版社, 1964: 185-186.

[15] 楊林林, 趙鈺, 韓梅, 等. 北柴胡和狹葉柴胡中黃酮類成分及其關(guān)鍵酶基因表達(dá)的組織差異分析 [J]. 中草藥, 2019, 50(1): 188-194.

[16] 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院林業(yè)土壤研究所植物組. 東北植物志（第3分冊(cè)）[M]. 哈爾濱: 力行謄寫印刷社, 1955: 492-493.

[17] 肖培根. 東北植物藥圖誌 [M]. 北京: 人民衛(wèi)生出版社, 1959: 52.

[18] 金世元. 金世元中藥材傳統(tǒng)鑒別經(jīng)驗(yàn) [M]. 北京: 中國(guó)中醫(yī)藥出版社, 2012: 22-24.

[19] 叢夢(mèng)雨, 龔彥溶, 梁莎碧, 等. HPLC-ELSD指紋圖譜分析提取與炮制對(duì)柴胡中化學(xué)成分的影響 [J]. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志, 2018, 24(7): 13-17.

[20] Tao W W, Dong Y, Su Q,. Liquiritigenin reverses depression-like behavior in unpredictable chronic mild stress-induced mice by regulating PI3K/Akt/mTOR mediated BDNF/TrkB pathway [J]., 2016, 308: 177-186.

[21] Wu Z T, Wang G H, Wei Y Y,. PI3K/AKT/GSK3β/ CRMP-2-mediated neuroplasticity in depression induced by stress [J]., 2018, 29(15): 1256-1263.

[22] 劉敏, 孫亞南, 于春月, 等. 柴胡皂苷a抗抑郁作用機(jī)制的研究進(jìn)展[J]. 現(xiàn)代藥物與臨床, 2019, 34(3): 867-871.

[23] Seo M K, Song J C, Lee S J,. Antidepressant-like effects ofextract [J]., 2012, 4(4): 392-399.

[24] Moda-Sava R N, Murdock M H, Parekh P K,. Sustained rescue of prefrontal circuit dysfunction by antidepressant-induced spine formation [J]., 2019, 364(6436): eaat8078.

[25] 嵇瑩瑩, 龔國(guó)清. PI3K/Akt/mTOR通路在炎癥相關(guān)疾病中分子機(jī)制研究進(jìn)展 [J]. 藥學(xué)研究, 2018, 37(4): 226-229.

[26] 沈珊. 柴胡皂苷d對(duì)順鉑導(dǎo)致大鼠胃粘膜炎性損傷的保護(hù)作用機(jī)制研究 [D]. 沈陽(yáng): 遼寧中醫(yī)藥大學(xué), 2018.

[27] 程海飛, 陳艷琳, 范紹輝, 等. MAPK信號(hào)通路在急性肺損傷進(jìn)程中的研究進(jìn)展 [J]. 醫(yī)學(xué)綜述, 2020, 26(13): 2523-2528.

[28] Zhu J, Luo C Q, Wang P,. Saikosaponin A mediates the inflammatory response by inhibiting the MAPK and NF-κB pathways in LPS-stimulated RAW 264.7 cells [J]., 2013, 5(5): 1345-1350.

[29] Asati V, Mahapatra D K, Bharti S K. PI3K/Akt/mTOR and Ras/Raf/MEK/ERK signaling pathways inhibitors as anticancer agents: Structural and pharmacological perspectives [J]., 2016, 109: 314-341.

[30] Santarpia L, Lippman S M, El-Naggar A K. Targeting the MAPK-RAS-RAF signaling pathway in cancer therapy [J]., 2012, 16(1): 103-119.

[31] 莊怡富, 干耀愷, 湯亭亭. 柴胡皂苷-d促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞凋亡的研究 [J]. 國(guó)際骨科學(xué)雜志, 2017, 38(2): 115-120.

[32] Fu R Q, Zhang L, Li Y Y,. Saikosaponin D inhibits autophagosome?lysosome fusion and induces autophagy? independent apoptosis in MDA?MB?231 breast cancer cells [J]., 2020, 22(2): 1026-1034.

[33] Cui L H, Li C X, Zhuo Y Z,. Saikosaponin d ameliorates pancreatic fibrosis by inhibiting autophagy of pancreatic stellate cells via PI3K/Akt/mTOR pathway [J]., 2019, 300: 18-26.

[34] He S X, Lu G F, Hou H L,. Saikosaponin?d suppresses the expression of cyclooxygenase?2 through the phospho?signal transducer and activator of transcription 3/hypoxia?inducible factor?1α pathway in hepatocellular carcinoma cells [J]., 2014, 10(5): 2556-2562.

[35] Wang B F, Wang X J, Kang H F,. Saikosaponin-D enhances radiosensitivity of hepatoma cells under hypoxic conditions by inhibiting hypoxia-inducible factor-1α [J]., 2014, 33(1): 37-51.

Predictive analysis of quality markers ofbased on fingerprint and network pharmacology

QU Zhong-yuan1, WU Shuang1, ZHENG Yan1, LUO Long-tan1, BING Yi-fan2, ZOU Xiang2, LI Xue1, LI Wen-lan1, 2

1. Department of Traditional Chinese Medicine, College of Pharmacy, Harbin University of Commerce, Harbin 150076, China 2. Pharmaceutical Engineering Technology Research Center, College of Pharmacy, Harbin University of Commerce, Harbin 150076, China

To predict potential quality marker (Q-Marker) ofbased on fingerprint detection and network pharmacology analysis, and determine the contents of Q-Marker.Fingerprint ofwas established by HPLC, common peaks were confirmed and identified. “Active component-target-pathway” network was constructed by network pharmacology method. Q-Marker were predicted and their contents were determined.Fingerprints of 12 batches ofwere established, 13 common peaks were identified, and 5 peaks (saikosaponin a, saikosaponin b2, saikosaponin c, saikosaponin d, and saikosaponin f) were identified by saikosaponin reference substances. According to network pharmacology, above five components were identified as active components of, which showed anti-inflammatory, antidepressant, and anti-tumor effects through acting on 14 core targets and 20 key pathways. Saikosaponin a, saikosaponin b2, saikosaponin c, saikosaponin d, and saikosaponin f were preliminarily predicted as potential Q-Marker of, total content of which were not less than 0.10%.Prediction and analysis of Q-Marker ofcan provide references for quality evaluation of medicinal materials and lay a foundation for elucidation of action mechanism of pharmacodynamic substance basis.

Willd; quality marker; fingerprint; network pharmacology; saikosaponin a; saikosaponin b2; saikosaponin c; saikosaponin d; saikosaponin f

R284.1；285.5

A

0253 - 2670(2021)09 - 2678 - 09

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.09.018

2021-02-20

哈爾濱商業(yè)大學(xué)青年創(chuàng)新人才支持計(jì)劃項(xiàng)目（2020CX11）

曲中原（1980—），女，博士，教授，博士生導(dǎo)師，從事中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)與中藥炮制研究。

鄒 翔（1978—），男，研究員，博士，博士生導(dǎo)師。Tel: (0451)84800297 E-mail: zou8663202@163.com

[責(zé)任編輯 李亞楠]