HPLC-MS/MS測定蜂花粉中4種有機磷類除草劑

郭愛靜，花中霞，張弘，張世勇，王小青，王可

石家莊市疾病預(yù)防控制中心，石家莊市化學(xué)毒物檢測及風(fēng)險預(yù)警技術(shù)創(chuàng)新中心（石家莊 050011）

蜂花粉是由蜜蜂采集的花粉、花蜜以及蜜蜂的唾液分泌物加工混合而成，被譽為活性天然代謝產(chǎn)物的“寶庫”[1-2]。蜂花粉營養(yǎng)非常豐富，含有氨基酸、碳水化合物、礦物質(zhì)、酚類化合物和其他生物活性物質(zhì)[3-4]，既是很好的天然營養(yǎng)食品，又具有抗菌消炎、抗癌和抗過敏等功效[5]，一直備受消費者的青睞[6]。由于花粉暴露于自然環(huán)境中，蜂花粉可以作為農(nóng)藥殘留的生物學(xué)標(biāo)記物[7]。文獻(xiàn)中關(guān)于蜂花粉中農(nóng)殘的檢測以殺蟲劑為主[8-10]，而對除草劑殘留的檢測鮮有報道。

有機磷類除草劑是一類含磷除草劑，常用的有莎稗磷、甲基胺草磷、抑草磷和哌草磷等，被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中。大部分有機磷農(nóng)藥屬于高毒性農(nóng)藥，可引起急性毒性[11]；有機磷類農(nóng)藥還具有神經(jīng)毒性，可引起神經(jīng)系統(tǒng)紊亂，還有致畸、致癌的風(fēng)險[12-13]。鑒于其危害和大范圍使用，世界各國均制定了食品中有機磷農(nóng)藥的殘留限量法規(guī)[14]，GB 2763—2019《食品中農(nóng)藥最大殘留限量》中規(guī)定在稻谷、糙米中莎稗磷的最大殘留量均為0.1 mg/kg[15]。

有機磷農(nóng)藥的主要儀器檢測方法有氣相色譜（GC）法[16]、液相色譜（LC）法[17]、氣相色譜質(zhì)譜（GC-MS）法[18]、氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（GC-MS/MS）法[19]、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）法[20]等。液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜在分析復(fù)雜基質(zhì)樣品中多組分的痕量分析方面具有高通量、高靈敏度和定性定量準(zhǔn)確等優(yōu)勢。目前，有機磷農(nóng)藥檢測種類以殺蟲劑和殺菌劑為主，除草劑的檢測相對較少，且分析對象以蔬菜、水果為主[16,18-19]，有關(guān)蜂花粉中有機磷類除草劑的檢測研究還未見報道。試驗以分散固相萃取法凈化，建立了蜂花粉中4種有機磷類除草劑的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析方法，并對凈化方式、色譜條件和質(zhì)譜參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。該方法準(zhǔn)確、快速、靈敏度高、選擇性好，適用于蜂花粉中有機磷類除草劑的檢測分析，為開展蜂花粉中除草劑殘留檢測提供了技術(shù)手段。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 1200-6410B高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，配ESI電離源（美國Agilent公司）；AE240電子天平（瑞士Mettler Toledo公司）；MS3渦旋振蕩器（德國IKA公司）；TG16-WS臺式高速離心機（湘鑫儀器儀表公司）；EVAP-12氮吹儀（美國Organomation公司）；Milli-Q超純水機（美國Millipore公司）。

莎稗磷（Anilofos，99.8%，德國Sigma-Alorich公司）；甲基胺草磷（Amiprofos-methyl，10 ng/μL，德國Dr.Ehrenstorfer公司）；抑草磷（Butamifos）、哌草磷（Piperophos）（純度≥98.0%，德國Dr.Ehrenstorfer公司）；乙腈、丙酮、乙酸乙酯（色譜純，德國Merck公司）；甲醇、二氯甲烷（色譜純，美國Fisher公司）；甲酸（色譜純）、N-丙基乙二胺（PSA）（AR，美國Dikma公司）；C18固相萃取柱（上海Welch公司）；無水硫酸鎂、氯化鈉（AR，天津永大化學(xué)試劑公司）；試驗用水為Milli-Q超純水。

1.2 混合標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的配制

分別準(zhǔn)確稱取甲基胺草磷、莎稗磷、抑草磷和哌草磷4種標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶解配制1.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，保存于-20 ℃冰箱，備用。臨用前用空白基質(zhì)提取溶液稀釋，配制成1.0，2.0，5.0，10.0，20.0，50.0，100.0和200.0 ng/mL混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列。

1.3 樣品前處理

精確稱取2 g蜂花粉樣品，置于50 mL離心管中，加入5 mL水后混勻，靜置10 min。再加入1 g氯化鈉和12 mL乙酸乙酯，渦旋30 s，超聲10 min，以4 000 r/min離心5 min，取出10 mL有機相轉(zhuǎn)移到放有1.0 g PSA的離心管中，渦旋30 s，離心5 min，取6 mL上清液，在40 ℃下氮吹至盡干，用1.0 mL甲醇/乙腈-水溶液（75∶25，V/V）復(fù)溶后，渦旋30 s，經(jīng)0.2 μm濾膜過濾，按儀器工作條件進(jìn)行HPLC-MS/MS測定。

1.4 色譜條件

色譜柱，Agilent ZORBAX XDB-C18色譜柱（4.6 mm× 50 mm，1.8 μm）；流速，0.3 mL/min；柱溫，30 ℃；進(jìn)樣量，3 μL；流動相A，0.1%甲酸水溶液；流動相B，甲醇/乙腈（50∶50，V/V）；流動相比例，75∶25（B∶A）。

1.5 質(zhì)譜條件

離子源，電噴霧離子源（ESI）；掃描方式，正離子掃描；監(jiān)測方式，多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；干燥氣溫度，350 ℃；干燥氣流速，10 L/min；霧化氣壓力，30 psi；毛細(xì)管電壓，4 000 V；碰撞氣，高純氮（N2，純度≥99.999%）；其它質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 4種有機磷類除草劑的保留時間和質(zhì)譜參數(shù)

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件優(yōu)化

有機磷類除草劑的結(jié)構(gòu)中均含有N、O等雜原子，在酸性環(huán)境中容易結(jié)合H+。因此，選擇電噴霧離子源正離子模式（ESI+）進(jìn)行檢測。以4種有機磷除草劑標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣，以全掃描模式（Scan）篩選母離子，結(jié)果發(fā)現(xiàn)各化合物的[M+H]+峰均響應(yīng)較強，確定為母離子；在選擇離子掃描模式（SIM）下優(yōu)化碎裂電壓，以期母離子響應(yīng)最佳；用產(chǎn)物離子掃描模式確定2個豐度高、干擾小的子離子作為定性離子，同時優(yōu)化碰撞能，使得2個子離子獲得最佳響應(yīng)。每個化合物的2個定性離子中響應(yīng)較高的作為定量離子，最終確定質(zhì)譜條件。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

2.2.1 色譜柱的選擇

色譜柱的填料和粒徑影響目標(biāo)化合物的色譜分離度和峰形。試驗比較了Agilent ZORBAX XDB-C18（4.6 mm×50 mm，1.8 μm）、proshell 120 EC-C18（2.1 mm×75 mm，2.7 μm）和ZORBAX Eclipse C18（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）3種不同型號色譜柱的分離效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，使用ZORBAX XDB-C18（4.6 mm×50 mm，1.8 μm）色譜柱時4種目標(biāo)物的峰形和分離效果最好，分析時間也最短（見圖1）。

2.2.2 流動相的選擇

鑒于有機磷除草劑在酸性環(huán)境下易結(jié)合H+，因此試驗在水相中加入甲酸。分別比較了乙腈-0.1%甲酸水溶液、甲醇-0.1%甲酸水溶液和甲醇/乙腈（50∶50，V/V）-0.1%甲酸水溶液這3種不同混合體系流動相對4種目標(biāo)物峰形和響應(yīng)值的影響。結(jié)果表明，當(dāng)有機相為乙腈時，4個目標(biāo)峰的分離度較好，但甲基胺草磷響應(yīng)值較低；當(dāng)有機相為甲醇時，整體響應(yīng)值均有提高，但目標(biāo)峰的分離度相對較差；當(dāng)有機相為甲醇/乙腈（50∶50，V/V）時，目標(biāo)物的峰形和分離度均較好，響應(yīng)也較好。因此，選擇甲醇/乙腈（50∶50，V/V）-0.1%甲酸水溶液作為試驗的色譜流動相。試驗進(jìn)一步優(yōu)化了兩相比例，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩相比為75∶25（V/V）、流速為0.3 mL/min時，色譜峰形和分離度均較好，采用等度洗脫還節(jié)省了平衡時間，提高了工作效率。

2.3 樣品提取方法的優(yōu)化

2.3.1 提取劑的選擇

為獲得高的提取效率，試驗考察了乙腈、乙酸乙酯、二氯甲烷及乙腈-乙酸乙酯混合液提取體系對4種有機磷類除草劑回收率的影響。表2顯示，采用乙酸乙酯為提取劑時提取效果最好，回收率為78.7%～84.1%。因此，試驗選擇乙酸乙酯為提取劑。

圖1 4種有機磷除草劑混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖（100 ng/mL）

表2 提取劑對4種有機磷類除草劑回收率的影響

2.3.2 凈化方式的選擇

試驗比較了采用分散固相萃取和C18固相萃取柱凈化時4種有機磷除草劑回收率的影響。結(jié)果表明，利用分散固相萃取法凈化的回收率明顯優(yōu)于C18固相萃取柱。試驗繼續(xù)比較了分散固相萃取劑為C18、PSA以及混合使用PSA與C18、PSA與MgSO4對回收率的影響。結(jié)果表明，單獨使用1.0 g PSA時回收率最好，為80.6%～87.8%，具體結(jié)果見圖2。

2.4 基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)（matrix effect，ME）是指除目標(biāo)物以外的其他成分對待測物測定值的影響，在質(zhì)譜使用ESI源檢測時，基質(zhì)主要影響目標(biāo)物的離子化，使其響應(yīng)信號增強的為基質(zhì)增強效應(yīng)，使其響應(yīng)信號減弱的為基質(zhì)抑制效應(yīng)。試驗采用同一質(zhì)量濃度的4種有機磷類除草劑基質(zhì)空白溶液和甲醇/乙腈-水溶液（75∶25，V/V）按照儀器條件進(jìn)行測定，以響應(yīng)峰面積的比值評價基質(zhì)效應(yīng)。ME值在80%～120%之間，表明基質(zhì)效應(yīng)較小；ME值低于80%或高于120%，表明有較強的基質(zhì)抑制或增強作用。由表3可見，哌草磷的ME值為103.3%～108.9%，基質(zhì)效應(yīng)較?。黄渌?種有機磷類除草劑ME值為42.7%～68.3%，存在較強的基質(zhì)抑制效應(yīng)。因此，采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行外標(biāo)法定量以減少基質(zhì)效應(yīng)的影響。

圖2 不同凈化方式及凈化劑用量對4種有機磷除草劑回收率的影響

表3 蜂花粉中4種有機磷類除草劑的基質(zhì)效應(yīng)

2.5 方法學(xué)驗證

2.5.1 線性范圍、檢出限和定量限

用蜂花粉基質(zhì)空白溶液配制4種有機磷類除草劑質(zhì)量濃度分別為1.0，2.0，5.0，10.0，20.0，50.0，100.0和200.0 ng/mL的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。按照儀器條件進(jìn)行測定，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X，ng/mL），對應(yīng)定量離子的峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。在1.0～200.0 ng/mL范圍內(nèi)，4種有機磷類除草劑的線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)（r2）＞0.999。平行測定11個空白蜂花粉樣品，4種有機磷類除草劑檢出限（LOD，S/N=3）為0.02～0.05 μg/kg，定量限（LOQ，S/N=10）為0.07～0.16 μg/kg，結(jié)果見表4。

2.5.2 方法的準(zhǔn)確度與精密度

取蜂花粉空白樣品，加標(biāo)濃度分別為5，20和50 μg/kg，每個加標(biāo)水平平行測定5次，計算平均加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（δRSD）。由表5可知，4種有機磷類除草劑的平均回收率在72.2%～89.1%之間，δRSD在2.0%～8.9%之間。結(jié)果表明，該方法準(zhǔn)確度較高、精密度好，可滿足蜂花粉中4種有機磷類除草劑的檢測要求。

表4 4種有機磷類除草劑的線性關(guān)系、檢出限和定量限

表5 蜂花粉中4種有機磷類除草劑的加標(biāo)回收率與相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=5）

2.6 實際樣品檢測

采用所建立方法對石家莊市售10份蜂花粉樣品進(jìn)行檢測。其中，4份檢出甲基胺草磷，含量在0.79～4.53 μg/kg之間；3份檢出莎稗磷，含量在0.19～1.58 μg/kg之間；4份檢出抑草磷，含量在0.23～0.89 μg/kg之間；4份檢出哌草磷，含量在3.79～33.17 μg/kg之間。結(jié)果表明，蜂花粉中存在除草劑的殘留污染，相關(guān)部門應(yīng)對其污染進(jìn)行風(fēng)險評估，加快制定蜂花粉中除草劑的相關(guān)限量標(biāo)準(zhǔn)。

3 結(jié)論

首次建立了同時檢測蜂花粉中4種有機磷類除草劑（甲基胺草磷、莎稗磷、抑草磷和哌草磷）殘留的HPLC-MS/MS分析方法，4種除草劑在1.0～200.0 ng/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，檢出限在0.02～0.05 μg/kg之間，定量限在0.07～0.16 μg/kg之間。該方法靈敏度高、準(zhǔn)確度和精密度好、操作簡單，可滿足檢測要求。