生信分析腎陰虛型絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥分子機制及熟地黃靶向治療

韓林靜 吳克亮 王宏波 肖慶華 張震 朱建宗 林曉生*

1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東 廣州 510405 2.深圳市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，廣東 深圳 518104

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)是以骨量減少、骨微結(jié)構(gòu)退變、骨密度降低，引起骨脆性增加，易發(fā)骨折為特征的全身性代謝性骨病[1]。其發(fā)病率與年齡呈正相關(guān)關(guān)系[2]，隨著老齡化的加劇，OP在世界范圍內(nèi)已經(jīng)成為繼心血管疾病、糖尿病之后第三大發(fā)病率的慢性疾病。據(jù)相關(guān)研究報道，我國40歲以上人群OP發(fā)病率約為25 %[3]，并預(yù)計到2050年，我國OP患者將達到2.12億[4]。因此，骨質(zhì)疏松癥的有效預(yù)防與治療已成為當(dāng)務(wù)之急。

中醫(yī)認為OP的發(fā)生主要與腎虛、脾虛、血瘀有關(guān)，其發(fā)生的根本病因是腎虛。2019年骨痿指南推薦將絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(postmenopausal osteoporosis，PMOP)分為脾腎陽虛、肝腎陰虛、腎虛血瘀3種證型，并認為肝腎陰虛型最為常見[5]。根據(jù)相關(guān)統(tǒng)計[6]，在治療陰虛型骨質(zhì)疏松癥的組方中，熟地黃的使用頻次位列補腎陰藥物的首位，是治療腎陰虛型骨質(zhì)疏松癥的最基礎(chǔ)藥物。熟地黃性味甘、微溫，歸肝腎經(jīng)，具有補血養(yǎng)陰，填精益髓的功效?！侗窘?jīng)逢源》記載“熟地，藉酒蒸曬，轉(zhuǎn)苦為甘，性涼變溫，為陰中之陽，故能補腎中元氣”。《本草綱目》有云：“填骨髓，長肌肉，生精血，補五臟”，治“男子五勞七傷”。實驗研究也證實，熟地黃能夠調(diào)節(jié)糖尿病大鼠的堿性磷酸酶活性和骨鈣素水平，增加骨礦物質(zhì)密度，改善骨微結(jié)構(gòu)[7]。體外細胞實驗提示，熟地黃提取物梓醇能夠增加成骨細胞MC3T3-E1的增殖及分化能力[8]。但是熟地黃調(diào)節(jié)骨代謝，改善骨密度，治療OP的機制仍然不是十分明確。因此，研究熟地黃抗OP的機制，對其進一步開發(fā)及利用具有重要意義。

計算機虛擬分子對接技術(shù)就是模擬配體(藥物)尋找與受體(蛋白)合適活性位點并結(jié)合的過程。分子對接技術(shù)為新藥的研發(fā)及篩選帶來了極大的便利，可以節(jié)約因合成化合物、進行生物活性測試等過程時間，提高效率。分子對接技術(shù)還可以代替大量的正交試驗，對研究樣本進行初步篩選，進行樣本優(yōu)化，減少人力、物力、時間的投入，且結(jié)果與正交試驗基本一致[9]。對中藥及其處方研究具有重要意義，是闡述中藥作用機制的重要工具。

1 材料和方法

1.1 設(shè)計方案

方案設(shè)計見圖1。

圖1 方案設(shè)計圖Fig.1 Scheme design drawing

1.2 芯片檢索及差異表達分析

通過美國國家生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)的GEO數(shù)據(jù)庫，按照“osteoporosis”、“kidney yin dificiency”進行搜索，篩選物種為人的基因表達芯片，并使用在線分析軟件GEO2R進行在線差異表達分析(選擇系統(tǒng)默認推薦設(shè)置)，將分析結(jié)果保存為文本文件備用，運用Origin2019b 64Bit版繪制差異表達火山圖。

1.3 獲取陰虛型OP靶點

通過GeneCards(https://www.genecards.org)及OMIM在線數(shù)據(jù)庫(https://www.omim.org)，輸入“Osteoporosis”進行檢索與骨質(zhì)疏松癥相關(guān)的基因，設(shè)置關(guān)聯(lián)分數(shù)(relevance score)≥5，結(jié)果與2.1差異基因運用R軟件進行映射匹配，得到腎陰虛型OP的靶點基因。

1.4 蛋白互作(PPI)網(wǎng)絡(luò)建立

將2.2獲得蛋白輸入STRING數(shù)據(jù)庫(http://string-db.org/cgi/input.pl，Version11.0)，設(shè)置物種為人類(Homo spaiens)進行構(gòu)建，設(shè)置可信度為中等可信(medium confidence)，隱藏未連接的節(jié)點，其他參數(shù)保持數(shù)據(jù)庫系統(tǒng)推薦設(shè)置，進行蛋白互作分析，獲取蛋白互作關(guān)系網(wǎng)絡(luò)，按照連接度值(Degree)確定前10位為核心蛋白。

1.5 熟地黃有效成分獲取

中藥藥理學(xué)系統(tǒng)數(shù)據(jù)庫TCMSP(traditional Chinese medicine system pharmacology, http://tcmspw.com/tcmsp.php)搜索熟地黃的化學(xué)成分，按口服利用度(oral bioavailability，OB)≥30及類藥性(drug-likeness，DL)≥0.18進行篩選[10]。

1.6 蛋白及小分子結(jié)構(gòu)文件獲取

通過PDB(protein data bank, http://www.rcsb.org/)數(shù)據(jù)庫獲取核心靶點蛋白3D結(jié)構(gòu)，保存為pdb文件；ZINC(http://zinc.docking.org/)數(shù)據(jù)庫獲取2.4藥物小分子3D結(jié)構(gòu)，保存為mol2文件。

1.7 計算機分子對接

運用AUTODOCK 4.2及其工具MGLTools-1.5.6軟件進行分子對接，對所有對象先進行加氫，計算電荷；在Docking模塊設(shè)置蛋白大分子對接方式為剛性(Rigid)，將獲取3D結(jié)構(gòu)的蛋白逐一與藥物小分子進行計算機分子對接，并且以結(jié)合能(binding energy)≤-5.0 kJ/mol[11]作為對接成功標(biāo)準，分析熟地有效成分發(fā)揮作用的靶點。

1.8 GO生物過程及KEGG通路富集分析

將腎陰虛型絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的靶點基因輸入到數(shù)據(jù)庫DAVID(https://david.ncifcrf.gov/home.jsp，Version6.8)，選擇物種為人類(Homo spaiens)進行GO生物過程和KEGG信號通路富集，分析陰虛型PMOP的生物過程及主要信號通路，探討陰虛型PMOP的病理機制。

2 結(jié)果

2.1 差異表達基因

按照檢索詞在GEO數(shù)據(jù)庫進行檢索，最終得到福建省中醫(yī)藥研究院研究團隊共享的腎陰虛型絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的基因表達芯片(GEO編號：GSE56116)。對其在線分析結(jié)果以log2FC=1(差異2倍以上)，P<0.05為條件，運用Origin2019b 64Bit版對差異表達結(jié)果進行火山圖繪制，結(jié)果顯示與正常對照組相比，腎陰虛型OP患者血液中低表達的基因有725個，高表達的有675個(見圖2)。

2.2 陰虛型OP靶點

運用R軟件中的韋恩圖繪制包(Venn Diagram)對2.1差異表達基因與GeneCards、OMIM數(shù)據(jù)庫獲取的OP相關(guān)基因匹配映射，去除重復(fù)，共得到腎陰虛型PMOP靶點基因45個，見圖3。

圖3 陰虛靶點與OP靶點匹配維恩圖Fig.3 Venn diagram of the targets of yin-deficiency and OP matching

2.3 PPI蛋白互作

將45個陰虛型OP靶點基因?qū)雜tring數(shù)據(jù)庫，在線繪制互作網(wǎng)絡(luò)圖，隱藏未連接的靶點，得到蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，見圖4。通過PBD數(shù)據(jù)庫獲得連接度值前十的基因編碼蛋白結(jié)構(gòu)文件(表1)。

圖4 PPI網(wǎng)絡(luò)Fig.4 Network of PPI

表1 蛋白編碼信息Table 1 Protein coding information

2.4 熟地黃活性成分及結(jié)構(gòu)

按條件篩選獲得熟地黃活性成分2種，分別為谷甾醇(sitosterol)、豆甾醇(stigmasterol)，ZINC數(shù)據(jù)庫獲取兩者的3D結(jié)構(gòu)見圖5。

注：a為sitosterol(ZINC4095717)；b為stigmasterol(ZINC4096712)。圖5 藥物的3D結(jié)構(gòu)Fig.5 3D structure of active ingredients

2.5 對接結(jié)果

將PDB數(shù)據(jù)庫中獲取的10個核心蛋白逐一與兩個小分子進行對接，按照標(biāo)準sitosterol、stigmasterol對接成功的分別有9種、10種，結(jié)果見表2；sitosterol與APOB結(jié)合能最高為-7.53 kJ/mol，并能夠形成氫鍵，見圖5a。stigmasterol與CCND1結(jié)合能最高為-6.44 kJ/mol，形成共價氫鍵，見圖5b。

表2 對接結(jié)果Table 2 Docking results of some proteins vs ingredients

注：a：sitosterol與APOB對接結(jié)果；b：stigmasterol與CCND1對接結(jié)果。圖中綠色表示蛋白結(jié)構(gòu)，藍色表示蛋白氨基酸殘基，紅色表示藥物小分子，黃色表示形成的氫鍵，黑色數(shù)值表示形成氫鍵的氨基酸殘基序號。圖6 結(jié)合能最高的對接結(jié)果Fig.6 Docking results with the highest binding energy of ingredients

表3 KEGG通路富集結(jié)果Table 3 Results of KEGG pathway enrichment

2.6 富集結(jié)果

將腎陰虛型PMOP基因?qū)氲紻AVID數(shù)據(jù)庫進行在線富集分析，GO富集見圖6，結(jié)果顯示GO生物學(xué)過程(biological process，GO-BP)參與骨骼肌系統(tǒng)發(fā)育、雌激素應(yīng)答、細胞凋亡過程調(diào)節(jié)等；細胞組分(cellular component，GO-CC)有細胞外基質(zhì)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、胰島素樣生長因子復(fù)合體等；分子功能(molecular function，GO-MF)配受體活性、配受體結(jié)合、生長因子受體結(jié)合等。KEGG通路富集見表3，富集的通路有卵巢類固醇生成、Wnt信號通路、PI3K-Akt、Jak-STAT等信號通路。

圖7 GO富集結(jié)果Fig.7 Results of GO enrichment

3 討論

基因表達譜芯片(GSE56116)原始資料共含有10個研究對象的血液樣本，其中有4個為陰虛型絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥患者血液樣本，3個為陽虛型(未納入分析)，3個健康研究對象樣本。以健康者基因表達為對照，分析陰虛型絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥患者血液樣本差異表達基因，將過表達或者低表達的基因于骨質(zhì)疏松相關(guān)基因進行映射匹配，結(jié)果可能就是陰虛型PMOP相關(guān)的靶基因，通過對靶基因分析，得出陰虛型PMOP的病理機制。

PPI蛋白互作網(wǎng)絡(luò)顯示，IGF1、VEGFA的連接度值最高，位于網(wǎng)絡(luò)的中心位置，為陰虛型OP發(fā)生機制的關(guān)鍵基因。雌激素應(yīng)答、細胞凋亡過程調(diào)節(jié)等是細胞的主要生物學(xué)過程，該過程主要由PI3K/Akt信號通路、MAPK信號通路、Jak-STAT信號通路等調(diào)節(jié)。IGF1(胰島素樣生長因子1)是PI3K/Akt信號通路的激活劑，IGF1可以激活PI3K[12]。PI3K激活后并促進下游靶蛋白Akt的激活，Akt是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，活化的Akt可以繼續(xù)作用于下游凋亡靶蛋白[13]，影響細胞凋亡相關(guān)蛋白(Bcl2、Bax)活性，調(diào)節(jié)細胞凋亡[14]。雌激素的應(yīng)答過程主要有MAPK、Ras、Rap1等信號通路調(diào)節(jié)。外界因素作用于鳥苷酸交換因子上(SOS、C3G等)，信號則轉(zhuǎn)導(dǎo)至小分子 GTP 結(jié)合蛋白 (Ras，Rap1)[15]，后者再激活級聯(lián)中的核心單位，包括一個 MAPKKK (Raf)、一個 MAPKK (MEK1/2) 和 MAPK (Erk)[16]。激活的 Erk 二聚物可在胞質(zhì)中調(diào)控靶蛋白，也可轉(zhuǎn)運入胞核，在核內(nèi)磷酸化多種調(diào)控基因表達的轉(zhuǎn)錄因子[17]。而且不同生物過程中的調(diào)控通路是相互影響的[18](見圖8)。因此，腎陰虛型骨質(zhì)疏松癥的病理機制可能是上述通路調(diào)節(jié)的細胞凋亡、雌激素應(yīng)答等過程。

本研究共獲得兩種熟地黃的有效成分，sitosterol(谷甾醇)、stigmasterol(豆甾醇)。10個分子對接成功結(jié)果中，谷甾醇與APOB(載脂蛋白B)形成氫鍵緊密結(jié)合。腫瘤骨轉(zhuǎn)移患者血清APOB升高，APOA1降低，APOA1/APOB比值降低，糖脂代謝紊亂[19]。APOB是低密度脂蛋白(LDL)及極低密度脂蛋白的轉(zhuǎn)運載體，能夠促進細胞對膽固醇及LDL的吸收[20]，成骨細胞中脂質(zhì)的積累會抑制其骨形成的活性，骨髓干細胞脂肪形成的增加，還可誘導(dǎo)破骨細胞分化，造成骨量流失[21]。另外，谷甾醇在腸道中的吸收與APOB水平相關(guān)，這種關(guān)系是正向的[22]。谷甾醇可以調(diào)節(jié)IGF1的表達，動物實驗[23]中，植物雌激素環(huán)境中(sitosterol)，虹鱒肝臟內(nèi)IGF1的mRNA的表達明顯下調(diào)。豆甾醇與CCND1(細胞周期蛋白D1)編碼的蛋白結(jié)合最為緊密，且蛋白A鏈的238號氨基酸殘基上與藥物形成一個氫鍵。CCND1是細胞周期的正調(diào)節(jié)蛋白，參與了細胞增殖、分化和細胞凋亡等過程。阿吉木[24]報道Wnt/β-catenin信號通路能夠靶向CCND1，促進MG63骨肉瘤細胞的增殖及分化，此研究也應(yīng)證了通路富集結(jié)果。豆甾醇可以調(diào)控大鼠VEGFA蛋白表達，(4.34±1.64)μg/mL牛蒡子[25]的乙醇提取物(主要成分為谷甾醇及豆甾醇)可以降低大鼠VEGFA(血管內(nèi)皮生長因子A)的表達，抗血管生成。普遍認為VEGFA能夠促進新生血管形成，促進骨修復(fù)[26]。但近來也有研究表明，過表達VEGFA對促進骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化并無益處[27]。因此，有待進一步研究證實。

圖8 預(yù)測機制圖Fig.8 Potential mechanism diagram

綜上所述，腎陰虛型絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生機制可能與PI3K/Akt信號通路、MAPK信號通路、Ras信號通路、Rap1信號通路調(diào)節(jié)的細胞凋亡及雌激素應(yīng)答有關(guān)。熟地黃治療腎陰虛型絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的機制可能是其有效成分作用于IGF1、VEGFA、APOB等靶蛋白，而發(fā)揮藥效作用。本研究不足之處在于，通過分子對接預(yù)測藥物有效成分作用靶蛋白，尚缺乏在骨質(zhì)疏松領(lǐng)域的直接證據(jù)，有待進一步驗證。