通過Micro-CT評價瘦素受體缺乏的2型糖尿病小鼠四肢骨的骨代謝變化

何琪 楊均政 張罡瑜 潘兆豐 蘇麗君 王海彬 陳鵬*

1.廣州中醫(yī)藥大學，廣東 廣州 510405 2.廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，廣東 廣州 510405

隨著我國人口老齡化問題的日益嚴峻及生活方式的改變，2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)和骨質疏松(osteoporosis，OP) 已成為常見的危害人類健康的兩大慢性代謝性增齡性疾病[1]。目前，大量基礎和臨床研究均表明T2DM和OP的發(fā)生發(fā)展具有密切聯系，長期處于高血糖狀態(tài)會引起骨代謝紊亂，最終導致糖尿病性骨質疏松(diabetic osteoporosis，DOP)[2]。DOP主要表現為骨量低、骨脆性增加、骨質量下降和骨折風險增加，嚴重降低了患者的生存質量，給社會、醫(yī)療衛(wèi)生機構、家庭造成沉重負擔[3]。

瘦素(leptin)是一個主要由白色脂肪組織分泌的具有146個氨基酸的蛋白質[4]，其功能主要是抑制食欲和調節(jié)機體能量代謝[5]。最開始，瘦素僅僅被認為在下丘腦中樞水平作為一個飽感因子介導食物攝入量減少，并增加能量的消耗[6-7]。但當前許多研究發(fā)現，瘦素涉及生殖功能、血管生成或骨生長等多種生理進程的控制[6,8-9]?，F有研究證實瘦素受體的分布除下丘腦外，還廣泛存在于許多組織，骨骼系統(tǒng)就是其重要的作用部位。且隨著研究的深入，瘦素受體的信號傳導形式已經在多種骨骼細胞類型中發(fā)現，包括骨髓間充質細胞[10]、成骨細胞[11]、造血干細胞[12]等。而db/db小鼠是Leptin受體基因缺陷導致的先天性2型糖尿病小鼠，是由美國Jackson實驗室于1966年在C57BL/Ks小鼠上發(fā)現的帶有糖尿病突變基因(db)的動物[13]，db/db小鼠的2型糖尿病綜合征與2型糖尿病患者相似，表現為肥胖、胰島素抵抗、高胰島素血癥和進行性高血糖。由于T2DM引起的骨質疏松癥的潛在機制尚不清楚，我們擬通過Micro-CT檢測db/db小鼠和正常野生型小鼠的脛骨近端，以期了解瘦素受體缺乏的2型糖尿病小鼠骨代謝的表型變化，從而加深對糖尿病性骨質疏松發(fā)病機制的研究，明確糖尿病與骨質疏松的認識，對預防和治療糖尿病性骨質疏松有重要意義。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及標本準備

選擇6周齡雄性野生型C57BL/6 J小鼠及db/db小鼠(瘦素受體缺乏小鼠)各10只，購置南京大學模式動物所。所有實驗動物均飼養(yǎng)于廣州中醫(yī)藥大學實驗動物中心SPF級動物設施，飼養(yǎng)環(huán)境維持恒溫(22～25 ℃)，濕度55 %～60 %，自由攝食、飲水。實驗和操作程序經所在單位的動物實驗倫理委員會審核通過。(實驗動物合格證號：SCXK(蘇)2018-0008)動物喂養(yǎng)8周，在14周齡時過量麻醉處死，分離左腿脛骨，盡量清除干凈周圍軟組織，然后置于4 %多聚甲醛溶液中固定24 h。

1.2 Micro-CT原理掃描方法

所有標本采用Skyscan1172 micro-CT設備進行掃描(Skyscan，Bruker，Belgium)。掃描前，將樣品從4 %多聚甲醛溶液中取出并用磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline，pbs)沖洗后，將骨標本置于垂直于掃描軸的直徑為10 mm的標本管中，周圍填塞少許醫(yī)用紗條，加入70 %乙醇作為掃描介質。掃描儀的基本參數為：電壓50 kV，電流200 μA，總旋轉角360 °，旋轉角增量0.4 °，厚度9 μm。掃描后，使用Skyscan NRecon軟件并利用Feldkamp圓錐束算法，將二維圖像序列自動重建為15.9 μm各向同性體素大小的三維體。脛骨骨小梁微結構分析，選用高度為1.0 mm的VOI(the volume of interest)，分析從脛骨近端生長板下方0.45 mm處開始延伸至近端1.0 mm處。另取同樣高度的VOI，分析脛骨中骨干的皮質骨結構。骨小梁參數分析，包括骨小梁相對體積(BV/TV，%)、骨表面積組織體積比值(BS/TV，1/mm)、骨小梁厚度(Tb.Th，mm)、骨小梁數量(Tb.N，1/mm)、骨小梁分離度(Tb.Sp，mm)、骨結構模型指數(structure model index，SMI)。通過分析骨皮質厚度(Ct.Th，μm)、骨皮質面積(Ct.Ar，mm2)，評估皮質骨結構。以上數據的操作和分析都使用Custom Analysis程序 (CTAn,Skyscan)進行。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結果

據圖1、圖2示，與正常野生型小鼠(WT)相比，db/db小鼠的脛骨近端三維成像顯示，骨皮質變薄、骨量相對減少、骨小梁松散且結構呈“桿狀”變化；據圖3、圖4示，比較WT組，db/db小鼠的骨小梁、皮質骨參數發(fā)生了顯著變化，骨小梁相對體積(BV/TV)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁數量(Tb.N)明顯增大，小梁骨質量和小梁骨連接性明顯降低，并且小梁骨微結構惡化，小梁骨間距(Tb.Sp)相應增加，皮質骨厚度(Ct.Th)、橫截面積(Ct.Ar)減小，兩者比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。db/db小鼠的脛骨近端骨小梁結構模式指數(structure model index, SMI)較野生型明顯增大，意味著小梁結構組成中板層結構和桿狀結構的比例發(fā)生了改變。如果結構中骨小梁主要為板層結構，那么SMI接近于0；反之，如果主要是桿狀骨小梁，SMI則接近3[14]。當發(fā)生骨質疏松時，骨小梁結構從板狀向桿狀轉變，該值增大。這一參數與圖1、圖2三維成像相符合，表明db/db小鼠中骨小梁相比野生型已轉為更多的“桿狀”結構，發(fā)生了骨質疏松。

圖1 野生型(WT)和db/db小鼠脛骨近端冠狀切面三維模型Fig.1 Wild-type (WT) and db/db mice coronal section 3 d models of proximal tibia

注：*P<0.05，****P<0.0001。圖2 a 野生型(WT)小鼠脛骨近端骨小梁；b db/db小鼠脛骨近端骨小梁；c 野生型(WT)小鼠脛骨近端皮質骨；d db/db小鼠脛骨近端皮質骨Fig.2 a. Proximal tibial trabecula in wild-type (WT) mice；b. db/db mouse proximal tibial trabecular bone; c. Cortical bone of proximal tibia in wild-type (WT) mice; d. Proximal tibial cortical bone in db/db mice

3 討論

瘦素是脂肪細胞的主要激素產物，參與調節(jié)食欲和能量代謝，從而影響脂肪沉積和體重[15]。越來越多的證據報道了瘦素參與了體外和體內對骨骼和骨細胞的合成代謝，最近已有研究證實成骨和軟骨細胞也能夠合成和分泌瘦素[16-17]，瘦素能夠在中央和外周調節(jié)骨生成[18-20]。Holloway等[21]的研究證明瘦素通過RANKL/RANK/OPG系統(tǒng)抑制破骨細胞的形成及功能。此外，Thomas等[22]研究發(fā)現，瘦素可作用于人骨髓間充質干細胞, 促進其向成骨細胞分化, 同時抑制該細胞向脂肪細胞分化。這些結果提示瘦素可能在骨科疾病的發(fā)生發(fā)展中起關鍵作用。然而瘦素受體缺乏所致的骨表型仍然存在爭議，如Ducy等[23]研究發(fā)現，在瘦素受體缺陷(db/db) 的小鼠中表現為骨形成增加及骨礦質沉積速率增加，且骨密度比野生型高2～3倍，他們認為瘦素可能通過中樞性作用方式有效抑制骨形成作用。但許多隨后的研究報道了與該假說相矛盾的發(fā)現，Ealey等[24]、He等[25]發(fā)現db/db小鼠表現出肢體骨量、機械強度和骨形成的顯著降低，隨后Williams等[26]通過Micro-CT進一步證明了db/db小鼠脛骨的松質骨和皮質骨微結構受損，椎骨的松質和皮質骨厚度降低，且與野生型(WT)小鼠相比，db/db小鼠的骨形成率也顯著下降。由于db/db小鼠骨表型矛盾的結果我們決定使用微型計算機斷層掃描(μCT)檢查小鼠的骨骼。高分辨率Micro-CT優(yōu)于傳統(tǒng)的雙能X線骨密度儀和組織形態(tài)學檢測方法，因為它能夠以微米分辨率確定骨骼的3D微觀結構，是一種更快速、更準確、又不損傷樣本內部結構的有效的檢查方法[27]，尤其是在小動物標本和大型動物離體標本的研究領域，Micro-CT已經成為評價骨形態(tài)和骨微結構的“金標準”[28]。

圖3 野生型(WT)和db/db小鼠脛骨近端骨小梁參數Fig.3 Parameters of proximal tibial trabecular bone in WT and db/db mice: BV/TV, Tb.Th, Tb.N, Tb.Sp, BS/TV and SMI

注：*P<0.05，****P<0.0001。圖4 野生型(WT)和db/db小鼠脛骨近端皮質骨參數Fig.4 Parameters of proximal tibial cortical bone in wild-type (WT) and db/db mice

在本研究中，我們通過高分辨率的Micro-CT對14周齡的db/db小鼠和正常野生型小鼠的脛骨進行檢測，發(fā)現與野生型小鼠相比，db/db小鼠的脛骨表現為骨體積分數、骨小梁厚度及皮質骨厚度的明顯減小，脛骨骨量減少、骨微結構遭到破壞，這與Jing等[29]的發(fā)現相一致。另外，我們還以三角形骨表面辨別分析為基礎通過三維分析方法計算獲得結構模型指數(SMI)[30]，發(fā)現其與野生型小鼠相比增大，表示骨小梁從板狀向桿狀轉變，說明了db/db小鼠脛骨已發(fā)生骨質疏松。因此，我們的結果進一步證實，在2型糖尿病小鼠的四肢中可觀察到骨微結構的顯著惡化和骨強度的降低。

2型糖尿病所引起的骨質疏松是糖尿病在骨骼系統(tǒng)的重要并發(fā)癥，也是成為糖尿病患者軀體骨骼長期疼痛和功能障礙的主要原因[31]。DOP發(fā)病機制復雜、影響因素較多，涉及到多個通路的互相作用，且針對其的治療手段又十分有限，因此探討2型糖尿病與骨質疏松癥間的關系以及影響因素已成為目前學界研究的熱點問題之一。目前認為其發(fā)病機制主要包括高血糖、胰島素相對或絕對缺乏、糖尿病微血管病變、激素水平異常等[32]。其中激素水平異常可能是由于瘦素的影響，有臨床觀察[33]顯示，2型糖尿病患者早期血清瘦素水平較高，表現為瘦素抵抗，因此2型糖尿病造成的骨質疏松可能與瘦素抵抗有一定的相關性，這與我們觀察到的db/db小鼠的骨表型相吻合。

一般骨質疏松以骨強度下降為特點，其診斷主要依靠雙能X線吸收法測定骨密度。然而，由于DOP患者早期癥狀不明顯[34]，且通常以低骨轉換性骨質疏松為特點，成骨細胞活性下降，骨修復能力受損，有些與骨強度相關的因素如骨微結構在骨密度檢測中測不出，骨密度對于預測糖尿病患者的骨折風險具有局限性，因此，對DOP的早期診斷方法還有待進一步研究。Samelson等[35]通過高分辨率外周定量 CT掃描(high resolution peripheral quantitative CT，HR-pQCT)對1 069例社區(qū)人群進行研究，結果顯示與非糖尿病患者相比，2型糖尿病患者脛骨骨微結構損傷，皮質骨骨厚度下降，橫截面積更小，這與本研究中我們觀察到的2型糖尿病小鼠中皮質骨厚度(Ct.Th)、橫截面積(Ct.Ar)減小，SMI指數升高，骨微結構受損相符，表明高分辨率外周定量CT掃描可能成為早期診斷DOP的金標準，且db/db小鼠在骨微結構水平上，可能成為與2型糖尿病(T2DM)相關的繼發(fā)性骨質疏松癥的潛在動物模型。

但我們目前的研究也有一些局限性。首先，由于小鼠股骨頸測量困難，我們改用脛骨近端進行μCT掃描，我們的結果可能不適用于骨折部位在股骨的2型糖尿病患者[36]。其次，我們沒有通過血液樣本或骨組織形態(tài)計量學對骨轉換標志進行評估，無法觀察到動物模型骨代謝平衡的根本變化。最后，由于目前研究使用的評估技術的局限性，骨微結構的一些特征如皮質孔隙率，一個基質的微裂紋或骨的非礦物質相關特性不能被檢測。

總之，本研究顯示了2型糖尿病小鼠的四肢骨小梁和皮質骨微結構顯著惡化，全骨結構特性下降。我們的研究證明了，在缺乏瘦素信號傳導的情況下，骨質量和強度會降低，驗證了瘦素在體內起著合成代謝骨因子的作用。這也與體外研究和體內給藥的結果相吻合，也表明瘦素對骨細胞的直接促進作用可能會抵消其通過中樞神經系統(tǒng)的抑制作用。由于瘦素不僅在骨骼代謝中起著重要的作用，而且還影響著2型糖尿病的發(fā)生發(fā)展，因此我們通過上述實驗，認識到db/db小鼠骨代謝的變化，明確了2型糖尿病與骨質疏松之間的關系，而且認為2型糖尿病所引起的骨代謝變化可能與瘦素受體參與的信號通路相關，為DOP的研究方向提供了更具體的分子基礎，打開了新的思路和視角，也為以后雙聯給藥和精準醫(yī)療埋下了“伏筆”。但目前國內外關于該方面的研究相對局限，如瘦素是否參與Wnt/β-catenin和OPG/RANKL/RANK系統(tǒng)等經典信號通路對成骨、破骨細胞的調節(jié)，具體是如何對下游基因表達和信號轉導起調控作用仍不完全清楚。相信隨著研究的深入，瘦素在2型糖尿病、骨代謝中的作用以及骨細胞上的瘦素受體在其分化轉歸中的調控將進一步揭示骨-脂代謝偶聯在骨發(fā)育及干細胞調控中的作用，并作為潛在靶點為臨床治療糖尿病與骨代謝疾病提供新思路。