環(huán)狀RNA 在肺癌中的診斷價值分析

支余樂，朱林文，李旎，徐國棟，邵國豐

作者單位： 315211 寧波，寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院（支余樂）；寧波市醫(yī)療中心李惠利醫(yī)院（朱林文、李妮、徐國棟、邵國豐）

肺癌是全球最常見的癌癥之一，也是因癌癥導(dǎo)致患者死亡的第一病因[1]。近年來雖然肺癌的靶向治療和免疫治療取得了明顯的進(jìn)展，但提高肺癌的早期診斷水平仍是提高其遠(yuǎn)期療效的最有效方式。環(huán)狀RNA（circRNA）作為非編碼RNA（ncRNA）的家族成員之一，具有高度的特異性、保守性和穩(wěn)定性，通過調(diào)控細(xì)胞信號通路發(fā)揮其在肺癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用，并具有潛在的臨床價值。circRNA的主要生物學(xué)功能包括作為微小RNA（miRNA）海綿，調(diào)節(jié)親本基因的轉(zhuǎn)錄，調(diào)節(jié)蛋白與編碼蛋白之間的相互作用。絕大多數(shù)circRNA 充當(dāng)miRNA的海綿體作用。與正常組織相比，肺癌組織中存在差異表達(dá)的circRNA，其表達(dá)水平與肺癌的臨床病理因素相關(guān)。本文通過綜述多個circRNA在各種肺癌調(diào)節(jié)中的作用，進(jìn)一步闡述它們在肺癌中的診斷和預(yù)后價值。

1 circRNA 的來源與特征

circRNA 是一類單鏈閉合環(huán)形RNA，是缺少 5’-3’末端的 RNA 分子[1]。circRNA 是一類特殊的內(nèi)源性 RNA 分子，廣泛存在于哺乳動物轉(zhuǎn)錄組中，參與調(diào)控基因表達(dá)。circRNA 參與調(diào)控多種生物活性，具有癌癥分子診斷價值,例如胃癌[2-5]、肝細(xì)胞癌[6-9]、結(jié)腸直腸癌[10-11]、肺癌[12-14]、乳腺癌[15-17]、膀胱癌[18-19]及食管鱗癌[20-21]，研究表明，circRNA 可能在人體體液中穩(wěn)定表達(dá)，且在唾液、血漿、血清和外泌體等體液中含量相對較高，這也使得circRNA可以成為癌癥無創(chuàng)液體活檢的理想生物標(biāo)志物[22]。

2 circRNA 的分類

circRNA 有四種類型，分別是外顯子 circRNA（ecircRNA）、內(nèi)含子 circRNA、外 顯 子- 內(nèi) 含 子 circRNA（EIciRNA）和基因間circRNA[23]。超過80%的circRNA是ecircRNAs，它們是由前體mRNA 的3’剪接供體和5’剪接受體的反向共價附著形成的。EIciRNA 是一種外顯子和內(nèi)含子同時循環(huán)的 circRNA，可能與ecircRNA 相似。內(nèi)含子circRNA 是一類circRNA 的總稱，包括環(huán)狀內(nèi)含子RNA、被切除的I組內(nèi)含子、被切除的II 組內(nèi)含子、被切除的tRNA內(nèi)含子和內(nèi)含子lariat?；蜷gcircRNA是通過circRNA標(biāo)識符（CIRI）發(fā)現(xiàn)的另一種非外顯子circRNA，由兩個內(nèi)含子circRNA 片段（ICFs）組成，它的兩側(cè)是GT-AG 剪接信號，可以作為環(huán)狀結(jié)的剪接供體（SD）和剪接受體（SA）[24]。

circRNA通常起源于編碼蛋白外顯子基因的5’端，可能由一個或多個外顯子組成。單個基因的選擇性循環(huán)和選擇性剪接事件（選擇性5’和3’剪接位點(diǎn)、外顯子跳躍和內(nèi)含子保留）可以產(chǎn)生多種circRNA。雖然大部分circRNA 是由蛋白質(zhì)編碼基因的外顯子組成，但circRNA 也可能來自內(nèi)含子、基因間區(qū)域、UTRs、ncRNA 位點(diǎn)以及已知轉(zhuǎn)錄體的反義位點(diǎn)。一旦產(chǎn)生，circRNA 可以駐留在細(xì)胞核中（如保留內(nèi)含子的多外顯子環(huán)），也可以像大多數(shù)circRNA一樣輸出到細(xì)胞質(zhì)中[25]。

3 circRNA 的功能

3.1 作為 miRNA 海綿的功能 許多circRNAs 都含有miRNA 反應(yīng)元件和結(jié)合位點(diǎn)，因此作為“miRNA海綿”是調(diào)控人類癌癥生長進(jìn)展最重要的功能和機(jī)制。越來越多的證據(jù)表明，許多circRNA通過發(fā)揮miRNA 海綿分子的作用來調(diào)節(jié)基因表達(dá)或蛋白質(zhì)支架參與癌癥進(jìn)展。相比其他競爭性內(nèi)源性RNA（ceRNAs），像長鏈非編碼 RNA（lncRNA）或偽基因，circRNA更傾向于與miRNA 結(jié)合，被稱為“超級海綿”[26]。

3.2 調(diào)控基因剪接、轉(zhuǎn)錄和翻譯的功能雖然大部分circRNA 位于細(xì)胞質(zhì)中，但也有一部分存在于細(xì)胞核中。而在細(xì)胞核中的circRNA部分作為轉(zhuǎn)錄或剪接調(diào)節(jié)因子干擾基因表達(dá)，參與選擇性剪接和轉(zhuǎn)錄過程。基因選擇性剪接、轉(zhuǎn)錄和翻譯是在癌癥中發(fā)揮生物學(xué)功能的重要過程，而circRNA 在這些過程中起著至關(guān)重要的作用[27]。

3.3 與RNA結(jié)合蛋白（RBPs）相互作用并充當(dāng)?shù)鞍字Ъ?RBPs 是一類廣泛參與基因轉(zhuǎn)錄翻譯的蛋白。CircRNA 還可以隔離、存儲和分類RBPs，從而控制細(xì)胞內(nèi)定位。相反，RBPs 也可以調(diào)節(jié)circRNA 的功能和表達(dá)水平[27]。因此circRNA 具有豐富的生物學(xué)功能，參與腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲和遷移等多種生理病理過程。

4 肺癌與circRNA

盡管通過二代測序技術(shù)在肺癌組織和細(xì)胞系中發(fā)現(xiàn)了數(shù)千種circRNA，許多circRNA 在肺癌中被發(fā)現(xiàn)異常表達(dá)，但其在肺癌發(fā)生發(fā)展中的具體功能機(jī)制研究才剛剛開始[28]。與正常肺組織相比，肺癌中有許多上調(diào)或下調(diào)的 circRNA，例如 hsa_circ_0033155 在 NSCLC 組織和細(xì)胞系中表達(dá)下調(diào)[29]。而其中一些已被提出作為潛在的診斷和/或預(yù)后生物標(biāo)志物，見表1。

表1 各類肺癌與環(huán)狀RNA

4.1 非小細(xì)胞肺癌與circRNA Chang等研究提示circ_0026134 在NSCLC 組織中高表達(dá)，表明其在NSCLC細(xì)胞中的致瘤作用。與正常對照相比，circ_0026134 在 NSCLC 樣本中有明顯擴(kuò)增和過表達(dá)[30]，因此，circ_0026134 可以作為生物診斷。circ_0014130 在NSCLC 組織和細(xì)胞中異常過表達(dá)。進(jìn)一步的研究表明，沉默circ_0014130 可以通過上調(diào) miR-142-5p 的表達(dá)來抑制IGF-1 的表達(dá)，從而抑制NSCLC細(xì)胞的增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[31]，因此circ_0014130 可以作為潛在生物診斷及治療依據(jù)。circ_0016760 通過作為miR-1287 的 ceRNA 促進(jìn) GAGE1 的表達(dá)。circ_0016760 在 NSCLC 組織和細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，提示預(yù)后不良[32]。生物信息學(xué)分析和雙熒光素酶報告基金實(shí)驗(yàn)表明 circABCB10、miR-1252 和 FOXR2之間存在相互作用。circABCB10 通過調(diào)節(jié)miR-1252/FOXR2 軸促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖和遷移，從而促進(jìn)了NSCLC 的進(jìn)展，提示 circABCB10 可能是NSCLC治療的潛在靶點(diǎn)，因此可以作為肺癌診斷標(biāo)志物[44]。研究發(fā)現(xiàn)，circRNA_100876 在NSCLC組織中的表達(dá)水平明顯高于鄰近非腫瘤組織。circRNA_100876 表達(dá)上調(diào)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腫瘤分期密切相關(guān)。circRNA_100876可能成為NSCLC 新的預(yù)后生物標(biāo)志物和診斷治療靶點(diǎn)[45]。在進(jìn)一步的研究中，hsa_circ_0007385 在 NSCLC 組織和細(xì)胞中被顯著上調(diào)，并且體外 hsa_circ_0007385 基因敲除實(shí)驗(yàn)明顯抑制了NSCLC 細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。生物信息學(xué)分析和雙熒光素酶報告基因分析證實(shí)了潛在的miR-181 靶點(diǎn)，提示hsa_circ_0007385 可能存在調(diào)控通路，可以作為潛在診斷診斷標(biāo)志物[33]。hsa_circ_0000064 影響肺癌細(xì)胞的增殖、凋亡和轉(zhuǎn)移，hsa_circ_0000064 可能成為一種潛在的新型肺癌生物標(biāo)志物[46]。hsa_ circ_0013958 被鑒定為具有miR-134 海綿作用，能上調(diào)致癌細(xì)胞CCND1，而 CCND1 在 NSCLC 的發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵作用[47]。因此 hsa_circ_0013958 可作為肺腺癌早期檢測和篩選的非侵入性生物標(biāo)志物或診斷標(biāo)志[35]。ROC 曲線分析表明，hsa_circ_0077837和 hsa_circ_0001821 這兩種 circRNA 在NSCLC患者中具有很高的診斷潛力，但這兩個 circRNA 無法區(qū)分 LUAD 和LUSC 亞型[36]。hsa_circ_0102533 在NSCLC患者腫瘤組織和全血中表達(dá)明顯增加,并且Hsa_circ_0102533 在NSCLC的癌變過程中具有致癌特性，可能是NSCLC檢測的早期診斷性生物標(biāo)志物[37]。

4.2 肺 腺 癌 與 circRNA hsa_circ_0013958 被鑒定為具有miR-134 海綿作用，能上調(diào)致癌細(xì)胞 CCND1，而CCND1 在肺癌的發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵作用[47]。因此hsa_circ_0013958 可作為肺腺癌早期檢測和篩選的非侵入性生物標(biāo)志物或診斷標(biāo)志[35]。ROC 曲線分析表明，在LUAD 組織中hsa_circ_0001073的AUC 為0.919，在NSCLC 亞型特異性模式中異常表達(dá)，可作為診斷性的生物標(biāo)志物，預(yù)測 LUAD[36]。hsa_ circ_RNA-002178 可以通過海綿化 miR-34來增強(qiáng)癌細(xì)胞中PDL1 的表達(dá)，從而誘導(dǎo)T 細(xì)胞衰竭。并且可以在LUAD 患者的血漿外泌體中檢測到，因此可以作為 LUAD 早期診斷的生物標(biāo)志物[38]。hsa_circ_0000792 可以為潛在的LUAD生物標(biāo)志物，通過RT-qPCR 實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0000792 確實(shí)在 LUAD 組織中顯著上調(diào)。并且研究表明 hsa_circ_0000792 可能與miR-375 競爭性結(jié)合，從而消除其對相關(guān)靶基因的抑制作用。因此 mRNA-microRNA-circRNA 軸可能是LUAD 潛在的分子調(diào)控機(jī)制[39]。hsa_circ_0005962 在 LUAD 血漿和細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)。可以作為一個潛在的無創(chuàng)LUAD 診斷的生物標(biāo)志物[40]。circ-CAMK2A 的過表達(dá)可以顯著增加纖連蛋白 1、MMP2 和MMP9 的表達(dá)，從而增強(qiáng)LUAD 細(xì)胞的遷移/侵襲能力。重要的是，上述促轉(zhuǎn)移作用被miR-615-5p 過表達(dá)明顯抵消，反之亦然，這說明circCAMK2A/miR-615-5p/纖連蛋白 1 的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)確實(shí)存在，并在LUAD 轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。并且研究發(fā)現(xiàn) circ-CAMK2A 高表達(dá)的LUAD 患者生存時間明顯縮短，提示circ-CAMK2A可能是LUAD 患者潛在的預(yù)后生物標(biāo)志物[41]。研究顯示circ-SOX4 通過靶向miR-1270/PLAGL2 軸和激活 Wnt 通路來促進(jìn)LUAD 的進(jìn)展。為探索LUAD 潛在的治療靶點(diǎn)提供了有價值的理論依據(jù)[42]。

4.3 肺鱗癌與 circRNA ROC 曲線分析表明，在 LUSC 組織中 hsa_ci rc_0001495 的 AUC 為 0.965, 在 NSCLC亞型特異性模式中異常表達(dá)，可作為診斷性的生物標(biāo)志物，預(yù)測LUSC[36]。研究顯示，circTP63 競爭性地結(jié)合miR-873-3p，消除了miR-873-3p對FOXM1 的抑制作用，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞增殖。這個研究可以深入了解LUSC 的發(fā)展和進(jìn)展，并且成為LUSC 的一個潛在治療方法[43]。

5 結(jié)論與展望

circRNA 的高穩(wěn)定性、高保守性和組織特異性等特性使其可以肺癌的發(fā)生、發(fā)展以及預(yù)后存在密切的關(guān)系，有望成為肺癌的診斷、治療及預(yù)后的生物標(biāo)志物。但circRNA 在肺癌中的診斷價值還需要更深入的研究，不同circRNA 在更容易獲取、侵襲性更小的樣本（如血液、尿液和唾液）或與疾病密切相關(guān)的樣本（如胃液、滑膜積液和腦脊液）中的檢測與傳統(tǒng)標(biāo)記物的聯(lián)合檢測可能具有更高的診斷效率。