加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)識(shí)別子宮內(nèi)膜癌中與腫瘤干細(xì)胞干性相關(guān)的基因

黃小燕，蘇琪盛，丘程程，朱尚勇

（廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院超聲科，廣西 南寧 530021）

0 引言

子宮內(nèi)膜癌(UCEC)是女性三大婦科惡性腫瘤之一。近10年，UCEC的死亡率年增長(zhǎng)率約1.4%，其發(fā)病率逐漸上升[1]。子宮及雙側(cè)附件切除是UCEC的標(biāo)準(zhǔn)治療手段，對(duì)于遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者，輔以放、化療及激素治療，這些治療手段給患者創(chuàng)傷性大。分子靶向治療因其創(chuàng)傷小、療效優(yōu)的特點(diǎn)，成為有效的UCEC治療策略。因此，鑒別UCEC特異的分子標(biāo)志物實(shí)現(xiàn)分子靶向治療尤顯重要[2]。然而，由于對(duì)UCEC的組織病理學(xué)分類和異質(zhì)性認(rèn)識(shí)不足，識(shí)別其分子生物標(biāo)記物仍具挑戰(zhàn)。

腫瘤干細(xì)胞(CSCs)是腫瘤中具有自我更新、高增殖和多向分化潛能的一類細(xì)胞，具有促腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移和耐藥的作用[3]。CSCs的干性與多數(shù)癌癥的腫瘤內(nèi)異質(zhì)性相關(guān)。腫瘤內(nèi)異質(zhì)性包含細(xì)胞表面標(biāo)記物及表型異常，而細(xì)胞表面標(biāo)記物以及基因突變類型常被認(rèn)為是腫瘤病理分類和治療的依據(jù)[4]。有研究表明UCEC的發(fā)生與CSCs的干性有關(guān)[5]。本研究著重于從CSCs干性特征的角度識(shí)別與UCEC的組織病理學(xué)分類和異質(zhì)性相關(guān)的特征基因。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)收集及處理

UCEC患者的納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）組織病理學(xué)證實(shí)為原發(fā)性UCEC患者;（2）完整RNA-Seq數(shù)據(jù)及臨床數(shù)據(jù)的患者（如年齡，病理分級(jí)、生存時(shí)間）。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）非原發(fā)性UCEC患者;（2）臨床資料不完整。本研究納入23個(gè)正常子宮內(nèi)膜組樣本及552個(gè)UCEC樣本。

1.2 mRNAsi與UCEC的臨床病理的相關(guān)性

mRNAsi用于評(píng)估腫瘤細(xì)胞的去分化程度，mRNAsi值經(jīng)過(guò)1類邏輯回歸機(jī)器學(xué)算法得到[3]，其值的區(qū)間為[0，1]，值越趨近于1，則表示腫瘤細(xì)胞與干細(xì)胞的相似程度越大。根據(jù)腫瘤樣本的mRNAsi的中位數(shù)將患者分為高mRNAsi組與低mRNAsi組，并通過(guò)R語(yǔ)言中的“survival”包進(jìn)行生存分析。Wilcoxon秩和檢驗(yàn)分析UCEC病理分級(jí)與不同年齡間mRNAsi值的差異。最后采用R語(yǔ)言中的“beeswarm”包進(jìn)行結(jié)果可視化處理。

1.3 UCEC中的差異表達(dá)基因分析

通過(guò)Wilcoxon秩和檢驗(yàn)篩選樣本的差異基因，篩選標(biāo)準(zhǔn)：假陽(yáng)性率(FDR)＜0.05及|log2(FC)|≥1。FC為樣本表達(dá)量的差異倍數(shù)。

1.4 WGCNA模型構(gòu)建與模塊篩選

運(yùn)用R語(yǔ)言中的“WGCNA”包構(gòu)建具有近似無(wú)尺度特性的加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)（WGCNA），篩選與腫瘤干細(xì)胞高度相關(guān)的模塊[6]。通過(guò)hclust函數(shù)對(duì)樣本進(jìn)行聚類分析，使用pickSoftThreshold函數(shù)確定軟閾值，設(shè)定模塊中最小基因數(shù)為30，切割高度的閾值為0.25，采用拓?fù)渲丿B（TOM）計(jì)算，并運(yùn)用動(dòng)態(tài)切割法識(shí)別共表達(dá)基因模塊[7]，構(gòu)建模塊樹狀圖。

1.5 樞紐基因的篩選

選擇與臨床性狀相關(guān)性最高的模塊，計(jì)算模塊內(nèi)每個(gè)基因的基因顯著性（GS）與模塊隸屬度（MM）的相關(guān)性，設(shè)定篩選模塊內(nèi)關(guān)鍵基因的閾值為MM＞0.8，GS＞0.5。

1.6 GO、KEGG富集分析及蛋白質(zhì)（PPI）網(wǎng)絡(luò)互作分析

GO和KEGG分析對(duì)關(guān)鍵基因行功能注釋及通路富集[8]，采用“clusterProfiler”包進(jìn)行富集分析。當(dāng)FDR＜0.05時(shí)，認(rèn)為結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。通過(guò)在線工具STRING（https://www.string-db.org/)[9]進(jìn)行蛋白網(wǎng)絡(luò)互作分析（PPI），并用Cytoscape軟件實(shí)現(xiàn)可視化[10]。PPI中關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)的篩選閾值為最低篩選分?jǐn)?shù)≥0.8。以節(jié)點(diǎn)數(shù)最高的基因作為樞紐基因。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

運(yùn)用R軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P＜0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

2 結(jié)果

2.1 mRNAsi與臨床特征及預(yù)后的相關(guān)性分析

與正常子宮內(nèi)膜組比較，腫瘤組的mRNAsi表達(dá)量與UCEC患者的病理分級(jí)及年齡（以65歲為界）成正相關(guān)（P＜0.001）（圖1A 和 B）。

圖1 mRNAsi與UCEC患者臨床病理分級(jí)及年齡的相關(guān)性

2.2 差異基因篩選

在TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中得到575個(gè)樣本（包括552個(gè)UCEC組及23個(gè)正常組），篩選出6267個(gè)差異表達(dá)基因，包括2406個(gè)下調(diào)基因和3861個(gè)上調(diào)基因（圖2）。

圖2 差異基因的篩選：紅色基因代表在樣本中上調(diào)的基因，綠色表示下調(diào)的基因

2.3 WGCNA篩選關(guān)鍵模塊與基因

根據(jù)“WGCNA”包對(duì)樣本行聚類分析獲得16個(gè)關(guān)鍵模塊。為了保證無(wú)尺度網(wǎng)絡(luò)的準(zhǔn)確性，其篩選的軟閾值為4（R2=0.95）（圖3A）。通過(guò)動(dòng)態(tài)剪切樹算法分割模塊，形成模塊樹狀圖（圖3B），計(jì)算16個(gè)模塊內(nèi)的基因與mRNAsi及表觀調(diào)控的mRNAsi（EREG-mRNAsi）的相關(guān)性，其中藍(lán)綠色模塊與mRNAsi呈明顯的正相關(guān)且相關(guān)系數(shù)最高（圖3C，r=0.70,P=4e-80），棕色模塊與mRNAsi呈顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.55,P=2e-42）。因此，我們選擇藍(lán)綠色模塊進(jìn)行分析篩選得到關(guān)鍵基因（圖3D）。以 MM＞0.8，GS＞0.5為篩選標(biāo)準(zhǔn)，共得到 44個(gè)與腫瘤干細(xì)胞干性相關(guān)的基因（P＜0.01），這些基因在UCEC組中上調(diào)（圖4A，B）。在這44個(gè)基因的相關(guān)性分析結(jié)果中，DEPDC1和CENPI及CENPE 的相關(guān)性最高(r=0.87)（圖4C）。

2.4 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)及功能富集分析

對(duì)44個(gè)基因構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（PPI），運(yùn)用Cytoscape軟件進(jìn)行可視化處理，節(jié)點(diǎn)數(shù)最多的10個(gè)基因?yàn)門TK、NCAPH、NCAPG、KIF15、KIF11、CDCA8、CCNB1、CCNA2、BUB1B 和 BUB1（圖5）。GO和KEGG功能富集分析得到關(guān)鍵基因主要富集于細(xì)胞周期調(diào)控，有絲分裂姐妹染色單體分離，同源重組修復(fù)等通路（圖6）。

3 討論

在多種癌癥組織中發(fā)現(xiàn)癌細(xì)胞可表現(xiàn)出與干細(xì)胞特性相似的生物學(xué)功能，包括：（1）自我更新調(diào)節(jié)機(jī)制；（2）腫瘤細(xì)胞可能來(lái)源于正常干細(xì)胞[11]。并且有研究表明腫瘤組織中存在小部分具有無(wú)限增殖能力的腫瘤干細(xì)胞（CSCs）群體[12]。在概念上提出干細(xì)胞樣癌細(xì)胞的數(shù)年后，學(xué)者首次在白血病模型中證實(shí)CD34+CD38-白血病細(xì)胞表現(xiàn)出骨髓造血干細(xì)胞特征[13]。同時(shí)實(shí)體瘤內(nèi)的CSCs（CD44+CD24-/lowLineage-細(xì)胞）已在乳腺癌、腦、結(jié)腸、胰腺、肝和肺癌中發(fā)現(xiàn)。因此，CD34+,CD44+被認(rèn)為是在癌癥組織中獨(dú)特的CSCs標(biāo)記物[14]。

圖3 關(guān)鍵模塊的篩選

圖4 藍(lán)綠色模塊中的差異基因篩選及基因間的相關(guān)性分析

圖5 10個(gè)樞紐基因的篩選：44個(gè)關(guān)鍵基因的PPI圖，及10個(gè)樞紐基因的PPI圖

圖6 GO和KEGG分析

本研究采用WGCNA篩選出的10個(gè)樞紐基因參與了多種腫瘤的發(fā)生，其功能主要富集在有絲分裂核分裂、核染色體分離、紡錘體檢查點(diǎn)功能和同源重組修復(fù)通路中，這與多位學(xué)者的研究結(jié)果一致[15]。Mps1(TTK)的表達(dá)水平降低導(dǎo)致乳腺癌細(xì)胞的有絲分裂異常[16]。CDCA5和CDCA8表達(dá)異常影響了細(xì)胞核的分裂，主要參與膀胱癌的細(xì)胞周期過(guò)程[17]。Imai T等人的研究表明，KIF11在食管鱗狀細(xì)胞癌(ESCC)和結(jié)直腸癌(CRC)組織中的CSCs里發(fā)揮著重要作用[18]。HuiCai等人的研究報(bào)道CCNB1通過(guò)調(diào)控細(xì)胞周期來(lái)影響子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)[19]，此外，在腦癌CSCs中，CCNB1和BUB1B可影響與有絲分裂和紡錘體檢查點(diǎn)功能有關(guān)的蛋白分泌，從而調(diào)控CSCs的增殖[20]。然而，這10個(gè)樞紐基因與UCEC中CSCs的干性特征的關(guān)系尚未明確。本次研究發(fā)現(xiàn)，這些基因的失調(diào)可能與UCEC中CSCs的干性特征有關(guān)。

4 結(jié)論

CSCs位于腫瘤細(xì)胞層級(jí)的頂端，并具有建立和驅(qū)動(dòng)腫瘤發(fā)生的獨(dú)特能力。我們通過(guò)WGCNA分析獲得了與UCEC干性特征相關(guān)的樞紐基因（即TTK、NCAPH、NCAPG、KIF15、KIF11、CDCA8、CCNB1、CCNA2、BUB1B 和 BUB1）。而這些基因在調(diào)節(jié)細(xì)胞周期中起著至關(guān)重要的作用，可能影響UCEC的干細(xì)胞維持。因此，我們的研究有助于深入理解UCEC的分子機(jī)制，我們獲得的這10個(gè)樞紐基因可能為研究靶向治療UCEC的治療靶點(diǎn)提供參考。