載藥脂質(zhì)體包封率測(cè)定方法的研究進(jìn)展

張 藝，杭太俊，宋 敏

（中國(guó)藥科大學(xué)藥物分析系，南京210009）

脂質(zhì)體是指將藥物包封于脂質(zhì)雙分子層中形成的具有納米結(jié)構(gòu)的新型制劑。包裹藥物的脂質(zhì)雙分子層由磷脂和膽固醇組成，其結(jié)構(gòu)內(nèi)核由磷脂分子的頭部聚集而成，具有親水性，可包裹水溶性藥物［1］，如已上市的鹽酸多柔比星脂質(zhì)體注射液，其較傳統(tǒng)劑型靶向性有所增強(qiáng)，不良反應(yīng)明顯降低［2］。磷脂分子的尾部平行排列組成親脂性的圓環(huán)結(jié)構(gòu)，可攜帶脂溶性藥物。例如，目前已上市的注射用紫杉醇脂質(zhì)體，它是將脂溶性藥物紫杉醇包裹在脂質(zhì)體中，藥物溶解性得以增加，同時(shí)避免了聚氧乙烯蓖麻油和無水乙醇混合溶媒的使用，極大地減輕了溶媒所引起的過敏反應(yīng)［3］。

包封率是脂質(zhì)體的關(guān)鍵質(zhì)量屬性，它指的是包封在脂質(zhì)雙分子層中的藥物含量占總投藥量的百分比，能反映出脂質(zhì)體中藥物包封程度的高低，以指導(dǎo)制備工藝的改進(jìn)。

由于包封的藥物性質(zhì)不同，脂質(zhì)體膜材料不同，測(cè)定每種脂質(zhì)體包封率的最佳方法往往需要經(jīng)實(shí)驗(yàn)考察才能確定。包封率測(cè)定的關(guān)鍵是將包封藥物和未包封的游離藥物分離，再利用光譜、色譜等分析手段檢測(cè)包封藥物或游離藥物的濃度。

常用的包封率測(cè)定方法有：離心法、超濾離心法、葡聚糖凝膠柱法、微柱離心法、透析與反透析法、魚精蛋白凝聚法等［4］。

1 常用的包封率測(cè)定方法

1.1 離心法

按照離心轉(zhuǎn)速的不同，離心法分為低速離心法和超速離心法。低速離心法適用于脂溶性藥物［4］，其工作原理是脂溶性的游離藥物不溶于溶解脂質(zhì)體所需的水相介質(zhì)，而懸浮在體系中，采用相對(duì)較小的離心強(qiáng)度和較短的離心時(shí)間，這些未溶的游離藥物會(huì)因離心力的作用而沉降，但脂質(zhì)體仍存在于上清液中，從而實(shí)現(xiàn)分離。

Sun［5］合成了乙酰半胱氨酸衍生物XXH-32，其難溶于水，傳統(tǒng)劑型給藥后生物利用度低，于是將其制成脂質(zhì)體。在測(cè)定XXH-32脂質(zhì)體的包封率時(shí)考察了1 000、1 500、2 000、2 500和3 000 r/min 5種離心轉(zhuǎn)速，2 000 r/min時(shí)分離度最大，故最終選擇了2 000 r/min為離心轉(zhuǎn)速；還考察了2、4、6、8和10 min 5種離心時(shí)間，發(fā)現(xiàn)離心6～10 min，分離效果差別不大，所以選擇離心6 min。實(shí)際應(yīng)用中，上清和沉淀常常不易完全分離，故低速離心法適用范圍相對(duì)有限。

超速離心法要求離心轉(zhuǎn)速大于20 000 r/min，離心時(shí)間一般要長(zhǎng)于30 min。離心過程中因空氣摩擦產(chǎn)熱，需使用控溫離心機(jī)。與低速離心法剛好相反，超速離心法中脂質(zhì)體最終存在于沉淀中。由于脂質(zhì)體和不溶的游離藥物會(huì)一起沉降下來，無法實(shí)現(xiàn)二者的分離，所以此法適用于水溶性較好的藥物的測(cè)定，可保證游離藥物仍存在于上清液中。此外應(yīng)注意較強(qiáng)的離心力作用可能會(huì)導(dǎo)致微粒聚集，破壞脂質(zhì)體雙分子層結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致藥物發(fā)生泄漏［4］。Lopez-Pinto等［6］發(fā)現(xiàn)在制備脂質(zhì)體時(shí)可以通過增加膽固醇的用量來提高脂質(zhì)雙分子層的硬度，以減小離心力對(duì)脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)的影響。Wang等［7］采用超速離心法測(cè)定了鹽酸多柔比星脂質(zhì)體的包封率：取鹽酸多柔比星脂質(zhì)體1 mL，以200 000 r/min轉(zhuǎn)速離心30 min，收集上清液并用生理鹽水定容至5 mL，測(cè)定其中游離藥物質(zhì)量，再根據(jù)含藥總量計(jì)算出包封率。Han等［8］發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)顆粒與檸檬酸鈉能夠形成絮狀物，離心后此種絮狀物會(huì)上浮，而游離藥物仍存在于溶液中，利用此性質(zhì)可將脂質(zhì)體和游離藥物分離。此外，還考察了加入的檸檬酸鈉濃度，發(fā)現(xiàn)加入濃度越高，溶液密度越大，脂質(zhì)顆粒上浮的越多，和游離藥物分離就越完全。對(duì)于紫杉醇陽(yáng)離子脂質(zhì)納米粒，加入10%的檸檬酸鈉分離最優(yōu)；而對(duì)于多柔比星脂質(zhì)體，加入20%的檸檬酸鈉分離最優(yōu)。

Xu［9］綜合了兩種離心方法，即先進(jìn)行低速離心，再超速離心，更為準(zhǔn)確地測(cè)定了有機(jī)金屬銥配合物脂質(zhì)體包封率的數(shù)值。先將有機(jī)金屬銥配合物脂質(zhì)體混懸液在4℃條件下以5 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min，未包封的金屬銥配合物被沉淀下來，再將上清液用35 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心1 h，以去除上清液中的脂質(zhì)體部分，再分別測(cè)定低速離心后沉淀中和超速離心后上清液中的藥物含量，二者總和為脂質(zhì)體中游離藥物的含量。

1.2 超濾離心法

超濾離心法是將脂質(zhì)體放入配有超濾膜的超濾管中，在適宜的轉(zhuǎn)速下離心，游離藥物在離心力的作用下可通過超濾膜，而脂質(zhì)體則被截留，從而實(shí)現(xiàn)二者的分離。

超濾離心法多用于測(cè)定水溶性藥物脂質(zhì)體的包封率。而Sui等［10］利用該法成功測(cè)定了脂溶性藥物甘草次酸脂質(zhì)體的包封率：取甘草次酸脂質(zhì)體溶液0.5 mL，以10 000 r/min的轉(zhuǎn)速超濾離心30 min，再檢測(cè)超濾液中游離甘草次酸的濃度并計(jì)算包封率。還分別進(jìn)行了游離藥物回收率以及游離藥物和空白脂質(zhì)體混合物的加樣回收率試驗(yàn)，甘草次酸的回收率均在97%以上，說明游離的甘草次酸可以完全通過超濾膜。Mu等［11］制備了吡唑類活性物質(zhì)XY-4陽(yáng)離子脂質(zhì)體，并探究了不同超濾時(shí)間和離心轉(zhuǎn)速對(duì)包封率測(cè)定的影響，最終確定超濾條件為4 000 r/min離心10 min。Gao等［12］制備了長(zhǎng)循環(huán)嗎啡脂質(zhì)體，采用超濾離心法測(cè)定其包封率，離心條件為以10 319 r/min的轉(zhuǎn)速離心5 min，不更換超濾單元，重復(fù)超濾離心3次，取最后一次超濾液稀釋后進(jìn)樣，測(cè)定其中游離嗎啡濃度，并計(jì)算包封率。

然而“濃差極化”現(xiàn)象的存在限制了超濾法的應(yīng)用。濃差極化現(xiàn)象是由于在超濾過程中，溶劑和小分子溶質(zhì)能透過超濾膜，而大分子溶質(zhì)被截留在膜內(nèi)，這就會(huì)導(dǎo)致超濾膜表面的大分子溶質(zhì)濃度升高，引起膜附近的滲透壓增加，阻礙溶液繼續(xù)向超濾膜方向擴(kuò)散，進(jìn)而降低了溶劑和小分子物質(zhì)的膜透過率。兩性霉素B是一種常用的抗真菌藥，已有多家藥企研制出兩性霉素B脂質(zhì)體并成功上市。Ran等［13］制備了兩性霉素B脂質(zhì)體，超濾離心后，將獲得的超濾液進(jìn)行HPLC分析，結(jié)果未測(cè)到兩性霉素B。Ran等認(rèn)為脂溶性較強(qiáng)的兩性霉素B在水中形成的大分子聚合物，脂質(zhì)雙分子層和其他有黏性的輔料都可能導(dǎo)致了濃差極化層的形成，從而降低了膜的滲透性，使得游離小分子藥物的透過率減小。對(duì)樣品進(jìn)行稀釋，從而減小磷脂類輔料的黏度可在一定程度上減輕濃差極化現(xiàn)象，但是對(duì)于包載脂溶性藥物的脂質(zhì)體，稀釋不但會(huì)降低游離藥物濃度，還可能導(dǎo)致“滲透壓休克”［14］，即因脂質(zhì)體膜內(nèi)外滲透壓不一致而導(dǎo)致脂質(zhì)體泄漏。若稀釋后發(fā)生了滲透壓休克，還可以嘗試通過增大離心力來增加游離藥物的膜透過率。但傳統(tǒng)的超濾膜在高離心力作用下容易發(fā)生破損，而中空纖維超濾離心裝置憑借其中空結(jié)構(gòu)可以耐受更高的離心力，并且由于中空纖維膜一直浸沒在樣品溶液和超濾液之間，游離藥物可以自由通過超濾膜，因此能夠較好地避免濃差極化現(xiàn)象［15］。Xu等［16］利用中空纖維超濾離心法測(cè)定了注射用兩性霉素B脂質(zhì)體的包封率，高、中、低三個(gè)水平的兩性霉素B對(duì)照溶液經(jīng)過中空纖維超濾離心之后，回收率約為98%，空白脂質(zhì)體加樣回收率為100%左右，可見中空纖維超濾離心法更適用于兩性霉素B脂質(zhì)體包封率的測(cè)定。

1.3 葡聚糖凝膠柱法

葡聚糖顆粒在溶脹后可形成凝膠狀結(jié)構(gòu)，其內(nèi)部具有一定大小的孔徑，小分子游離藥物可進(jìn)入孔內(nèi)，實(shí)現(xiàn)一定程度的保留；而脂質(zhì)體粒徑大于凝膠孔徑，脂質(zhì)體無法進(jìn)入孔內(nèi)，于是少量洗脫液便可將其洗脫下來。利用脂質(zhì)體和游離藥物在葡聚糖凝膠柱上保留能力的不同可實(shí)現(xiàn)二者的分離。Li等［17］制備了轉(zhuǎn)鐵蛋白修飾的長(zhǎng)春新堿-粉防己堿脂質(zhì)體，采用葡聚糖G-50凝膠柱測(cè)定其包封率。由于該批脂質(zhì)體包封率較高，導(dǎo)致含量較低的游離藥物在洗脫曲線上未出現(xiàn)明顯的洗脫峰，于是決定向脂質(zhì)體中加入一定量的長(zhǎng)春新堿對(duì)照品，以增加游離藥物含量，使洗脫情況能夠更清晰地呈現(xiàn)出來。Li等在0.5 mL脂質(zhì)體中加入了0.2 mg長(zhǎng)春新堿對(duì)照品，混勻后加于凝膠柱上，以PBS緩沖液進(jìn)行洗脫，收集20管洗脫液，測(cè)定其中長(zhǎng)春新堿的含量并繪制洗脫曲線，從洗脫曲線上可以看出脂質(zhì)體和游離長(zhǎng)春新堿完全分離。由于Sephadex G-50在遇到有機(jī)溶劑時(shí)易發(fā)生脫水，因此Zheng等［18］采用更耐受有機(jī)溶劑的Sephadex LH-20凝膠柱分離阿霉素與他莫昔芬雙載藥脂質(zhì)體和游離藥物，洗脫液選用了脂質(zhì)體的外水相HEPES緩沖液以及甲醇。Xu等［19］比較了葡聚糖凝膠柱法和中空纖維超濾離心法測(cè)定吲哚美辛與維生素A共載脂質(zhì)體的包封率，發(fā)現(xiàn)葡聚糖凝膠柱法測(cè)定的包封率值要低于中空纖維超濾離心法；分析原因?yàn)槠暇厶悄z柱法中加入的大量洗脫液稀釋了整個(gè)脂質(zhì)體系統(tǒng)，破壞了脂質(zhì)體和游離藥物原有的動(dòng)態(tài)平衡，脂質(zhì)體發(fā)生了泄漏，因而測(cè)得的包封率值較低。故在使用此法時(shí)，一定要密切關(guān)注脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)的完整性。若實(shí)驗(yàn)效果不佳，可用微柱離心法替代。

1.4 微柱離心法

相比葡聚糖凝膠柱法，微柱離心法加入的洗脫液體積大大減小，避免了脂質(zhì)體因稀釋作用而發(fā)生的泄漏。此法是將溶脹好的葡聚糖凝膠或經(jīng)預(yù)處理的離子交換樹脂裝入注射器中，反復(fù)平衡、離心后制成干燥的微柱，然后在其頂端加入脂質(zhì)體混懸液，靜置幾分鐘后再加入洗脫液，設(shè)置適宜的離心轉(zhuǎn)速將脂質(zhì)體洗脫下來［20］。若凝膠對(duì)脂質(zhì)體有很強(qiáng)的吸附作用，則不能選用該法。實(shí)驗(yàn)中應(yīng)注意離心轉(zhuǎn)速的選擇，轉(zhuǎn)速過大或過小都可能引起凝膠柱柱頭斷裂，且轉(zhuǎn)速過大會(huì)將游離藥物也洗脫下來。Song等［21］制備了表面修飾唾液酸的唑來膦酸與多柔比星共載脂質(zhì)體，采用陽(yáng)離子交換纖維微柱法測(cè)定其包封率，離心條件為以2 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心4 min，再用重蒸水洗脫2次，測(cè)定洗脫液中包封藥物濃度，并計(jì)算包封率。Xu等［22］對(duì)預(yù)飽和Sephadex G-25微柱所需的空白脂質(zhì)體用量及預(yù)飽和次數(shù)進(jìn)行了考察，發(fā)現(xiàn)當(dāng)預(yù)飽和空白脂質(zhì)體用量為150μL時(shí)過柱率已達(dá)到100%，說明此時(shí)微柱對(duì)空白脂質(zhì)體的吸附已飽和，所以最終預(yù)飽和用量選定為150μL；預(yù)飽和3次時(shí)，空白脂質(zhì)體的過柱率最接近100%，故確定預(yù)飽和次數(shù)為3次。因此當(dāng)脂質(zhì)體濃度較低時(shí)應(yīng)注意對(duì)預(yù)飽和條件進(jìn)行考察，以減少柱分析過程中脂質(zhì)體的損失。

1.5 透析與反透析法

透析法是將脂質(zhì)體放入截留一定分子量的透析袋內(nèi)，一般用水或PBS緩沖液作為透析介質(zhì)，游離藥物因透析袋內(nèi)外的濃度差而向透析介質(zhì)中轉(zhuǎn)移，而脂質(zhì)體因?yàn)榱捷^大則被截留在透析袋內(nèi)，二者因此實(shí)現(xiàn)分離。但脂溶性游離藥物在透析介質(zhì)中溶解度較差，會(huì)聚集在透析膜表面，堵塞膜上微孔而無法進(jìn)入透析外液。

Mura等［23］為增加脂溶性藥物苯佐卡因在透析介質(zhì)中的溶解度，將50%乙醇作為透析介質(zhì)。Feng［24］將黃芩苷對(duì)照品溶液1 mL置于透析袋內(nèi)，再放在PBS緩沖液250 mL中進(jìn)行透析，在0～13 h范圍內(nèi)，每小時(shí)取透析液3 mL測(cè)定其中藥物含量，并繪制透析曲線，發(fā)現(xiàn)7 h時(shí)已透析完全，于是將透析時(shí)間設(shè)定為7 h。隨后進(jìn)行的回收率試驗(yàn)中，高、中、低3個(gè)濃度的回收率均在97%以上，說明此法可用于黃芩苷脂質(zhì)體包封率的測(cè)定。

透析試驗(yàn)中為了滿足漏槽條件，需要大量的透析介質(zhì)，這無疑會(huì)稀釋整個(gè)脂質(zhì)體系統(tǒng)，破壞脂質(zhì)體和周圍游離藥物的動(dòng)態(tài)平衡，甚至導(dǎo)致脂質(zhì)體的泄漏，并且較長(zhǎng)的透析時(shí)間也對(duì)脂質(zhì)體的穩(wěn)定性有很高的要求。反透析法可以避免上述問題的發(fā)生。它是將脂質(zhì)體放在透析袋外，透析袋內(nèi)裝入透析介質(zhì)。由于透析介質(zhì)用量大大減少，可有效避免脂質(zhì)體因?yàn)橄♂屪饔枚l(fā)生的泄漏。Wang等［25］制備了β-紫羅蘭酮脂質(zhì)體，在測(cè)定包封率時(shí)取20%乙醇5 mL置于透析袋內(nèi)，再將脂質(zhì)體混懸液5 mL用20%乙醇水溶液稀釋至200 mL，把透析袋放入其中進(jìn)行透析，12 h后測(cè)定透析液中游離β-紫羅蘭酮的濃度。Bai［26］比較了透析法和反透析法對(duì)馬來酸桂哌齊特脂質(zhì)體包封率的測(cè)定效果，發(fā)現(xiàn)透析法中游離藥物一直難以達(dá)到透析平衡，而反透析法中透析150 min后基本達(dá)到透析平衡，決定選用反透析法測(cè)定包封率。

1.6 其他方法

包封率測(cè)定方法還包括：魚精蛋白凝聚法、固相萃取法、熒光法等。

魚精蛋白是一種堿性蛋白質(zhì)，帶正電，它可與帶負(fù)電或中性的脂質(zhì)體結(jié)合形成聚合物，密度有所增加，離心后脂質(zhì)體-魚精蛋白聚合物被沉淀下來，因而與游離藥物實(shí)現(xiàn)分離。Fu等［27］將黃藤素納米柔性脂質(zhì)體1.5 mL與魚精蛋白溶液（10 mg/mL）1.5 mL混合，搖勻后靜置3 min，再進(jìn)行離心，之后將沉淀用曲拉通X-100甲醇溶液2 mL處理后進(jìn)樣測(cè)定?？梢杂^察到經(jīng)過魚精蛋白沉淀后，原來均一的脂質(zhì)體混懸液分層明顯，上層藥液澄清透亮，下層沉淀緊密，便于后續(xù)分離操作。Liu等［28］自制了多西他賽脂質(zhì)體，并比較了高速離心法和魚精蛋白凝聚法測(cè)定結(jié)果的差異，同時(shí)考察了加入不同濃度的增溶劑吐溫80對(duì)包封率測(cè)定結(jié)果的影響；從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出高速離心法測(cè)定的結(jié)果要低于魚精蛋白凝聚法；此外隨著吐溫80濃度增加，兩種方法測(cè)定的包封率結(jié)果均減小。Liu等認(rèn)為高速離心作用和表面活性劑吐溫80，均可能會(huì)破壞脂質(zhì)體原有的亞微米級(jí)結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致包封率測(cè)定值偏低。而魚精蛋白凝聚法利用的是脂質(zhì)體的電荷性質(zhì)，不會(huì)對(duì)其結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響。

固相萃取法利用的是色譜吸附原理，游離藥物被吸附在極性相近的SPE柱固定相上，而脂質(zhì)體在SPE柱上無保留，少量水便可洗脫下來。Deshpande等［29］利用Oasis HLB固相萃取小柱成功分離了血漿中的兩性霉素B脂質(zhì)體和游離藥物，其在待分離血漿混合物中加入了0.1%氨水溶液500μL，作用是增強(qiáng)游離藥物在固定相上的保留。但是游離藥物在高濃度點(diǎn)的回收率不理想，懷疑是氨水溶液加入量不足，于是在收集到的洗脫液中再加入0.1%氨水溶液250μL，再將這部分洗脫液重新上樣，游離的兩性霉素B被SPE柱固定相充分吸附，獲得了滿意的回收率結(jié)果。Zhang等［30］發(fā)現(xiàn)市售的C18固相萃取小柱常常會(huì)吸附紫杉醇脂質(zhì)體，導(dǎo)致包封率測(cè)定結(jié)果偏低，而且由于市售固相萃取小柱中的填料孔徑小而致密，大粒徑的脂質(zhì)體很難被洗脫下來，于是自制了一種固相萃取柱。為了減弱填料對(duì)脂質(zhì)體的吸附，Zhang等使用了較大粒徑的填料（40～60μm），并且減小了裝填的緊密程度，此外還對(duì)固相萃取柱下端篩板進(jìn)行了鈍化處理，最終獲得了滿意的結(jié)果。固相萃取法對(duì)脂質(zhì)體和游離藥物的分離度較高，因?yàn)樗墙柚卣鞯?，更穩(wěn)定的吸附能力的差異實(shí)現(xiàn)分離。然而該法較為復(fù)雜，藥物與SPE柱固定相之間吸附作用的強(qiáng)弱受多種因素影響，需要進(jìn)行大量實(shí)驗(yàn)才能摸索出最佳的實(shí)驗(yàn)條件。

目前使用的包封率測(cè)定方法大部分都需要先將脂質(zhì)體和游離藥物分離，而熒光法不需進(jìn)行分離，只要利用包封藥物和游離藥物不同的熒光特性，比較脂質(zhì)體破乳前后熒光強(qiáng)度的變化，便可計(jì)算出包封率。Meng等［31］將RiboGreen熒光染料加入到共載米鉑與核酸miR-34a陽(yáng)離子脂質(zhì)體溶液中，游離的miR-34a分子會(huì)與RiboGreen染料結(jié)合產(chǎn)生熒光，利用外標(biāo)法可以計(jì)算出游離miR-34a的濃度，另取一份脂質(zhì)體破乳后測(cè)定miR-34a總濃度，從而計(jì)算出包封率。熒光法專屬性強(qiáng)，靈敏度高，但能發(fā)生特定熒光反應(yīng)的化合物較少，限制了熒光法在包封率測(cè)定中的應(yīng)用。

上述脂質(zhì)體包封率測(cè)定案例根據(jù)主藥溶解性和磷脂類輔料組成的不同總結(jié)見表1。

表1 幾種載藥脂質(zhì)體包封率測(cè)定方法對(duì)比

2結(jié) 論

本文介紹了多種常見的包封率檢測(cè)方法，如低速離心法適用于脂溶性藥物，操作簡(jiǎn)單，且不易破壞脂質(zhì)體膜結(jié)構(gòu)，但脂質(zhì)體和游離藥物常常不能完全分離；超速離心法多用于水溶性藥物，且要求脂質(zhì)體膜結(jié)構(gòu)有一定的硬度，能夠耐受高轉(zhuǎn)速的影響。超濾離心法適用范圍較廣，超濾膜的材料和截留分子量有多種類型，可滿足試驗(yàn)者的多重需要；其缺點(diǎn)是可能會(huì)出現(xiàn)濃差極化現(xiàn)象，在一定程度上稀釋脂質(zhì)體待測(cè)溶液可以避免該現(xiàn)象的發(fā)生。葡聚糖凝膠柱法和微柱離心法均是利用分子排阻的原理來分離，但如果藥物在凝膠柱上無保留或吸附過強(qiáng)，則不能采用這兩種方法。葡聚糖凝膠柱法由于大量洗脫液的加入稀釋了脂質(zhì)體系統(tǒng)，可能會(huì)導(dǎo)致脂質(zhì)體泄漏。但是微柱離心法的柱體積小，加入洗脫液的體積也少，不會(huì)引起脂質(zhì)體泄漏，但是需要考察離心轉(zhuǎn)速，以獲得最佳的分離效果。透析法也是測(cè)定包封率的常用手段，適用于水溶性藥物，但是透析時(shí)間一般長(zhǎng)達(dá)36 h以上，對(duì)脂質(zhì)體穩(wěn)定性有較高要求；此外大量透析介質(zhì)的加入同樣會(huì)稀釋脂質(zhì)體系統(tǒng)，也可能導(dǎo)致脂質(zhì)體泄漏。反透析法極大地減少了透析介質(zhì)的用量，較好地避免了因稀釋作用而發(fā)生的脂質(zhì)體泄漏。魚精蛋白凝聚法只適用于帶負(fù)電及中性的脂質(zhì)體，而固相萃取法雖然在分離脂質(zhì)體和游離藥物方面有不錯(cuò)的效果，但是實(shí)驗(yàn)方法復(fù)雜，不易摸索出最佳分離條件。熒光法可在脂質(zhì)體和游離藥物共存的狀態(tài)下測(cè)定包封率，不要求把二者分離，但一般均需要引入熒光指示劑，發(fā)生某種熒光反應(yīng)來計(jì)算包封率。

根據(jù)待測(cè)物的性質(zhì)和各種測(cè)定方法的特點(diǎn)，總結(jié)出脂質(zhì)體包封率測(cè)定方法選擇決策樹，見圖1。

3展望

現(xiàn)有的包封率測(cè)定方法基本上都是利用脂質(zhì)體和游離藥物在粒徑尺寸方面的差異先將二者分離，再準(zhǔn)確測(cè)定某一方的濃度。但是這種物理差異專屬性不強(qiáng)且不穩(wěn)定，易受影響和干擾。魚精蛋白凝聚法借助電荷吸附作用增大了脂質(zhì)體和游離藥物的物理差異，使二者分離得更完全；SPE法和離子交換色譜法利用脂質(zhì)體和游離藥物在色譜固定相上保留能力的差異實(shí)現(xiàn)了分離，也是一種較好的選擇；熒光法不需要分離脂質(zhì)體和游離藥物，通過比較破乳前后熒光強(qiáng)度的變化便可計(jì)算出包封率。

圖1 脂質(zhì)體包封率測(cè)定方法選擇決策樹

未來包封率測(cè)定方法應(yīng)該更多地結(jié)合光譜、色譜等手段，以增加方法的專屬性和可靠性，還可利用脂質(zhì)體和游離藥物在物理、化學(xué)性質(zhì)方面其他的不同點(diǎn)，開發(fā)出具有不同工作原理的新方法，并且各種方法之間可以相互印證，使測(cè)定結(jié)果更可靠。