馬賽替尼通過(guò)抑制自噬和細(xì)胞凋亡減輕腦缺血/再灌注損傷

王 燕，平鋒鋒，周丹麗，陳艷華，凌菁菁*

（1南京醫(yī)科大學(xué)附屬無(wú)錫市兒童醫(yī)院藥學(xué)部，無(wú)錫214023；2南京醫(yī)科大學(xué)附屬無(wú)錫市人民醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科，無(wú)錫214023）

腦卒中是一種常見(jiàn)的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，因其具有高發(fā)病率、高致殘率和高致死率的特點(diǎn)，對(duì)人類健康帶來(lái)極大威脅。缺血性腦卒中是腦卒中的主要類型，占腦卒中患者總數(shù)的60%～70%。一項(xiàng)世界衛(wèi)生組織調(diào)查報(bào)道，我國(guó)腦卒中的發(fā)病率居于世界首位，且隨著人口老齡化，發(fā)病率還在逐年上升［1-2］。因此，研究缺血性腦卒中的發(fā)病機(jī)制和損傷后的修復(fù)機(jī)制，尋找能有效改善神經(jīng)功能，發(fā)揮腦保護(hù)作用的藥物一直是眾多神經(jīng)病學(xué)科研工作者為之努力的方向。馬賽替尼（masitinib）是一種口服的C-kit抑制劑，C-kit屬于Ⅲ型蛋白酪氨酸激酶受體超家族成員，其配體為SCF［3-4］。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，SCF在腦缺血/再灌注（I/R）損傷后，發(fā)揮重要的神經(jīng)保護(hù)作用［5-6］。但C-kit是否參與缺血性腦卒中的發(fā)病機(jī)制尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)線栓法建立大鼠大腦中動(dòng)脈閉塞（MCAO）模型，灌胃給予不同劑量的馬賽替尼，評(píng)估馬賽替尼治療缺血性腦卒中的潛力，并對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行初步探討，以期為臨床腦卒中的治療提供有力的實(shí)驗(yàn)依據(jù)和新的研究思路。

1材料

1.1 藥品與試劑

馬賽替尼（法國(guó)ABScience公司）；2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC，中國(guó)醫(yī)藥上?；瘜W(xué)試劑公司）；TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（上海碧云天生物科技有限公司）；全蛋白抽提試劑盒、BCA蛋白含量檢測(cè)試劑盒（江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司）；cDNA第一鏈合成試劑盒、One Step TB Green?PrimeScript?RT-PCR Kit II（SYBR Green，日本TaKaRa公司）。LC3抗體（美國(guó)Santa Cruz公司），Beclin-1、IkB-α、P62、p65、Bcl-2、Bcl-xl、Bax、Bad、caspase 8抗體（美國(guó)Abcam公司），Bid抗體（美國(guó)Proteintech公司），p-IkB-α、cleaved-caspase 3、GAP?DH抗體（美國(guó)CST公司），羊抗兔IgG-HRP（江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司），其他試劑均為市售分析純。

1.2儀器

Sartorius BT 125D電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；5804R型臺(tái)式冷凍高速離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司）；Trans-Blot Turbo全能型蛋白轉(zhuǎn)印系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad公司）；凝膠成像系統(tǒng)（英國(guó)Syngene公司）；熒光定量PCR循環(huán)儀（美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司）；2838MCAO栓線（北京沙東生物技術(shù)有限公司）。

1.3動(dòng)物

健康雄性Sprague-Dawley大鼠，體重260～280 g，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供（合格證編號(hào)：SYXK（蘇）2017-0015）。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均符合動(dòng)物倫理委員會(huì)標(biāo)準(zhǔn)。

2方法

2.1 動(dòng)物分組和受試藥的配制

大鼠適應(yīng)環(huán)境7 d后，隨機(jī)分成偽手術(shù)（Sham）組、I/R模型組、馬賽替尼低劑量組（18.9 mg/kg）、馬賽替尼中劑量組（37.8 mg/kg）、馬賽替尼高劑量組（75.6 mg/kg）、依達(dá)拉奉（3 mg/kg）組，每組12只。

馬賽替尼的具體配制方法如下：稱取馬賽替尼7.56 g溶于生理鹽水10 mL中，配制成756 mg/mL的母液。臨用前取母液0.5 mL至生理鹽水50 mL中，稀釋得到7.56 mg/mL的高劑量組母液，則高劑量組的給藥體積V（mL）=（75.6 mg/kg×大鼠體重（kg））/7.56 mg/mL，以此類推，配制好中劑量組和低劑量組的受試藥。大鼠缺血2 h后再灌注時(shí)即刻給藥，每天兩次，連續(xù)給藥7 d。Sham組和I/R組大鼠灌胃給予等容積生理鹽水。實(shí)驗(yàn)流程如圖1-A所示。

2.2 MCAO模型的建立

參照Longa法［7］建立大鼠MCAO模型，術(shù)前12 h禁食不禁水。大鼠異氟烷麻醉，仰臥位固定于手術(shù)臺(tái)上，頸部備皮，碘伏消毒。取頸部正中切口，小心分離皮下脂肪和肌肉，右側(cè)頸總動(dòng)脈（com?mon carotid artery，CCA）、頸外動(dòng)脈（external carotidartery，ECA）和頸內(nèi)動(dòng)脈（internal carotid artery，ICA）。用微小動(dòng)脈夾臨時(shí)夾閉CCA和ICA，并在CCA遠(yuǎn)心端備線勿扎緊。分離ECA主干，鈍性分離出甲狀腺動(dòng)脈和枕動(dòng)脈，并電灼切斷；剪斷后將ECA下拉與ICA成一條直線。在距CCA分叉遠(yuǎn)端約2 mm處用眼科剪作細(xì)小斜向切口，將肝素浸泡過(guò)的線栓（直徑0.26 mm）插入，扎緊縫合線，松開(kāi)ICA動(dòng)脈夾，慢慢推動(dòng)線栓進(jìn)入ICA，使其從ICA入顱動(dòng)脈支。線栓穿過(guò)距ICA和ECA分叉處約2.0 cm有阻力感時(shí)，表明線栓已將大腦中動(dòng)脈堵塞，將備線扎緊并記錄栓塞開(kāi)始時(shí)間。將少量青霉素注射粉針涂于手術(shù)傷口，對(duì)齊并縫合皮下軟組織和皮膚，栓線尾部留于體外。2 h后緩慢退出線栓至CCA切口處，恢復(fù)MCA區(qū)血流供應(yīng)。術(shù)中維持大鼠肛溫37℃左右，直至動(dòng)物蘇醒。Sham組的動(dòng)物只做鈍性分離，但不插入線栓，其他操作與手術(shù)組相同。

2.3 神經(jīng)功能評(píng)分

再灌注7 d后，根據(jù)Zea Longa的神經(jīng)功能缺損5分制標(biāo)準(zhǔn)［7］，對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠進(jìn)行神經(jīng)行為功能評(píng)分。分?jǐn)?shù)越高，損傷越嚴(yán)重。剔除造模過(guò)程中死亡大鼠，以及取材時(shí)發(fā)現(xiàn)蛛網(wǎng)膜下腔出血的大鼠。

2.4 大鼠腦組織含水量的測(cè)定

再灌注7 d后，異氟烷過(guò)量深度麻醉處死大鼠，快速斷頭取腦，去除嗅球、小腦和低位腦干，迅速稱取腦濕重。然后將腦組織置于110℃干燥箱中烘至恒重，稱取腦組織干重。腦組織含水量=（腦組織濕重-腦組織干重）/腦組織濕重×100%。

2.5 大鼠腦組織梗死體積的測(cè)定

采用TTC染色法測(cè)定腦組織梗死體積。再灌注7 d后，10%水合氯醛過(guò)量深度麻醉處死大鼠，快速斷頭取腦，去除嗅球、小腦和低位腦干，即刻放入鼠腦專用切片模具中，按2 mm的規(guī)格冠狀切為5片，迅速加入2%TTC染色液，避光置于37℃水浴中保溫20 min，其間每隔7～8分鐘上下面翻動(dòng)一次。根據(jù)切片顏色結(jié)束染色過(guò)程，正常腦組織呈玫瑰紅色，梗死組織呈白色。將切片按層面順序排列整齊并用數(shù)碼相機(jī)拍攝照片后輸入電腦，使用Image-Pro Plus 6圖像分析軟件測(cè)定大腦健側(cè)半腦面積及梗死側(cè)正常組織面積。梗死面積百分比（%）=［（梗死面積×2 mm）/（2×健側(cè)腦面積×2 mm）］×100。

2.6 Western blot檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá)

再灌注7 d后處死動(dòng)物，取缺血側(cè)腦組織皮質(zhì)部分，放入預(yù)冷的組織裂解液（1∶9），冰浴中進(jìn)行勻漿，得到的組織勻漿于4℃12 000 r/min離心20 min，取上清液獲得總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度。加入適當(dāng)量的蛋白上樣緩沖液混勻、離心、變性、上樣。每孔加入上樣蛋白50μg，SDS-PAGE凝膠電泳分離，然后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜、封閉。加入一抗后4℃孵育過(guò)夜，二抗室溫?fù)u床孵育2 h。采用ECL發(fā)光試劑顯色，并經(jīng)Image J凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行顯影檢測(cè)。涉及到的一抗包括：LC3（1∶500），Beclin-1（1∶2 000），IkB-α（1∶2 000），p-IkB-α（1∶2 000），P62（1∶3 000），p65（1∶2 000），Bcl-2（1∶1 000），Bcl-xl（1∶1 000），Bax（1∶5 000），Bid（1∶5 000），Bad（1∶2 000），caspase 8（1∶2 000），cleaved-caspase 3（1∶1 000），GAPDH（1∶1 000）；二抗：羊抗兔IgGHRP（1∶5 000）。

2.7 RT-PCR檢測(cè)相關(guān)基因的表達(dá)

稱取各組大鼠腦組織100 mg，加Trizol 1 mL，提取總RNA，定量后取RNA 2μg逆轉(zhuǎn)為cDNA，用SYBR Green進(jìn)行擴(kuò)增，采用的循環(huán)為：95℃15 s，60℃1 min，95℃1 min，65℃10 s，共40個(gè)循環(huán)。采用GAPDH作為每次擴(kuò)增過(guò)程中的內(nèi)參，引物的序列見(jiàn)表1。

2.8 HE染色和TUNEL染色

制備腦組織石蠟切片，將組織切片經(jīng)過(guò)梯度乙醇常規(guī)脫蠟至水，經(jīng)蘇木精-伊紅（HE）染色、二甲苯透明后中性樹(shù)膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察。此外，依據(jù)TUNEL試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，光學(xué)顯微鏡下觀察各組大鼠腦組織凋亡神經(jīng)元并拍照計(jì)數(shù)。

2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用GraphPad Prism統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。所有數(shù)據(jù)采用xˉ±s表示，組間比較采用One-Way ANOVA檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3結(jié)果

3.1 馬賽替尼對(duì)I/R模型大鼠神經(jīng)功能和腦梗死的影響

Sham組無(wú)明顯神經(jīng)功能損傷。I/R損傷后，各組動(dòng)物表現(xiàn)出不同程度的神經(jīng)功能障礙，出現(xiàn)強(qiáng)迫體態(tài)和對(duì)側(cè)前肢偏癱，爬行時(shí)向偏癱側(cè)轉(zhuǎn)圈、追尾等相應(yīng)癥狀。如圖1-B所示，與Sham組相比，I/R組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分明顯升高（P＜0.001），表明I/R大鼠造模成功；與I/R組相比，馬賽替尼低、中、高劑量組和依達(dá)拉奉組大鼠經(jīng)過(guò)治療后，神經(jīng)功能缺損評(píng)分均不同程度降低（P＜0.05，P＜0.001，P＜0.001，P＜0.001），其中馬賽替尼高劑量組效果最突出。

再灌注7 d后，對(duì)腦組織進(jìn)行TTC染色，評(píng)估腦梗死的情況。正常腦組織因含有脫氫酶而被染成紅色，梗死腦組織因細(xì)胞膜損傷，導(dǎo)致脫氫酶被完全釋放丟失而不被染色。如圖1-C和1-D所示，Sham組大鼠的腦組織均呈紅色，無(wú)梗死灶出現(xiàn)；I/R組和馬賽替尼組均出現(xiàn)了不同程度的腦組織梗死。與Sham組相比，I/R組大鼠腦梗死體積明顯增加（P＜0.001）；與I/R組相比，馬賽替尼低、中、高劑量組和依達(dá)拉奉組均能夠不同程度的降低腦梗死體積（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.01，P＜0.01），其中馬賽替尼高劑量組的降幅最大。

Figure 1 Effects of masitinib on neurological score and infarction after ischemia/reperfusion(I/R)A:Experimental outline;B:Neurologic deficits were assessed at 7 d after reperfusion(xˉ±s,n=12);C:Infarcted brain regions were visualized using TTCstaining.Representative examples are shown from each treatment group;D:The ratio of corrected infarct area to whole brain area was calculated for thecerebral infarct size(xˉ±s,n=6).(E)Brain edemaweredetected in ischemic cerebral cortex after cerebral I/Rin rats(xˉ±s,n=6)*P＜0.05 vs shamgroup,**P＜0.01,***P＜0.001 vs shamgroup;#P＜0.05 vs model group,##P＜0.01 vs model group

與健側(cè)腦組織相比，缺血側(cè)腦組織出現(xiàn)明顯水腫（圖1-E）。與Sham組相比，I/R組大鼠的腦水腫程度顯著增加（P＜0.01）。給予不同劑量的馬賽替尼和依達(dá)拉奉后，腦水腫程度均得到了不同程度的減輕（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.01，P＜0.01）。

3.2 馬賽替尼對(duì)I/R模型大鼠腦組織損傷的影響

HE染色結(jié)果如圖2-A所示：Sham組大腦皮層神經(jīng)元基本正常，核居中，未見(jiàn)神經(jīng)元明顯變性、壞死及炎細(xì)胞浸潤(rùn)等病理學(xué)改變。I/R組大腦皮層神經(jīng)元均出現(xiàn)重度變性、壞死。神經(jīng)元數(shù)目明顯減少，神經(jīng)元結(jié)構(gòu)模糊、胞體腫脹，尼氏體減少或消失，出現(xiàn)不同程度的核固縮、核溶解。馬賽替尼各劑量組和依達(dá)拉奉組均能不同程度的減輕神經(jīng)元損傷，神經(jīng)元變性、壞死程度明顯減輕，炎細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少。

TUNEL染色結(jié)果如圖2-B所示：I/R損傷可引起大鼠缺血側(cè)皮層神經(jīng)元細(xì)胞發(fā)生凋亡，表現(xiàn)為TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞（棕黃色）數(shù)量明顯增加，Sham組大鼠皮層神經(jīng)元幾乎未見(jiàn)TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞。馬賽替尼各劑量組和依達(dá)拉奉組均能不同程度的減少TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量，其中馬賽替尼高劑量組作用最明顯。結(jié)果提示馬賽替尼可明顯減少I/R損傷引起的大鼠缺血側(cè)皮層神經(jīng)元細(xì)胞凋亡。

Figure2 Effects of masitinib on neuronal injury and apoptosis in ischemic cerebral cortexA:Cerebral sections were stained with hematoxylin and eosin and examined under light microscopeat 7 d after reperfusion;B:Representativemicropho?tographs of TUNEL staining in the ischemic cortex at 7 d after perfusion(Scale bar,20μm)

3.3 馬賽替尼對(duì)I/R模型大鼠腦組織中自噬水平的影響

采用Western blot法檢測(cè)自噬標(biāo)記物L(fēng)C3、Beclin-1和p62的蛋白水平。結(jié)果如圖3-A，3-B和3-D所示，I/R組大鼠腦組織中Beclin-1和LC3-I的表達(dá)顯著升高（P＜0.01，P＜0.01），且LC3-I向LC3-II的轉(zhuǎn)化增多；p62的表達(dá)降低（P＜0.01）。與I/R組相比，馬賽替尼中劑量和高劑量組均不同程度地降低了Beclin-1（P＜0.05，P＜0.01）和LC3-I的表達(dá)，抑制了LC3-I向LC3-II的轉(zhuǎn)化（P＜0.01，P＜0.01）；增加了p62的表達(dá)（P＜0.01，P＜0.01）。與蛋白表達(dá)的變化一致，給予馬賽替尼中劑量和高劑量后，p62的mRNA水平也顯著上調(diào)（P＜0.01，P＜0.01）（圖3-E）。

3.4 馬賽替尼對(duì)I/R模型大鼠腦組織中NF-κB信號(hào)通路的影響

結(jié)果如圖4所示，與Sham組相比，I/R組大鼠腦組織內(nèi)NF-κB蛋白和mRNA的表達(dá)明顯上調(diào)（P＜0.01，P＜0.01）；與I/R組相比，只有馬賽替尼高劑量組顯著抑制了I/R損傷后NF-κB蛋白和mRNA表達(dá)的上調(diào)（P＜0.01，P＜0.01）。此外，與Sham組相比，I/R組大鼠腦組織內(nèi)IκBα的表達(dá)顯著降低（P＜0.01），而p-IκBα的表達(dá)則明顯增加（P＜0.01）。與I/R組相比，不同劑量的馬賽替尼均能不同程度地逆轉(zhuǎn)I/R損傷后的上述變化，其中高劑量組作用最顯著（P＜0.01，P＜0.01）。

Figure 3 Effects of masitinib on autophagy in ischemic cerebral cortex after I/RA:Representative Western blots of LC3,Beclin-1 and p62 protein expression in ischemic cerebral cortex after I/R;B-D:Quantitation of the Western blot analysis for LC3,Beclin-1 and p62 compared with GAPDH;E:p62 mRNA expression was normalized to GAPDH level(xˉ±s,n=3)**P＜0.01 vs sham group;#P＜0.05 vs model group,##P＜0.01 vs model group

Figure4 Effectsof masitinib on autophagic cell apoptosisin ischemic cerebral cortex after I/RA:Representative Western blots of Bcl-2,Bcl-xl,Bax,Bad,Bid,caspase 8 and cleaved caspase 3 protein expression in ischemic cerebral cortex after I/R;B:Quantitation of the Western blot analysis for Bcl-2,Bcl-xl,Bax,Bad,Bid,caspase 8 and cleaved caspase3 compared with GAPDH(xˉ±s,n=3)**P＜0.01 vs sham group;#P＜0.05 vs model group,##P＜0.01 vs model group

3.5 馬賽替尼對(duì)I/R模型大鼠腦組織中凋亡水平的影響

如圖5所示，Western blot結(jié)果表明I/R損傷后，Bax、Bid、Bad、caspase 8和cleaved-caspase 3的表達(dá)顯著升高（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.01，P＜0.01，P＜0.01），而B(niǎo)cl-2和Bcl-xL的表達(dá)則明顯降低（P＜0.01，P＜0.01）。與I/R組相比，馬賽替尼高劑量組顯著逆轉(zhuǎn)了上述所有蛋白的變化（P＜0.01，P＜0.01，P＜0.05，P＜0.01，P＜0.01，P＜0.01，P＜0.01）。

4討論

腦缺血損傷可阻斷腦血流，導(dǎo)致缺血缺氧，進(jìn)而過(guò)度激活氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞死亡［8-9］。馬賽替尼最初被授權(quán)用于治療犬肥大細(xì)胞瘤［10］。最新研究指出，馬賽替尼能夠作為一種強(qiáng)的化學(xué)增敏劑，增加吉西他濱對(duì)人類胰腺癌的抗腫瘤作用［11］。然而，馬賽替尼在腦缺血中的作用卻鮮有研究。本研究旨在探討馬賽替尼對(duì)大鼠腦I/R損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制。

Figure 5 Effects of Masitinib on NF-κBsignalingpathway in ischemic cerebral cortex after I/RA:Representative Western blots of NF-κB,IκB and p-IκB protein expression in ischemic cerebral cortex after I/R;B-C:Quantitation of the Western blot and PCR analysis for NF-κB;D-E:Quantitation of the Western blot and PCR analysis for IκB;F:Quantitation of the Western blot analysis for p-IκB(xˉ±s,n=3)**P＜0.01 vs sham group;#P＜0.05 vs model group,##P＜0.01 vs model group

本研究結(jié)果顯示，I/R損傷可導(dǎo)致嚴(yán)重的神經(jīng)功能障礙，并伴有自噬的激活。給予馬賽替尼治療后，不僅能明顯降低模型組大鼠腦組織的梗死面積和腦含水量，而且能顯著改善神經(jīng)功能缺損。TUNEL染色結(jié)果表明，馬賽替尼能顯著抑制I/R損傷引起的神經(jīng)元凋亡。

近年來(lái)腦缺血后自噬的研究已成為國(guó)內(nèi)外關(guān)注的熱點(diǎn)［12-13］。在正常生理?xiàng)l件下，自噬被限制在基本水平范圍內(nèi)；但是在饑餓以及細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境變化的刺激下，自噬便被激活［14］。自噬相關(guān)蛋白Atg8，即微管相關(guān)蛋白輕鏈3（microtubule-associated protein light chain 3，LC3），是自噬體形成的唯一標(biāo)志物，LC3-I廣泛分布于細(xì)胞質(zhì)中，當(dāng)自噬發(fā)生形成自噬體后，胞漿型的LC3-I可以轉(zhuǎn)變成存在于自噬體膜上的脂質(zhì)型LC3-II，超微電鏡下觀察到自噬體是細(xì)胞自噬發(fā)生的鐵證，自噬體越多，LC3-II/（LC3-I+LC3-II）的比值越高，細(xì)胞自噬水平越高，LC3-II的生成是蛋白水平檢測(cè)自噬程度的金指標(biāo)［15］。自噬蛋白p62通過(guò)直接與LC3結(jié)合選擇性地并入自噬體中，并通過(guò)自噬有效降解。p62水平與自噬活動(dòng)呈負(fù)相關(guān)［16-17］。自噬另一相關(guān)蛋白是Beclin-1，Beclin-1是第一個(gè)被報(bào)道參與自噬啟動(dòng)環(huán)節(jié)的主要蛋白［18-20］。在本研究中，馬賽替尼顯著降低了LC3-II/I比值，下調(diào)了Beclin-1的表達(dá)，上調(diào)了p62的表達(dá)，表明馬賽替尼可能通過(guò)抑制自噬對(duì)I/R損傷起到神經(jīng)保護(hù)作用。

P62還可以通過(guò)鋅指結(jié)構(gòu)與調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的分子開(kāi)關(guān)RIP1結(jié)合形成信號(hào)復(fù)合物。近年來(lái)，研究表明p62/RIP1信號(hào)復(fù)合物可作為支架蛋白激活I(lǐng)KK，降解IκB，激活NF-κB信號(hào)通路［21］。NF-κB信號(hào)的激活是由κB激酶的上游激酶抑制劑介導(dǎo)的。許多刺激可激活I(lǐng)κB激酶，使IκB磷酸化，導(dǎo)致其泛素化和蛋白酶體降解。隨后，NF-κB進(jìn)入細(xì)胞核，誘導(dǎo)靶基因轉(zhuǎn)錄。因此，IκB為阻斷NF-κB通路提供了一種可能的途徑。特別是，“超級(jí)阻遏物”IκBα是IκB的一種抗降解形式，已被證明能阻斷NF-κB的活性［22］。在本研究中，馬賽替尼能夠顯著降低I/R損傷后NF-κB和p-IκBα的表達(dá)；增加IκBα的表達(dá)，提示NF-κB信號(hào)通路參與了馬賽替尼對(duì)腦缺血損傷的保護(hù)作用。

自從Beclin-1在自噬過(guò)程中被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，Beclin-1作為一種Bcl-2相互作用蛋白的新作用被注意到了［23-24］。Bcl-2或Bcl-xl可與Beclin-1結(jié)合以抑制自噬，而B(niǎo)eclin-1的敲除使哺乳動(dòng)物細(xì)胞對(duì)饑餓誘導(dǎo)的凋亡敏感［25］。一旦Beclin-1和Bcl-2或Bcl-xl之間的相互作用被破壞，Beclin-1將被釋放以促進(jìn)自噬［26-27］。先前的研究表明P62在細(xì)胞凋亡中起著信號(hào)傳導(dǎo)的核心作用［28］。作為對(duì)死亡受體刺激的反應(yīng)，基于Cullin3的泛素連接酶可以與誘導(dǎo)死亡的信號(hào)復(fù)合物結(jié)合并誘導(dǎo)caspase 8的多泛素化。當(dāng)用誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激或蛋白酶體抑制的試劑處理細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞可以直接通過(guò)caspase 8激活凋亡系統(tǒng)，而不涉及死亡受體信號(hào)。Caspase 8介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的新機(jī)制依賴于自噬相關(guān)蛋白LC3和P62［29-31］。因此，caspase 8除了在“經(jīng)典”外源性凋亡中作為一種典型的caspase物種外，還可以P62依賴的方式激活，并參與一種替代的內(nèi)源性凋亡途徑，特別是在由各種試劑或藥物誘導(dǎo)時(shí)。在本研究中發(fā)現(xiàn)馬西替尼可明顯降低缺血再灌注損傷后促凋亡蛋白Bid、Bax、Bad、caspase 8和切割caspase 3的表達(dá)，而增加Bcl-2和Bcl-xl的表達(dá)?；谝陨辖Y(jié)果，推測(cè)馬賽替尼可下調(diào)Beclin1和caspase 8的表達(dá)，推測(cè)馬賽替尼可能通過(guò)P62依賴的方式阻止Bcl-2與Beclin-1的分離，抑制capase 8的激活，從而抑制自噬和凋亡。

綜上所述，馬賽替尼減輕了缺血再灌注的神經(jīng)損傷作用，其作用機(jī)制可能是通過(guò)抑制過(guò)度自噬和凋亡發(fā)揮的。自噬參與了腦血管疾病的發(fā)生過(guò)程這一點(diǎn)毋庸置疑，但自噬在腦缺血損傷后的作用仍然是有爭(zhēng)議的。有的研究報(bào)道自噬在缺血/低氧性腦病發(fā)病機(jī)制中加重腦損傷，但也有報(bào)道在腦缺血后，自噬的激活減輕腦損傷，起到腦保護(hù)作用。關(guān)于自噬在缺血性腦損傷中呈現(xiàn)的相反作用，一方面推測(cè)這可能與實(shí)驗(yàn)中采用了不同的缺血再灌注時(shí)間、使用了非特異性的藥物或者方法有關(guān)；另一方面也進(jìn)一步提示自噬在腦缺血的病理生理機(jī)制中是一把“雙刃劍”。選擇合適的藥物，引導(dǎo)自噬在疾病中發(fā)揮積極作用，這將為腦血管疾病的治療開(kāi)啟新紀(jì)元。