CHIP對腎癌786-O細胞增殖的影響及機制研究

姜 舒 周鳳娟 陳 錚 李雪純 章龍珍 劉肖肖 渠德寶 辛 勇

腎細胞癌(renal cell carcinoma，RCC)，又稱腎癌，是一種起源于腎實質(zhì)尿路小管上皮系統(tǒng)的惡性腫瘤[1]。RCC是泌尿生殖系統(tǒng)排名第2位的惡性腫瘤，約占所有成人惡性腫瘤的3%，是泌尿系統(tǒng)腫瘤中病死率最高的腫瘤。盡管在過去的幾年里，隨著腎癌靶向治療藥物、免疫治療藥物的應用，腎癌的系統(tǒng)治療取得了許多進展[2]。但是，腎癌患者的高復發(fā)率仍然是世界范圍內(nèi)的一個巨大問題[3]。目前為止，對腎癌發(fā)生、發(fā)展的機制尚不清楚，因此，探索新的有效的生物學標志物對腎癌的早期診斷、靶向治療和預后判斷具有重要意義[4]。CHIP(C-terminus of heat shock protein 70-interacting protein)作為E3泛素連接酶，不僅可以調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的折疊和降解，還連接了伴侶蛋白和蛋白酶體系統(tǒng)，參與維持細胞質(zhì)中蛋白質(zhì)的穩(wěn)態(tài)[5]。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，CHIP在多種腫瘤中表達異常且在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展進程中發(fā)揮重要作用[6～10]。筆者團隊先前的研究表明，與正常的腎組織比較，腫瘤組織中CHIP表達降低，且CHIP的降低與TNM分期及預后不良高度相關(guān)[11]。然而，CHIP對腎癌細胞株的增殖作用及其機制尚不清楚。本研究首次在體外和體內(nèi)環(huán)境下初步探討CHIP對腎癌細胞增殖的影響，并對其機制進行了初步研究。

材料與方法

1.試劑與抗體：1640培養(yǎng)基購自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司，胎牛血清購自浙江天杭生物科技股份有限公司。CCK-8增強型溶液購自大連美侖生物技術(shù)有限公司，RTCA儀器購自安捷倫生物(杭州)有限公司，CHIP、AKT、磷酸化AKT(phospho-AKT，p-AKT)抗體購自美國CST公司，β-actin抗體購自美國Bioworld公司，p21抗體購自艾博抗(上海)貿(mào)易有限公司，所需引物購自蘇州金唯智生物科技有限公司，鼠/兔二步法檢測試劑盒及反應增強液購自中杉金橋生物科技有限公司。

2.細胞培養(yǎng)：腎細胞癌786-O細胞株購自美國ATCC公司。常規(guī)方法復蘇、重懸人腎細胞癌786-O細胞后至細胞培養(yǎng)皿中，用含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在細胞處于80%～90%融合時用0.25%胰酶細胞消化液進行傳代，取對數(shù)期的786-O細胞進行后續(xù)研究。

3.慢病毒轉(zhuǎn)染：LV3-NC(序列：5′-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3′)和LV3-human CHIP(序列：5′-GGGACGACATCCCCAGCGCTCT-3′)慢病毒載體購自蘇州吉瑪基因股份有限公司。待細胞處于30%～40%融合時進行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染前更換為新鮮無血清培養(yǎng)基，加入LV3-NC慢病毒載體(control組)和LV3-human CHIP慢病毒載體(CHIP組)，并根據(jù)病毒效價使感染復數(shù)(multiplicity of infection，MOI)為50，加入質(zhì)量濃度5mg/L的聚凝胺溶液(Polybrene)。干預12h后觀察細胞形態(tài)并更換新鮮含血清培養(yǎng)基，24h后嘌呤霉素1mg/ml篩選。2周后可篩選出穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系。

4.實時熒光定量聚合酶鏈式反應(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)檢測：收集轉(zhuǎn)染后的兩組細胞，利用Trizol試劑裂解并提取細胞中總RNA，以分光光度計對提取RNA的純度和濃度進行鑒定。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行加樣和擴增，將RNA反轉(zhuǎn)錄成第一鏈模板DNA，并以18S為內(nèi)參基因，實行RT-qPCR檢測。反應體系包括2×UltraSYBR mixture 10μl、模板DNA 2μl、上下游引物混合液0.8μl、ddH2O 7.2μl。反應程序：95℃預變性30s，95℃變性5s、60℃ 退火34s共40個循環(huán)，95℃延伸15s、60℃退火60s、95℃延伸15s。采用相對表達量2-△△CT法分別計算各組細胞中CHIP mRNA相對表達量。CHIP上游引物序列為5′-AGCAGGGCAATCGTCTGTTC-3′，下游引物序列為5′-CAAGGCCCGGTTGGTGTAATA-3′。

5.Western blot法檢測：轉(zhuǎn)染后兩組細胞以胰酶消化，離心收集細胞，提取各組細胞中總蛋白，測定蛋白濃度。取30μl蛋白進行加樣，行10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)，隨后轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(polyvinylidene fluoride, PVDF)膜。在5%脫脂奶粉的封閉液中封閉2h。分別加入相應一抗(一抗按照使用說明書進行稀釋)，4℃過夜后加入相應的二抗，室溫下孵育1h。以β-actin為內(nèi)參蛋白，天能5200化學發(fā)光式分析儀拍照儲存。

6.CCK-8測定：常規(guī)培養(yǎng)兩組細胞,消化、計數(shù)、傳入96孔板中，每孔接種量為3000個，每組樣品設6個復孔，用含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，在第0、24、48、72h移去培養(yǎng)基，加入100μl的1640(不含血清)培養(yǎng)基及10μl的CCK-8，置于37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱孵育1h，于450nm波長下檢測吸光度(A)值，分別檢測，繪制折線圖。

7.RTCA測定：常規(guī)培養(yǎng)兩組細胞，消化、計數(shù)、傳入RTCA檢測板中，每孔接種量為3000個，每組樣品設4個復孔，用含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱孵育，板放入RTCA儀中，設定好參數(shù)，測定細胞指數(shù)(cell index，CI)值，連續(xù)檢測100h。

8.裸鼠模型建立和體內(nèi)實驗：實驗操作和動物飼養(yǎng)均嚴格按照實驗動物倫理規(guī)定進行。所用實驗動物均為BALB/c雌性裸鼠，4周齡，共7只，購自上海南方模式生物科技發(fā)展有限公司。制備control組和CHIP組細胞懸液，用PBS稀釋成1.0×107個/毫升。于每只裸鼠背側(cè)皮下注射100μl的含1.0×106個細胞的細胞懸液，左側(cè)為control組，右側(cè)為CHIP組。于注射后第10天開始每3天測量1次體積，體積計算公式為：體積(mm3)=(長×寬2)/2，并繪制腫瘤體積生長曲線圖。于注射后第39天處理裸鼠，稱量皮下瘤的重量，并繪制對比圖。

9.免疫組織化學法檢測：注射細胞39天后，取裸鼠皮下瘤組織，將組織固定在4%多聚甲醛中，包埋在石蠟中，然后切成4μm切片。將切片放至二甲苯中脫蠟，再經(jīng)梯度乙醇脫水，在切片組織上滴加過氧化物酶阻斷劑，10min后將切片浸入抗原修復液，加熱至沸騰后置入水浴鍋恒溫95℃，進行抗原修復。在濕盒中滴加山羊血清封閉，1h后，將滴在切片組織上，4℃孵育過夜。在切片組織上滴加反應增強液，20min后滴加增強酶標山羊抗鼠/兔IgG聚合物，DAB顯色，顯微鏡下觀察并及時中止顯色。蘇木精染核、脫水、封片。顯微鏡下觀察拍照，所有部分均以×10、×40的放大倍數(shù)拍攝。

結(jié) 果

1.構(gòu)建敲除CHIP 的人腎癌786-O穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞：兩組人腎癌786-O細胞分別轉(zhuǎn)染LV3-NC慢病毒載體(control組)和LV3-human CHIP慢病毒載體(CHIP組)后，實時定量PCR法檢測CHIP的表達情況。control組和CHIP組中CHIP mRNA的相對表達量分別為0.9721±0.0739和0.2620±0.0130。與control組比較，CHIP組786-O細胞中CHIP mRNA的表達水平被顯著抑制，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，圖1A)。Western blot法檢測結(jié)果也顯示，CHIP組細胞中CHIP蛋白的表達水平被明顯抑制(圖1B)。以上結(jié)果均顯示穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞構(gòu)建成功。

圖1 人腎癌786-O穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞構(gòu)建成功

2.干擾CHIP后可增強腎癌786-O細胞的增殖能力：為了探索CHIP對腎癌細胞增殖的影響，筆者對兩組細胞分別采用了CCK-8法檢測。結(jié)果顯示，CHIP組細胞在24、48和 72h時的A值均明顯高于control組(0.5120±0.0870 vs 0.3717±0.0573,1.5352±0.1718 vs 1.0970±0.1042,2.9907±0.2350 vs 2.0867±0.2034)，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05，圖2A)。RTCA檢測結(jié)果也顯示，CHIP組細胞的CI值明顯高于control組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，圖2B)。體外實驗表明，降低CHIP表達后可顯著促進腎癌786-O細胞的增殖能力。

圖2 干擾CHIP后可增強腎癌786-O細胞的增殖能力

3.CHIP通過AKT/p21通路抑制腎癌細胞增殖：Western blot法檢測結(jié)果顯示，與control組比較，下調(diào)CHIP表達后腎癌786-O細胞中AKT蛋白表達量差異無統(tǒng)計學意義，但p-AKT蛋白表達量明顯升高，同時p21的蛋白表達量明顯降低(圖3)。根據(jù)Western blot法檢測結(jié)果推測，下調(diào)CHIP表達可激活AKT的磷酸化，提高p-AKT的表達，下調(diào)p21的表達，從而促進腎癌細胞的增殖。

圖3 轉(zhuǎn)染LV3-NC和LV3-human CHIP慢病毒后細胞中AKT、p-AKT、p21的表達

4.下調(diào)CHIP可促進腎癌786-O細胞移植瘤的增長：為了在體內(nèi)進一步探究CHIP對腎癌增殖的影響，筆者在小鼠皮下分別注射control組和CHIP組腎癌786-O細胞，從而建立裸鼠異種移植模型。實驗過程中，兩組裸鼠飲食及精神狀態(tài)未見明顯異常。接種39天后處理裸鼠(圖4A)，筆者發(fā)現(xiàn) CHIP組的裸鼠異種皮下瘤平均重量顯著大于control組(139.5857±34.0073mg vs 75.7021±17.5720mg)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，圖4B)。與control組比較，CHIP組的腫瘤體積明顯升高(205.659±34.633mm3vs 401.000±65.118mm3)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，圖4C)。

圖4 下調(diào)CHIP可促進腎癌786-O細胞移植瘤的增長

5.CHIP通過AKT/p21抑制裸鼠皮下瘤的增殖：CHIP和p-AKT普遍存在于細胞質(zhì)中，少量存在于細胞核中。p21大多位于細胞核中，少量存在于細胞質(zhì)中。為了進一步研究體內(nèi)CHIP對AKT/p21通路的影響，筆者采用免疫組化檢測了小鼠腫瘤組織中CHIP、p21及p-AKT。結(jié)果顯示，CHIP組CHIP、p21兩種蛋白表達明顯降低，而p-AKT表達則明顯升高(圖5)。這些結(jié)果表明，干擾CHIP可以促進異種移植瘤的生長，且很可能通過AKT/p21通路發(fā)揮這一作用。

圖5 鏡下觀察兩組裸鼠皮下瘤組織中CHIP、p-AKT、p21的表達

討 論

腎癌發(fā)生率和病死率正以每10年2%～3%的速度持續(xù)上升，其復發(fā)率高，轉(zhuǎn)移率高，5年相對生存率很低[12～15]。目前對腎癌的發(fā)生、發(fā)展認識仍然有限，因此進一步明確腎癌增殖的分子機制并尋找新的生物靶點成為亟待解決的問題。CHIP又稱為STUB1(STIP1 homology and U-box containing protein 1)，近年來在腫瘤研究領(lǐng)域也引起了廣泛的關(guān)注。大量研究表明，CHIP與其相關(guān)靶蛋白(例如c-Myc、AKT、Smad、p53、p21、PTEN等)結(jié)合后可以調(diào)控腫瘤生長進程[16]。研究發(fā)現(xiàn)，CHIP對腎癌細胞的遷移、侵襲和血管生成有負性調(diào)節(jié)作用。本研究首次探索并證實，體內(nèi)體外環(huán)境下，干擾CHIP后腎癌細胞的增殖能力明顯增強，這也表明CHIP的表達在抑制腫瘤發(fā)展中發(fā)揮重要作用。

筆者團隊前期研究發(fā)現(xiàn)，腎腫瘤組織中CHIP的表達明顯降低，且與TNM分期及預后不良呈正相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，無論在體內(nèi)環(huán)境還是體外環(huán)境，干擾CHIP表達后，腎癌786-O細胞增殖與成瘤能力明顯增強。Luan等[6]研究發(fā)現(xiàn)，上調(diào)CHIP表達后乳腺腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移被明顯抑制，并且CHIP還可以抑制H358肺癌細胞的生長和侵襲[7]。此外，在泌尿系統(tǒng)及消化系統(tǒng)等常見腫瘤中也均證實CHIP表達可以抑制腫瘤細胞的增殖[8,9]。這些結(jié)果均與筆者的結(jié)果一致，這也說明CHIP表達的降低，加劇了腫瘤的惡性程度。

本研究采用慢病毒轉(zhuǎn)染構(gòu)建CHIP低表達腎癌細胞株。慢病毒轉(zhuǎn)染是將轉(zhuǎn)基因傳遞到哺乳動物細胞的一種有效方法，它將瞬轉(zhuǎn)的易用性、速度與穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞的穩(wěn)定表達相結(jié)合[17]。實驗中可以通過增加MOI值及使用轉(zhuǎn)染增強劑如polybrene提高轉(zhuǎn)染效率，且polybrene是使用最廣泛的試劑[18]。此外，筆者還同時使用CCK8法及RTCA法檢測腎癌細胞的增殖能力，相比較CCK8法，RTCA操作簡單，全自動，可以長時間動態(tài)檢測，中途不需要添加任何試劑及其他步驟，減少實驗外因素干擾。

綜上所述，AKT信號通路在多種不同的癌種中激活，在調(diào)節(jié)腫瘤增殖方面起著重要的作用[19]。p21是最重要的細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑，p21的過表達可以阻止細胞進入S期[20]。筆者通過體內(nèi)外實驗發(fā)現(xiàn)，沉默CHIP的表達可以通過增加AKT的磷酸化水平，激活AKT/p21通路，從而促進腎癌細胞增殖。結(jié)合先前的研究，筆者推斷CHIP或可成為腎癌細胞增殖的重要生物學靶點，為腎癌的預后及診療提出新的治療策略。