HPV16-E6、E7 蛋白在宮頸癌組織中的表達(dá)與病理特征的相關(guān)性

阮立通，邵志葉，錢鋼

宮頸癌（CC）是危害我國女性健康的主要婦科疾病，是第二大惡性腫瘤疾病[1]。近年來，宮頸病變、宮頸癌與人乳頭瘤病毒（HPV）感染間存在緊密關(guān)聯(lián)已成為學(xué)界共識[1-3]。其中高危型HPV（HRHPV）感染更是宮頸癌的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，HPV-16 為感染率較高的HR-HPV亞型，其入侵人體后可導(dǎo)致正常細(xì)胞化生，同時(shí)其可刺激相關(guān)致癌基因生成 HPV16-E6、HPV16-E7 致癌蛋白，引起機(jī)體細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白（CCRP）功能、表達(dá)水平異常，增加感染者宮頸癌變風(fēng)險(xiǎn)。隨著醫(yī)學(xué)檢測技術(shù)及設(shè)備的發(fā)展，HPV16-E6及E7 蛋白的臨床檢測成為可能，通過對E6、E7 癌蛋白的表達(dá)水平與宮頸疾病間的相關(guān)性進(jìn)行分析總結(jié)，以得出科學(xué)有效的診療、防控方案對臨床宮頸疾病患者而言具有重要意義[3]。現(xiàn)階段關(guān)于E6、E7 癌蛋白在宮頸疾病中的作用機(jī)制尚不完全明確，本研究探討HPV16-E6 及E7 蛋白與宮頸病變、宮頸癌的相關(guān)性，以期為臨床提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2018 年10 月至2020 年 1 月浙江省慈溪市婦幼保健院147 例宮頸疾病患者，根據(jù)病理學(xué)檢查結(jié)果，將 56 例 CC 患者設(shè)為 A 組，43 例高度鱗狀上皮內(nèi)病變（HSIL）患者設(shè)為B組，48 例低度鱗狀上皮內(nèi)病變（LSIL）患者設(shè)為C 組。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）A 組符合FIGO《2018 癌癥報(bào)告：宮頸癌新分期及診治指南》[4]中 CC 診斷標(biāo)準(zhǔn)；（2）B、C 組患者符合《宮頸癌及癌前病變規(guī)范化診療指南》[5]中 CIN 診斷標(biāo)準(zhǔn)；（3）均經(jīng)陰道鏡下活檢證實(shí)；（4）基本生命體征穩(wěn)定，肢體挪動(dòng)、5 m 內(nèi)行走等基本活動(dòng)無礙；（5）自愿簽署知情告知書。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并嚴(yán)重心、肝、腎等臟器功能損傷或嚴(yán)重水電解質(zhì)紊亂、急性感染、機(jī)械性損傷、血液系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病，可能對本研究造成干擾者；（2）存在嚴(yán)重意識障礙、情感障礙或精神病史，無法配合基本研究調(diào)查者。其中A 組年齡35 ～76 歲，平均（43.4±4.3）歲；體質(zhì)量指數(shù)（BMI）18 ～27 kg/m2，平均（23.16±3.34）kg/m2；FIGO 分期：Ⅰ期 20 例，Ⅱ期 23例，Ⅲ期 13 例；鱗癌 37 例，腺癌 19 例。B組年齡36～75歲，平均（44.2±4.2）歲；BMI 18 ～ 26 kg/m2，平均（23.25±3.28）kg/m2；CIN Ⅱ期 29 例，CIN Ⅲ期 14 例。C組年齡33～76歲，平均（43.6±4.3）歲；BMI 19 ～ 27 kg/m2，平均（23.43±3.35）kg/m2；均為CINⅠ期。本研究經(jīng)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，3 組一般資料差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞ 0.05），有可比性。

1.2 方法 檢查前3 d 應(yīng)禁止性生活，檢查期間避開經(jīng)期，采用電子陰道鏡，擴(kuò)陰并充分暴露宮頸后將探頭置入受檢者陰道內(nèi)，對子宮頸形態(tài)、顏色、有無贅生物等進(jìn)行詳細(xì)檢查，采集受檢者病理組織樣本用于相關(guān)蛋白測定及病理學(xué)檢查，本研究以病理學(xué)檢查結(jié)果作為診斷“金標(biāo)準(zhǔn)”。

HPV16-E6 及 E7 蛋白檢測：以免疫組化染色法（SP）染色，將病理組織樣本制作成石蠟切片，行脫蠟至水操作后于25℃溫度下以0.3% 濃度過氧化氫溶液浸泡10 ～15 min，以蒸餾水清洗后進(jìn)行熱抗原修復(fù)，而后于磷酸緩沖鹽溶液（PBS）中反復(fù)清洗3 次，滴加5%濃度牛血清白蛋白（BSA）后于25℃溫度下孵育15 min，加入一抗稀釋液（Leica Biosystems Newcastle Ltd，500 ml）后于 4℃溫度下放置過夜；次日取出組織樣本于25℃溫度下放置30 min 后以PBS 清洗3 次，加入D-生物素（西寶生物科技，5 g）以標(biāo)記二抗稀釋液（Leica Biosystems Newcastle Ltd，100 ml）后于 37℃溫度下孵育30 min，以PBS 清洗 3 次，加入鏈霉親和素（陜西新研博美生物科技，5ml）復(fù)合體后于37 ℃溫度下孵育20 min，以 PBS 清洗 3 次，以 DAB 染色液（上海歌凡生物科技，100 ml）初染，以蘇木素染色液（上海歌凡生物科技，100 ml）復(fù)染，脫水、透明處理后封片；置于顯微鏡下觀察染色情況并控制反應(yīng)進(jìn)度，再次染色、脫水、透明處理后封片。分別以已知CC 病例、PBS 替代一抗做陽性、陰性對照，于光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)呈棕色的細(xì)胞數(shù)量，染色細(xì)胞數(shù)＞10%即為陽性。

1.3 觀察指標(biāo) 對比3 組 HPV16-E6、E7 蛋白陽性率；記錄A 組臨床資料，包括淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤最大徑、臨床分期、病理類型、宮旁浸潤等病理特征。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法 采用SPSS 22.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料分別平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用t 檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用2檢驗(yàn)；相關(guān)性分析采用 Pearson 相關(guān)分析。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3 組 HPV16-E6、E7 蛋白陽性率比較 A組HPV16-E6、E7 蛋白陽性率高于B 組、C 組（2≥26.184，均 P ＜ 0.05）；B組HPV16-E6、E7 蛋白陽性率高于C 組（2=23.843/35.707，均P＜ 0.05），見表 1。

2.2 HPV16-E6、E7 蛋白陽性與宮頸癌病理特征的相關(guān)性 HPV16-E6、E7 蛋白陽性率與CC 患者年齡、腫瘤最大徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織學(xué)分級間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），與臨床分期、宮旁浸潤、病理類型間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P ＜ 0.05），見表 2。

2.3 HPV16-E6 陽性與 HPV16-E7 陽性的相關(guān)性 CC 患者HPV16-E6 陽性與HPV16-E7 陽性呈正相關(guān)（r=0.542，P ＜0.05），見表 3。

3 討論

CC屬于上皮腫瘤，是臨床常見的女性惡性腫瘤，發(fā)病機(jī)制尚未明確，研究證實(shí)其或由慢性宮頸炎癥、宮頸腫瘤在環(huán)境、遺傳、病理性因素等多因素作用下發(fā)展而來。近年來，越來越多研究[6-7]證實(shí)了宮頸病變與HPV 感染間存在關(guān)聯(lián)性，CC 患者中HPV 感染率更是高達(dá)90%。由于宮頸病變與HPV 間的密切關(guān)聯(lián)，臨床預(yù)防宮頸癌等宮頸病變主要以預(yù)防HPV 感染為主，雖然目前已有效果良好的HPV 感染預(yù)防疫苗，但現(xiàn)階段HPV疫苗較稀缺且價(jià)格較昂貴，難以滿足廣大女性的接種需求。盡管疫苗防治在短期內(nèi)難以實(shí)現(xiàn)，但隨著基因診斷技術(shù)與設(shè)備的不斷進(jìn)步，方便快捷的HPV 基因檢測已逐漸應(yīng)用于各大醫(yī)院，有助于臨床對CC、宮頸病變與HPV 感染間的關(guān)聯(lián)性作進(jìn)一步研究。HPV16 是臨床感染率較高的HR-HPV 亞型之一，當(dāng)HPV16侵入人體后可激活、刺激HPV16E6 等相關(guān)癌基因合成E6、E7 致癌蛋白，HPV16-E6、HPV16-E7 蛋白可與 CCRP 特異性結(jié)合進(jìn)而影響人體細(xì)胞調(diào)節(jié)周期異常，使細(xì)胞分化增殖、分化進(jìn)程發(fā)生變化，進(jìn)而增加女性感染者CC 發(fā)生概率。

表13 組 HPV16-E6、E7 蛋白陽性率對比 例（%）

CC 患者卵巢功能遭到損害時(shí)垂體會(huì)反饋性的分泌促卵泡激素（FSH），在FSH 與 HPV16-E6、HPV16-E7 蛋白的多重作用下，患者機(jī)體內(nèi)多種細(xì)胞因子的表達(dá)水平結(jié)皆可出現(xiàn)異常[8]。如HPV16-E6蛋白可促進(jìn)血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）的分泌合成，VEGF 可誘導(dǎo)血管新生，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞分化、增生及浸潤，進(jìn)而增加CC 患者癌細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)。本研究中CC患者HPV16-E6、E7 蛋白陽性率高于 HSIL、LSIL 患者，而 HSIL 患者HPV16-E6、E7 蛋白陽性率高于 LSIL 患者，與岳晚俠等[9]結(jié)果對應(yīng)。表明HPV16-E6、E7 蛋白陽性或與患者宮頸病變程度有關(guān)，患者宮頸病變程度越高、宮頸損傷越嚴(yán)重則組織中HPV16-E6、E7 蛋白表達(dá)水平越高，這或是由于HPV16-E7 蛋白可影響人體關(guān)鍵抑癌基因-P53 基因的信號轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而使其對細(xì)胞增殖的抑制功能減弱，隨著患者宮頸病變程度的提高，P53 基因的抑癌功能則逐漸喪失，進(jìn)而引發(fā)CC。本研究結(jié)果中HPV16-E6、E7 蛋白陽性率與臨床分期、宮旁浸潤、病理類型間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，也佐證了這一觀點(diǎn)。本研究還顯示，CC 患者HPV16-E6 陽性與 HPV16-E7 陽性呈正相關(guān)，這表明 HPV16-E6、HPV16-E7 蛋白表達(dá)可相互促進(jìn)。這可能是由于 H PV16-E6 蛋白可增加外源性DNA 整合、誘變進(jìn)程及風(fēng)險(xiǎn)，還可引起端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（TERT）的mRNA 水平上升，導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)正常細(xì)胞永生化，影響細(xì)胞周期調(diào)節(jié)；而HPV16-E7 蛋白22 ～226 位氨基酸為人體重要細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子-成視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白（PRB）的結(jié)合位點(diǎn)，在HPV16-E7 蛋白作用下可使細(xì)胞周期調(diào)控異常。

表3 CC 患者HPV16-E6 陽性與HPV16-E7 陽性的相關(guān)性