CYP450 酶內(nèi)源性生物標(biāo)志物的研究進(jìn)展*

莫錦靈，應(yīng)玉雯，沈 葉，王敦建，孫魯寧**，王永慶**

1 南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 臨床藥理研究室，南京 210029；2 南京醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，南京 210029

藥物的有效性和安全性與其在體內(nèi)的吸收、分布、代謝和排泄有關(guān)，而細(xì)胞色素P450（Cytochrome P450，CYP450）酶參與80%～90%藥物的Ⅰ相代謝[1]。因此，希望通過檢測CYP450 酶活性，了解藥物的體內(nèi)代謝過程，預(yù)測藥物療效和不良反應(yīng)。CYP450 酶的活性受到多種因素的影響[2]，包括基因、性別、年齡、疾病等，不同個體間代謝酶的活性可能有較大差異，如CYP2C19 不同突變體會造成個體間的藥物代謝差異[3]，因此需要密切關(guān)注代謝酶的活性。外源性探針廣泛用于臨床試驗中CYP450 酶活性的測定[2]，這種方法需要受試者服用探針?biāo)幬铮ㄈ鐧z測CYP3A 活性需口服咪達(dá)唑侖[4]），同時采集受試者血樣以測定血藥濃度。但以非治療為目的且需要頻繁地采血，在特殊人群（如小兒、孕婦、老人等）中應(yīng)用存在著困難[5]。CYP450 酶參與機(jī)體內(nèi)源性化合物的代謝，如膽固醇、脂肪酸等，部分內(nèi)源性物質(zhì)可作為測定CYP450 酶活性的生物標(biāo)志物[2]。內(nèi)源性內(nèi)源性生物標(biāo)志物用于評價CYP450酶活性不借助外源性探針?biāo)幬铮媚承﹥?nèi)源性物質(zhì)及其代謝物的水平變化來反映酶的變化，具有更好的依從性[4]。本文匯總了CYP1A2、CYP2A6、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1 和CYP3A 6 種重要CYP450 酶亞型內(nèi)源性生物標(biāo)志物的研究進(jìn)展。

1 對主要CYP450 酶內(nèi)源性生物標(biāo)志物的分析

2.1 人體內(nèi)的CYP450

藥物代謝發(fā)生在肝臟、小腸、腎等組織中，肝臟是代謝的主要器官，其微粒體酶活性最強(qiáng)。其中最重要的氧化酶因其在還原狀態(tài)下可與CO 結(jié)合，在波長450 nm 處有一最大吸收峰，故認(rèn)為是細(xì)胞色素P450 酶[6]。位于肝臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體內(nèi)膜上的CYP450 是參與藥物Ⅰ相代謝的關(guān)鍵酶，經(jīng)酶催化的氧化反應(yīng)是藥物體內(nèi)代謝的主要途徑。CYP450 參與了許多內(nèi)源性物質(zhì)如脂肪酸、花生四烯酸的代謝過程和外源性化合物如藥物、環(huán)境中污染物的處置過程[7]。

CYP450 酶是一個參與編碼500 多種酶蛋白的超家族[8]。其可按氨基酸的序列分類，同一家族的氨基酸序列有40%相似性，同一亞家族相似性超過55%[7]。在人肝微粒體中參與藥物代謝的CYP450 酶主要有CYP1A、CYP2C、CYP2D、CYP2E、CYP3A 五大類，它們占肝臟中CYP450 酶總含量＞75%。

1.2 CYP1A2 的內(nèi)源性生物標(biāo)志物

CYP1A2 約占CYP450 酶總量的13%，僅次于CYP3A 和CYP2C[9]。CYP1A2 參與咖啡因、硝苯地平、華法林、普萘洛爾等多種外源性藥物的代謝，也負(fù)責(zé)部分內(nèi)源性激素的羥化反應(yīng)，除此之外，CYP1A2 也參與一些前致癌物（黃曲霉毒素、亞硝胺等）在體內(nèi)的活化過程[9]。測定CYP1A2 活性的外源性探針?biāo)幬镏饕强Х纫騕10]，內(nèi)源性生物標(biāo)志物主要有褪黑素（melatonin）及其6-羥基化代謝物（6-hydroxymelatonin）[4]。在體外肝微粒體模型研究中發(fā)現(xiàn)，褪黑素通過CYP1A1、CYP1A2 及CYP1B1 代謝生成6-羥基褪黑激素，其中CYP1A2 為肝內(nèi)主要代謝酶[4]。Wang 和Hiemke 通過高效液相色譜結(jié)合電化學(xué)檢測法，發(fā)現(xiàn)褪黑素主要代謝為6-羥基化代謝物和N-乙酰羥色胺（N-acetylserotonin，NAS），添加CYP1A2的特異性抑制劑呋拉茶堿后，僅檢測到少量NAS，推測6-羥基代謝物是經(jīng)CYP1A2 代謝[11]，理論上褪黑素及其6-羥基化代謝物可作為檢測CYP1A2 活性的內(nèi)源性生物標(biāo)志物。

目前檢測人體中褪黑素的方法有高效液相色譜法（HPLC）、高效液相色譜-質(zhì)譜法（HPLC-MS/MS）[12]和酶免疫檢測法（ELISA）[2]。有研究利用生物免疫法測定血清褪黑素的藥時曲線下面積（AUC）[4]，分別測定受試者吸煙（增加CYP1A2的活性）前后外源性和內(nèi)源性血漿褪黑素水平變化，結(jié)果外源性血漿褪黑素水平在吸煙后顯著降低，而內(nèi)源性血漿褪黑素水平未受到顯著影響?，F(xiàn)有研究將外源性褪黑素作為CYP1A2 探針，但因其缺乏相關(guān)理論，還存在爭議。研究[4]表明，咖啡因的清除率與內(nèi)源性血清褪黑素AUC 值不存在顯著的相關(guān)性，而在人體內(nèi)咖啡因清除率的90%以上由CYP1A2 介導(dǎo)[13]，產(chǎn)生這些結(jié)果的原因可能是內(nèi)源性褪黑素的含量不僅與CYP1A2 代謝有關(guān)，還與褪黑素的重新分泌有關(guān)，褪黑素的分泌作用掩蓋了它的含量變化。因此，使用內(nèi)源性褪黑素作為CYP1A2 的探針，應(yīng)選擇合適的指標(biāo)，如排除褪黑素分泌晝夜節(jié)律的影響[2]。

1.3 CYP2A6 酶的內(nèi)源性生物標(biāo)志物

CYP2A6 廣泛參與藥物的代謝，如依非韋倫、來曲唑等，同時也能將許多致癌前體化合物代謝為強(qiáng)致癌物，如將煙草中大量的亞硝胺致癌前體化合物代謝為亞硝基亞甲胺[14]。CYP2A6 的外源性探針主要是香豆素[15]。吸煙者體內(nèi)含有尼古丁，尼古丁經(jīng)CYP2A6 的代謝產(chǎn)物可替寧（cotinine，COT）和反式-3'-羥基可替寧（trans-3'-hydroxycotinine，3HC）可作為表征CYP2A6 酶活性的內(nèi)源性標(biāo)志物。

以內(nèi)源性生物標(biāo)志物評價酶活性的方法有COT/尼古丁和3HC/COT 的比值（C3HC/CCOT）。由于尼古丁的半衰期（2 h）比COT 的半衰期（16 h）低得多[16]，若考慮使用COT/尼古丁的比值評價CYP2A6 的活性，CYP2A6 活性結(jié)果取決于最后一次接觸尼古丁的時間，需要提前較長時間禁止受試者接觸尼古丁，使體內(nèi)COT 被完全代謝；若使用C3HC/CCOT評價CYP2A6的活性，3HC 由COT 產(chǎn)生，半衰期較短（6 h），C3HC/CCOT與COT的半衰期相關(guān)，與COT/尼古丁的比值相比，以C3HC/CCOT作為內(nèi)源性生物標(biāo)志物評價更加穩(wěn)定。Dempsey D 等[17]研究表明，唾液和血漿中C3HC/CCOT與尼古丁口服清除率有顯著的相關(guān)性，而尼古丁代謝的主要指標(biāo)是尼古丁的口服清除率，表明C3HC/CCOT與尼古丁的代謝有高度相關(guān)性，進(jìn)而證實C3HC/CCOT是表征吸煙者CYP2A6 活性的可靠內(nèi)源性生物標(biāo)志物。測定3HC 和COT 濃度的主要方法為GC-MS 和HPLC-MS/MS[17]。

以C3HC/CCOT評價CYP2A6 活性的方法在臨床上已有了應(yīng)用，如Lerman C 等[18]通過測定C3HC/CCOT預(yù)測了尼古丁經(jīng)皮治療戒煙的有效性，在C3HC/CCOT低的患者中有46%的人戒煙成功，而在比值高的患者中僅有28%的人戒煙成功，C3HC/CCOT與戒煙效果有顯著的相關(guān)性，CYP2A6 快代謝患者比慢代謝患者的戒煙效果較差，表明C3HC/CCOT對預(yù)測尼古丁經(jīng)皮治療的戒煙成功率有著重要臨床意義。

1.4 CYP2C19 酶的內(nèi)源性生物標(biāo)志物

經(jīng)CYP2C19 代謝的藥物占CYP450 酶代謝的2%，臨床上參與代謝有許多重要藥物，如奧美拉唑、氯匹格雷等[4]。CYP2C19 的外源性探針主要有奧美拉唑、美芬妥英[10]，內(nèi)源性生物標(biāo)志物還在研究中，研究方向主要是花生四烯酸（AA）。

花生四烯酸可被所有CYP450 酶代謝，但經(jīng)CYP2C19代謝的代謝率最高，生成4 種環(huán)氧三烯酸（epoxyeicosatrienoic acids，EETs）和11 種羥基花生四烯酸（hydroxyeicosatetraenoic acids，HETEs）[19]。研究認(rèn)為，EETs 可代謝生成碳三烯酸（dihydroxyeicosatrienoic acids，DHETs），其 中11，12-DHET 和14，15-DHET 是EET 占比最大的代謝產(chǎn)物。為證明CYP2C19 活性與EET 水平呈正相關(guān)[20]，Akasaka T 等[21]測定了不同CYP2C19 活性的血清樣本中11，12-和14，15-DHETs 的濃度，用來替代EET 水平，發(fā)現(xiàn)CYP2C19慢代謝受試者的血清11，12-和14，15-DHETs 水平顯著低于快代謝受試者，檢測DHET 的方法主要有酶聯(lián)免疫法[21]。

但DHET 并非EETs 經(jīng)CYP2C19 代謝的直接產(chǎn)物，是EET經(jīng)可溶性環(huán)氧化物水解酶生成的代謝產(chǎn)物[20]，其濃度受到該水解酶影響，故無法利用血清11，12-和14，15-DHETs 水平代替EET 水平評價CYP2C19 的活性。未來需要直接研究AA 的代謝產(chǎn)物EETs、HETE 的水平與CYP2C19 活性的關(guān)系，以驗證AA 是評價CYP2C19 活性的內(nèi)源性生物標(biāo)志物。

1.5 CYP2D6 酶的內(nèi)源性生物標(biāo)志物

CYP2D6 存在于肝臟、心臟和腦組織中，參與約25%藥物的代謝，如阿片類藥、抗精神病藥、抗抑郁藥等[22]。CYP2D6 的外源性探針有右美沙芬[22]，內(nèi)源性生物標(biāo)志物有5-甲氧基色胺（5-methoxytryptamine，5-MT）/5-羥色胺（serotonin，5-HT）和松香烴（pinoline，PIN）/6-羥基-1，2，3，4-四氫化-β-咔啉（6-hydroxy-1，2，3，4-tetrahydro-beta-carboline，6-OHTHBC）。

5-MT 是一種微量的內(nèi)源性吲哚胺類，Yu AM 等[23]發(fā)現(xiàn)5-HT 是唯一經(jīng)CYP2D6 介導(dǎo)的5-MT 的代謝物。之后Kirchheiner J 等[24]測定了經(jīng)不同活性CYP2D6 代謝后血小板中5-HT 的濃度，結(jié)果顯示，CYP2D6 活性高的受試者體內(nèi)5-HT 的含量顯著高于CYP2D6 活性低的受試者，提示5-MT/5-HT 可能是測定CYP2D6 活性的內(nèi)源性生物標(biāo)志物。但5-HT 的半衰期較長（大于3 天）[4]，可能會因代謝不及時而不能準(zhǔn)確反映CYP2D6 的活性，研究發(fā)現(xiàn)，受試者服用CYP2D6 抑制劑24 h 后體內(nèi)5-HT 含量無明顯變化[24]。因此，需要進(jìn)一步的臨床研究來驗證5-MT/5-HT 能否作為內(nèi)源性生物標(biāo)志物、以反映CYP2D6 的活性[4]。

PIN 是一種存在于哺乳動物大腦和組織中的內(nèi)源性化合物[24]，經(jīng)CYP2D6 特異性地發(fā)生O-去甲基化代謝為6-OH-THBC。Jiang XL 等[25]發(fā)現(xiàn)，在人肝微粒體 中，加入8 種代謝酶抑制劑后，只有奎尼?。–YP2D6 抑制劑）對PIN 的O-去甲基化反應(yīng)有明顯的抑制作用，并在注射PIN 后，野生型小鼠體內(nèi)的PIN/6-OH-THBC 值（0.29±0.19，n=4）顯著高于CYP2D6 轉(zhuǎn)基因小鼠（0.0070±0.0048，n=4）?；诖搜芯?，PIN/6-OH-THBC 被認(rèn)為可能是反映CYP2D6 活性的內(nèi)源性生物標(biāo)志物[4]。

目前，通過測定尿液中的C6-OH-THBC/CPIN比值評價人體內(nèi)CYP2D6 的活性[26，27]。如米氮平為經(jīng)CYP2D6 代謝的抗抑郁藥物，高達(dá)40%的患者存在耐藥現(xiàn)象，Sychev DA 等[26]利用口服米氮平患者尿液中C6-OH-THBC/CPIN比值反映CYP2D6 活性，CYP2D6 活性高的患者米氮平代謝加快，藥效降低，提示可以根據(jù)C6-OH-THBC/CPIN比值來指導(dǎo)臨床用藥，減小耐藥性的發(fā)生。但以上研究未將C6-OH-THBC/CPIN比值與特異性探針?biāo)幬锏拇x結(jié)果進(jìn)行比較[4]，因此以C6-OH-THBC/CPIN比值作為內(nèi)源性指標(biāo)還需要進(jìn)一步研究確認(rèn)。

1.6 CYP2E1 酶的內(nèi)源性生物標(biāo)志物

CYP2E1 參與約90 種外源性藥物以及各種內(nèi)源性脂肪酸的代謝，包括月桂酸、硬脂酸、花生四烯酸等，也能代謝體內(nèi)多種有毒底物，如乙醇、四氯化碳等[28]。測定CYP2E1 活性的典型外源性探針?biāo)幬餅槁冗蛏匙赱28]、月桂酸（lauric acid，LA）及其（ω-1）-羥基化產(chǎn)物11-羥基月桂酸（11-hydroxylauric acid，11-OH-LA），均是測定CYP2E1 活性的內(nèi)源性生物標(biāo)志物。

Amet Y 等[29]發(fā)現(xiàn)，經(jīng)CYP2E1 誘導(dǎo)劑（吡啶、丙酮、異煙肼等）處理的鼠肝微粒體產(chǎn)生更多的11-OH-LA。Choi YJ 等[30]考察了人肝微粒體中14 種CYP 重組酶對LA 代謝反應(yīng)的影響，發(fā)現(xiàn)經(jīng)CYP2E1 代謝的11-OH-LA 生成率最高。同時，氯唑沙宗發(fā)生6-羥基化反應(yīng)生成6-羥基化氯唑沙宗，而LA的（ω-1）-羥基化反應(yīng)和氯唑沙宗的6-羥基化反應(yīng)具有顯著的相關(guān)性[30]。綜上，LA/11-OH-LA 可能是測定人或鼠肝微粒體中CYP2E1 活性的內(nèi)源性生物標(biāo)志物。目前研究建立HPLC法和HPLC-MS/MS 法[30]測定了人肝微粒體中LA 和11-OHLA 濃度，并研究了LA/11-OH-LA 與CYP2E1 活性的關(guān)系。然而，僅在人肝微粒體進(jìn)行了部分研究，仍需進(jìn)一步的臨床研究驗證LA/11-OH-LA 能否用于測定人體CYP2E1 的活性。

1.7 CYP3A 酶的內(nèi)源性生物標(biāo)志物

CYP3A 是肝臟中最重要的代謝酶之一，在肝臟和小腸中表達(dá)最為豐富，約占肝臟總CYP 含量的30%，參與約50%上市藥物的代謝[31]。CYP3A 常用的外源性探針?biāo)幬镏饕沁溥_(dá)唑侖[10]，且對測定CYP3A 活性的內(nèi)源性生物標(biāo)志物也研究眾多，其中常用的兩種內(nèi)源性標(biāo)志物有：氫化可的松（cortisol）及其代謝物6β-氫化可的松（6β-hydroxycortisol，6β-OHF）和膽固醇（cholesterol）及其代謝物4β-羥基膽固醇（4βhydroxycholesterol，4β-OHC）[4]。

Shibasaki H 等[32]發(fā)現(xiàn)，患者服用利福平（CYP3A 誘導(dǎo)劑）后，人肝微粒體中氫化可的松發(fā)生6-羥基化的活性更高。而用酮康唑（CYP3A 抑制劑）處理人肝微粒體后，氫化可的松濃度顯著升高[33]。Furuta T 等[34]比較了CYP3A、CYP2B6 和CYP2C9 幾種CYP450 亞型對氫化可的松反應(yīng)的影響，結(jié)果證實，氫化可的松主要經(jīng)CYP3A 發(fā)生6β-羥基化反應(yīng)?；谝陨涎芯浚J(rèn)為6β-羥基皮質(zhì)醇是測定CYP3A 活性的內(nèi)源性生物標(biāo)志物[4]。6β-羥基皮質(zhì)醇/皮質(zhì)醇比值與皮質(zhì)醇清除率可用于評價CYP3A 的活性[4，35，36]。目前，CYP3A 活性評價的標(biāo)準(zhǔn)是咪達(dá)唑侖的清除率，研究表明[35]，皮質(zhì)醇清除率與咪達(dá)唑侖腎清除率有顯著的相關(guān)性，但有文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)[36]，尿液6β-羥基皮質(zhì)醇/皮質(zhì)醇比值與咪達(dá)唑侖清除率無顯著相關(guān)性。因此，認(rèn)為皮質(zhì)醇清除率比6β-羥基皮質(zhì)醇/皮質(zhì)醇比值評價CYP3A 的活性更加準(zhǔn)確。測定血漿和尿液中6β-羥基皮質(zhì)醇和皮質(zhì)醇濃度的分析方法包括ELISA、HPLC 法[34]和HPLCMS/MS 法[37]。

4β-羥基膽固醇是膽固醇經(jīng)CYP3A 代謝的內(nèi)源性化合物，不受腎排泄功能和體內(nèi)膽固醇水平的影響[36]。血漿4β-羥基膽固醇濃度以及4β-羥基膽固醇/膽固醇與咪達(dá)唑侖血漿清除率有一定的相關(guān)性[36]。然而，4β-羥基膽固醇的半衰期約為17 天，要準(zhǔn)確地檢測4β-羥基膽固醇的濃度，至少需要等到2 周以后，使?jié)舛冗_(dá)穩(wěn)態(tài)[38]。測定血漿中4β-羥基膽固醇和膽固醇濃度的分析方法有GC-MS/MS 法和HPLC-MS/MS 法[39，40]。

2 討論

2.1 內(nèi)源性生物標(biāo)志物研究進(jìn)展

CYP450 各亞型內(nèi)源性生物標(biāo)志物見表1。綜上所述，CYP1A2、CYP2A6、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1 和CYP3A 主要的內(nèi)源性標(biāo)志物分別為褪黑素/6-羥基褪黑素、3HC/COT、AA/EET 和AA/19-HETE、5-MT/5-HT 和PIN/6-HO-THBC、LA/11-OH-LA、6β-羥基皮質(zhì)醇/皮質(zhì)醇和4β-羥基膽固醇/膽固醇。檢測方法匯總見表2。

內(nèi)源性生物標(biāo)志物的相關(guān)進(jìn)展主要體現(xiàn)在以下幾個方面：（1）在某些研究選取的評價代謝酶活性的方法中，待評價的代謝酶不是該評價指標(biāo)的主要影響因素，無法有效地評價酶活性，如CYP2C19 酶活性的評價指標(biāo)11，12-和14，15-DHETs 水平不僅與CYP2C19 酶活性有關(guān)，同時與環(huán)氧化物水解酶有關(guān)[23]，未來需要選取更合適的評價方法進(jìn)行研究，證明內(nèi)源性生物標(biāo)志物的可靠性。（2）有些代謝酶的內(nèi)源性生物標(biāo)志物經(jīng)過一定的臨床研究后存在一些問題，如某些代謝產(chǎn)物（如5-HT 和4β-羥基膽固醇）半衰期過長，難以評價酶的快速變化，某些評價酶活性的方法與外源性探針代謝結(jié)果無顯著相關(guān)性（如R6β-羥基皮質(zhì)醇/皮質(zhì)醇），提示需選擇更可靠的內(nèi)源性生物標(biāo)志物或評價方法。（3）某些內(nèi)源性生物標(biāo)志物已通過臨床研究證明其評價代謝酶活性的可行性（如3HC/COT 和皮質(zhì)醇清除率），但這些內(nèi)源性生物標(biāo)志物如何更好地用于臨床評價還需要深入研究。

表1 CYP450 酶各亞型內(nèi)源性生物標(biāo)志物的評價方法匯總

2.2 酶活性評價及臨床應(yīng)用

評價酶活性的方法主要有內(nèi)源性代謝底物濃度、內(nèi)源性代謝產(chǎn)物濃度，以及內(nèi)源性代謝產(chǎn)物/代謝底物的比值。應(yīng)用較為廣泛的是內(nèi)源性代謝產(chǎn)物的濃度和內(nèi)源性代謝產(chǎn)物/代謝底物的比值，而內(nèi)源性代謝底物的濃度較少用于酶活性的評價，可能是由于內(nèi)源性底物的濃度受到多種因素的影響，包括代謝酶代謝和底物的重新分泌等，導(dǎo)致結(jié)果不可靠。

在臨床研究中需要注意：（1）應(yīng)選擇半衰期合適的內(nèi)源性生物標(biāo)志物濃度。若半衰期過長，需要待體內(nèi)底物代謝完全后再采集生物樣本，對受試者要求較高，若半衰期過短，代謝產(chǎn)物可能在采集之前已被代謝，需要嚴(yán)格控制采樣時間。（2）應(yīng)選擇合適的生物樣本。目前用于臨床研究的有唾液、血漿和尿液，各個樣本有其各自優(yōu)缺點。體內(nèi)大多數(shù)物質(zhì)經(jīng)尿液排泄，濃度較高，容易采集，但可能存在代謝途徑差異、個體間的腎臟清除率差異等問題，使結(jié)果不準(zhǔn)確[41]。血漿中內(nèi)源性生物標(biāo)志物的濃度更為穩(wěn)定，但某些物質(zhì)可能由于代謝較快而濃度過低，對檢測要求更高，且采集過程需要抽血，受試者依從性較差。因此，可根據(jù)試驗?zāi)康?，選擇快速、簡便、準(zhǔn)確的方法，測定各CYP450 酶活性的生物樣本。（3）內(nèi)源性探針的濃度存在個體間差異，建議臨床研究時采集并測定基線值，以消除個體差異對CYP450 酶活性評價的影響。

3 小 結(jié)

內(nèi)源性探針用于評價CYP450 酶活性不借助外源性探針?biāo)幬?，利用某些?nèi)源性物質(zhì)及其代謝物的水平變化來反映酶的變化，具有更好的依從性[4]。本文匯總了這6 種重要CYP450 酶亞型內(nèi)源性生物標(biāo)志物的研究進(jìn)展。目前，能用于準(zhǔn)確評價CYP450 酶活性的標(biāo)志物還不多，個體差異、半衰期等問題還需要進(jìn)一步的探討。期待今后會有更多的臨床研究，發(fā)現(xiàn)更為合適的內(nèi)源性探針和評價方法。

表2 CYP450 酶各亞型內(nèi)源性生物標(biāo)志物檢測的HPLC-MS/MS 法匯總