β-欖香烯抗DDP 耐藥卵巢癌細(xì)胞SKOV3/DDP作用及機(jī)制研究

陳心蕊，周宋匯，汪瑞辰，許 麗

江蘇省腫瘤醫(yī)院，江蘇省腫瘤防治研究所，南京醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院，南京 210009

卵巢癌是最常見(jiàn)的婦科腫瘤，由于其發(fā)病較為隱匿，大部分患者在確診時(shí)已經(jīng)處于中晚期，因而卵巢癌致死率極高[1]，嚴(yán)重危害了女性的健康。當(dāng)前對(duì)于卵巢癌的治療主要采用手術(shù)和化療的手段，而鉑類(lèi)制劑依然是化療的主要藥物[2，3]，盡管化療前期能夠較好地殺傷腫瘤細(xì)胞，但是隨著使用周期的延長(zhǎng)，腫瘤細(xì)胞極易產(chǎn)生順鉑（DDP）的耐藥性[4，5]，大大降低了臨床治療效果，降低患者生存期，因而探尋能夠逆轉(zhuǎn)卵巢癌的治療方法，是當(dāng)前抗卵巢癌研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。近年來(lái)，越來(lái)越多的文獻(xiàn)指出，中藥莪術(shù)中的β-欖香烯具有顯著的抗乳腺癌、肺癌等惡性腫瘤的活性[6]，更有研究表明，其具有逆轉(zhuǎn)結(jié)腸癌耐長(zhǎng)春新堿的作用[7]，表明β-欖香烯可能成為一種良好增強(qiáng)化療藥物效應(yīng)的藥物。相關(guān)理論認(rèn)為，腫瘤細(xì)胞能夠通過(guò)多種方式產(chǎn)生化療藥物耐藥作用，其最主要的機(jī)制是腫瘤細(xì)胞通過(guò)表達(dá)多種蛋白、包括多藥耐藥性蛋白（ATP-binding cassette subfamily B member 1，ABCB1）、肺耐藥相關(guān)蛋白（lung-resis-tance-related protein，LRP）和P-糖蛋白（P-gp），這些蛋白能夠直接與化療藥物結(jié)合，通過(guò)細(xì)胞胞吐作用將藥物轉(zhuǎn)運(yùn)出細(xì)胞[8，9]。故而抑制耐藥蛋白的表達(dá)有望能夠逆轉(zhuǎn)卵巢癌的耐藥作用。本研究主要探討β-欖香烯對(duì)DDP 耐藥卵巢癌細(xì)胞SKOV3/DDP 的直接抑制效應(yīng)，并研究其逆轉(zhuǎn)順鉑耐藥的作用，進(jìn)一步對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行探討。

1 材 料

1.1 腫瘤細(xì)胞株

SKOV3/DDP 耐藥卵巢癌細(xì)胞（江蘇凱基生物有限公司）。

1.2 藥品與試劑

McCoy’s 5a 細(xì)胞培養(yǎng)基（美國(guó)Hyclone 公司，批號(hào)：AC13430972）；胎牛血清（上海吉泰生物科技公司，批號(hào)：11H228）；β-欖香烯（成都植標(biāo)化純生物技術(shù)有限公司，純度≥98%，批號(hào)：190627）；順鉑注射液（江蘇豪森藥物有限公司，批號(hào)：601191902，規(guī)格：1 mL 注射液含DDP 5 mg）；CCK-8 細(xì)胞活力檢測(cè)試劑（日本Dojindo 化學(xué)科技公司，批號(hào)：FH783）；細(xì)胞凋亡流式檢測(cè)試劑盒（江蘇凱基生物有限公司，批號(hào)：20191123）；ABCB1、LRP 和P-gp 蛋白一抗（美國(guó)CST 生物公司）；GAPDH 蛋白一抗（武漢三鷹生物公司）；蛋白二抗（南京巴傲德生物公司）；Ripa 蛋白裂解液、BCA 蛋白定量試劑盒等（上海碧云天公司）。常規(guī)化學(xué)試劑，均為化學(xué)純，來(lái)源于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.3 儀器

細(xì)胞培養(yǎng)二氧化碳孵箱（美國(guó)Thermo Fisher公司，型號(hào)：3110）；倒置顯微鏡（日本Olympus 公司，型號(hào)：CKX53）；多功能酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo Fisher 公司，型號(hào)：Multiskan Fc）；流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD 公司，型號(hào)：Accuri C6）；蛋白凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)Bio-RAD 公司，型號(hào)GelDoc）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 CCK-8 法檢測(cè)β-欖香烯對(duì)SKOV3/DDP 細(xì)胞增殖的影響

SKOV3/DDP 細(xì)胞采用含10%胎牛血清的Mc-Coy’s 5a 完全培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，采用胰酶消化、離心和計(jì)數(shù)，完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)后，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×105/mL，以每孔200 μL 體積接種于96 孔無(wú)菌細(xì)胞培養(yǎng)板中。細(xì)胞培養(yǎng)24 h 貼壁后，分別加入0、10、20、40、80、160、320 μmol·L-1的β-欖香烯于細(xì)胞培養(yǎng)板中，每個(gè)藥物組設(shè)置6 個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。藥物作用結(jié)束后，每個(gè)細(xì)胞孔中加入10 μL 的CCK-8 溶液，輕輕敲擊培養(yǎng)板進(jìn)行混勻，將培養(yǎng)板繼續(xù)置于培養(yǎng)箱中孵育2 h。孵育結(jié)束后，取出培養(yǎng)板置于酶標(biāo)儀450 nm 波長(zhǎng)處，檢測(cè)每孔的吸光度值A(chǔ)450。

細(xì)胞增殖抑制率（%）=（1-A藥物組/A對(duì)照組）×100%。

2.2 克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)β-欖香烯對(duì)SKOV3/DDP細(xì)胞單細(xì)胞克隆生成能力的影響

實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組、β-欖香烯（20、40、80μmol·L-1）劑量組。分別取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SKOV3/DDP細(xì)胞200 個(gè)，接種于不同6 孔培養(yǎng)板中，輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)該培養(yǎng)板使細(xì)胞分散均勻。待細(xì)胞培養(yǎng)24 h 貼壁后，棄去原有培養(yǎng)基，更換含有相應(yīng)藥物的培養(yǎng)基，放于培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)14 天。培養(yǎng)結(jié)束后，棄去培養(yǎng)基，無(wú)菌PBS 浸泡清洗培養(yǎng)孔2 次，無(wú)水甲醇固定細(xì)胞10 min，小心吸去甲醇，微晾干后加入瑞士吉姆薩染液進(jìn)行染色10 min，染色結(jié)束，吸去染液，PBS 清洗2 遍后，自然晾干后進(jìn)行拍照，采用Image J 軟件對(duì)細(xì)胞克隆數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)分析。

2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)β-欖香烯對(duì)SKOV3/DDP細(xì)胞凋亡的影響

實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組、β-欖香烯（20、40、80μmol·L-1）劑量組。取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SKOV3/DDP 細(xì)胞分別接種于不同6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔接種細(xì)胞數(shù)為5×105個(gè)，細(xì)胞培養(yǎng)24 h 貼壁后，棄去原有培養(yǎng)基，加入含有藥物的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)結(jié)束后，棄去培養(yǎng)基，PBS 清洗3 遍后，采用胰酶消化，收集細(xì)胞，PBS 清洗2 遍后，離心收集全部細(xì)胞至新的無(wú)菌EP 管中，加入500μL 的流式上樣緩沖液，移液器輕輕吹打混勻細(xì)胞；每個(gè)離心管中加入5μL的Annexin V-FITC，移液槍混合均勻；繼續(xù)加入5 μL 的碘化丙啶（propidium iodode，PI），移液槍輕輕吹打使混合均勻。將整個(gè)混勻后的體系置于室溫避光環(huán)境中充分反應(yīng)10 min，待反應(yīng)結(jié)束，過(guò)200 目篩上機(jī)檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，計(jì)算細(xì)胞凋亡數(shù)。

2.4 CCK-8 檢測(cè)β-欖香烯逆轉(zhuǎn)SKOV3/DDP 細(xì)胞對(duì)DDP 的耐藥作用

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SKOV3/DDP 細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×105/mL，以每孔200 μL 體積接種于96 孔無(wú)菌細(xì)胞培養(yǎng)板中。細(xì)胞培養(yǎng)24 h 貼壁后，分別加入0、2、4、8、16、32、64 mg·L-1的DDP 于細(xì)胞培養(yǎng)板中，除空白對(duì)照組之外每孔加入10μmol·L-1的β-欖香烯，每個(gè)藥物組設(shè)置6 個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。藥物作用結(jié)束后，每個(gè)細(xì)胞孔中加入10μL 的CCK-8溶液，輕輕敲擊培養(yǎng)板進(jìn)行混勻，將培養(yǎng)板繼續(xù)置于培養(yǎng)箱中孵育2 h。孵育結(jié)束后，取出培養(yǎng)板置于酶標(biāo)儀450 nm 波長(zhǎng)處，檢測(cè)每孔的吸光度值A(chǔ)450。

逆轉(zhuǎn)耐藥指數(shù)（resistance index，RI）=藥物單獨(dú)作用耐藥細(xì)胞IC50/藥物聯(lián)合逆轉(zhuǎn)劑共同作用耐藥細(xì)胞IC50。

2.5 Western blot 法檢測(cè)β-欖香烯對(duì)SKOV3/DDP 細(xì)胞耐藥蛋白表達(dá)的影響

取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SKOV3/DDP 細(xì)胞接種于6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔接種數(shù)量為2×105個(gè)，培養(yǎng)體系為2 mL，實(shí)驗(yàn)分為4 組：空白對(duì)照組、β-欖香烯（20、40、80 μmol·L-1）劑量組，細(xì)胞處理和給藥方法同方法“2.3”。待藥物作用48 h 后，棄去培養(yǎng)基，RIPA 裂解液充分裂解細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，經(jīng)BCA蛋白定量后，調(diào)整蛋白濃度，加入上樣緩沖液制備上樣蛋白。制備完畢后，參照蛋白電泳方法進(jìn)行SDS-PAGE 蛋白電泳。電泳結(jié)束后，轉(zhuǎn)膜1.5 h，脫脂奶粉封閉2 h 后，加入經(jīng)1000 倍稀釋的ABCB1、LRP、P-gp 蛋白一抗和GAPDH 蛋白一抗，將膜置于4 ℃中孵育過(guò)夜。次日，去除一抗洗膜后加入2000倍稀釋的蛋白二抗，室溫繼續(xù)孵育1.5 h，TBST 洗膜4 次后，凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行曝光，采用Image J 軟件對(duì)蛋白條帶進(jìn)行灰度值分析，實(shí)驗(yàn)以目標(biāo)蛋白與內(nèi)參GAPDH 蛋白灰度值的比值計(jì)算目標(biāo)蛋白的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，樣本均數(shù)間比較采用LSD-t 檢驗(yàn)，采用Graphpad 5.0 軟件進(jìn)行繪圖。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 β-欖香烯對(duì)SKOV3/DDP 細(xì)胞增殖的影響

CCK-8 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，β-欖香烯20、40、80、160、320 μmol·L-1對(duì)SKOV3/DDP 細(xì)胞增殖有明顯抑制作用，且與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。然后采用β-欖香烯20、40、80 μmol·L-1劑量研究β-欖香烯對(duì)SKOV3/DDP 細(xì)胞的直接作用。β-欖香烯10 μmol·L-1并不能直接抑制SKOV3/DDP 細(xì)胞增殖，見(jiàn)圖1。

圖1 β-欖香烯對(duì)SKOV3/DDP 細(xì)胞增殖的影響（，n=6）

3.2 β-欖香烯對(duì)SKOV3/DDP 細(xì)胞克隆形成的影響

克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，β-欖香烯20、40、80 μmol·mL-1組對(duì)SKOV3/DDP 細(xì)胞克隆形成數(shù)明顯減少，且與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）。結(jié)果表明，β-欖香烯能夠抑制SKOV3/DDP 細(xì)胞的克隆生成。見(jiàn)圖2。

圖2 β-欖香烯對(duì)SKOV3/DDP 細(xì)胞的克隆生成的影響（，n=6）

3.3 β-欖香烯對(duì)SKOV3/DDP 細(xì)胞凋亡的影響

流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，β-欖香烯20、40、80 μmol·L-1組對(duì)SKOV3/DDP 細(xì)胞凋亡明顯增加，且與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。結(jié)果表明，β-欖香烯能夠促進(jìn)SKOV3/DDP 細(xì)胞的凋亡。見(jiàn)圖3。

圖3 β-欖香烯對(duì)SKOV3/DDP 細(xì)胞凋亡的影響（，n=6）

3.4 β-欖香烯逆轉(zhuǎn)SKOV3/DDP 細(xì)胞對(duì)DDP 的耐藥作用

CCK-8 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著DDP 濃度的升高，對(duì)SKOV3/DDP 細(xì)胞的抑制率逐漸升高。β-欖香烯和DDP 聯(lián)合使用組對(duì)SKOV3/DDP 細(xì)胞的抑制率明顯增高，與DDP 組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。SKOV3/DDP 細(xì)胞對(duì)DDP 的IC50為17.54 mg·L-1，在β-欖香烯聯(lián)合作用下，SKOV3/DDP 細(xì)胞對(duì)DDP 的IC50下降為6.78 mg·L-1，β-欖香烯能夠逆轉(zhuǎn)SKOV3/DDP 細(xì)胞對(duì)DDP 的耐藥，且逆轉(zhuǎn)倍數(shù)為2.58 倍。見(jiàn)圖4。

3.5 β-欖香烯對(duì)SKOV3/DDP 細(xì)胞耐藥相關(guān)蛋白ABCB1、LRP 和P-gp 的影響

圖4 β-欖香烯對(duì)SKOV3/DDP 細(xì)胞DDP 耐藥的逆轉(zhuǎn)作用（，n=6）

為研究β-欖香烯抑制SKOV3/DDP 細(xì)胞作用的機(jī)制，對(duì)SKOV3/DDP 細(xì)胞中的多藥耐藥相關(guān)蛋白進(jìn)行研究。Western Blot 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，ABCB1、LRP、P-gp 在SKOV3/DDP 細(xì)胞中明顯高表達(dá)，在β-欖香烯20、40、80 μmol·L-1組SKOV3/DDP 細(xì)胞中的ABCB1、LRP、P-gp 均明顯降低，且與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）。結(jié)果表明，β-欖香烯對(duì)卵巢癌細(xì)胞的抑制作用和逆轉(zhuǎn)耐藥作用，可能與抑制SKOV3/DDP 細(xì)胞中的耐藥蛋白的表達(dá)水平有關(guān)。見(jiàn)圖5。

圖5 β-欖香烯對(duì)SKOV3/DDP 細(xì)胞ABCB1、LRP 和Pgp 耐藥蛋白表達(dá)的抑制作用（，n=6）

4 討論

卵巢癌是一種高致死性的婦科腫瘤，而采用順鉑進(jìn)行化療是卵巢癌規(guī)范化治療的必須環(huán)節(jié)，能夠大大提高患者的總體生存率和生存期[10]。然而，臨床研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的多藥耐藥性是化療失敗的主要原因[11]，因而合理使用化療藥物或聯(lián)合使用其他藥物逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞耐藥是當(dāng)前腫瘤治療的重要課題。卵巢癌能夠表達(dá)多種腫瘤耐藥蛋白，這些蛋白能夠通過(guò)直接與化合物結(jié)合、促進(jìn)胞吐作用或促進(jìn)化療藥物外排，從而產(chǎn)生化療藥物耐藥[12]，因此抑制耐藥蛋白的表達(dá)，以此為靶點(diǎn)開(kāi)發(fā)合理的聯(lián)合藥物有望逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞耐藥，增強(qiáng)化療藥物的療效。

β-欖香烯是中藥姜黃屬溫郁金中的主要活性成分，已經(jīng)被證實(shí)是一種廣譜的抗腫瘤成分[6]，現(xiàn)已研制成欖香烯注射液用于聯(lián)合其他藥物對(duì)肺癌、肝癌等多種惡性腫瘤的治療;但是對(duì)于其增強(qiáng)化療藥物療效是否與直接殺傷腫瘤細(xì)胞和或逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥作用有關(guān)還不得而知。

本研究將DDP 耐藥卵巢癌細(xì)胞SKOV3/DDP作為研究對(duì)象，采用不同濃度的β-欖香烯進(jìn)行直接作用，研究β-欖香烯對(duì)耐藥的卵巢癌細(xì)胞的抑制作用，并采用不具有直接細(xì)胞毒作用的劑量聯(lián)合順鉑進(jìn)行給藥處理，研究β-欖香烯逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞耐藥的作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，β-欖香烯（20、40、80 μmol·L-1）各濃度能夠抑制SKOV3/DDP 細(xì)胞的增殖、克隆生成并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。進(jìn)一步聯(lián)合用藥后，發(fā)現(xiàn)在無(wú)直接細(xì)胞毒性10 μmol·L-1濃度下，β-欖香烯能夠逆轉(zhuǎn)SKOV3/DDP 細(xì)胞對(duì)順鉑的耐藥作用，其逆轉(zhuǎn)耐藥的倍數(shù)為2.58 倍。這一結(jié)果充分證實(shí)，β-欖香烯能夠?qū)δ退幍穆殉舶┘?xì)胞產(chǎn)生抑制作用，且也能夠逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞耐藥，表明其具有良好的抗腫瘤效應(yīng)。

長(zhǎng)期使用化療藥物后，未被殺死的腫瘤細(xì)胞能夠表達(dá)耐藥蛋白，這些耐藥蛋白通過(guò)將化療藥物轉(zhuǎn)運(yùn)出細(xì)胞、從而實(shí)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞的多藥耐藥，其中ABCB1、LRP、P-gp 是最主要的耐藥蛋白[13，14]，它們?cè)诼殉舶┗颊咧懈弑磉_(dá)。本研究通過(guò)Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在SKOV3/DDP 細(xì)胞中，ABCB1、LRP和P-gp 表達(dá)水平較高，而β-欖香烯能夠劑量依賴(lài)性的抑制這幾種耐藥蛋白的表達(dá)，結(jié)果表明，β-欖香烯逆轉(zhuǎn)SKOV3/DDP 細(xì)胞多藥耐藥的作用機(jī)制可能與抑制耐藥蛋白的表達(dá)有關(guān)。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，β-欖香烯可以抑制SKOV3/DDP 細(xì)胞的增殖生長(zhǎng)、促進(jìn)細(xì)胞凋亡，也能夠逆轉(zhuǎn)SKOV3/DDP 細(xì)胞順鉑耐藥，同時(shí)對(duì)ABCB1、LRP 和P-gp 多種耐藥蛋白表達(dá)具有較強(qiáng)的抑制作用。本研究提示，β-欖香烯能夠通過(guò)抑制多種耐藥蛋白的表達(dá)發(fā)揮抗SKOV3/DDP 細(xì)胞和逆轉(zhuǎn)化療藥物耐藥的作用，其成藥性值得后續(xù)深入探討。