基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接分析補腎活血顆粒治療帕金森病分子機制

王 鵬，王 亮，侯曉圓，潘 宇，李紹旦，楊明會

(中國人民解放軍總醫(yī)院中醫(yī)醫(yī)學(xué)部,北京 100048)

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是一種好發(fā)于中老年人群的中樞神經(jīng)退行性疾病，主要有靜止性震顫、姿勢平衡障礙、肌僵直、抑郁、失眠等運動性和非運動性癥狀[1-2],并以黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元進行性退變、路易小體形成為病理特征。流行病學(xué)調(diào)查顯示，我國65歲以上人群PD發(fā)病率為1 700/10萬，面對我國老齡化日益加重的趨勢，進一步推動PD的治療研究與防控勢在必行[2]。

補腎活血顆粒是解放軍總醫(yī)院中醫(yī)醫(yī)學(xué)部楊明會主任根據(jù)多年臨床經(jīng)驗與療效反饋所創(chuàng)制，其組成為赤芍、川芎、當(dāng)歸、丹參、肉蓯蓉、山茱萸、石菖蒲、蜈蚣、水蛭。補腎活血顆粒經(jīng)前期臨床研究，發(fā)現(xiàn)該方療效穩(wěn)定，能夠升高PD患者腦內(nèi)多巴胺水平，降低PD患者靜息狀態(tài)下的肌張力，緩解肌僵直癥狀，同時改善患者睡眠，提高生活質(zhì)量[3-6]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)由Hopkins于2007年提出，借助于網(wǎng)絡(luò)分析的方法，通過“多成分、多靶點、多途徑”研究藥物與疾病靶點之間的關(guān)系，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)認(rèn)為疾病發(fā)生的本質(zhì)是網(wǎng)絡(luò)某個或多個節(jié)點所代表的基因或者其編碼的蛋白處于失衡狀態(tài)[7-8]。這與中醫(yī)對疾病的發(fā)生發(fā)展規(guī)律不謀而合，中醫(yī)認(rèn)為疾病的本質(zhì)是人體陰陽屬性出現(xiàn)偏差，并通過中藥復(fù)方多角度、多途徑糾正偏差。本文以網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)為研究方法，分析補腎活血顆粒調(diào)控PD的分子機制，從“疾病-基因-通路”多維度揭示PD發(fā)病規(guī)律與藥物作用途徑，有助于豐富中藥復(fù)方補腎活血顆粒科學(xué)內(nèi)涵，探索研究新的藥物，推動中醫(yī)藥的傳承與發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 補腎活血顆粒靶點查找與篩選借助于中藥系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)庫及分析平臺(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP)[9]查找補腎活血顆粒各組分的活性成分和作用靶點，并以口服利用度(oral bioavailability，OB)>30%、類藥性(drug-likeness，DL)>0.18為條件對查詢到的中藥成分進行ADME屬性值篩選。將篩選得到的活性成分與數(shù)據(jù)庫中的靶點一一對應(yīng)，并通過uniprot數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org)，將得到的靶標(biāo)進行注釋。

1.2 查詢PD相關(guān)疾病靶點在GeneCards疾病數(shù)據(jù)庫中(https://www.genecards.org/)搜索關(guān)鍵詞“Parkinson disease”，查找疾病靶基因，將檢索到的靶基因根據(jù)相關(guān)度值中位數(shù)進行篩選，刪除小于中位數(shù)值的靶標(biāo)。

1.3 構(gòu)建補腎活血顆粒-PD靶點PPI網(wǎng)絡(luò)通過R語言，對取得的藥物靶點與疾病靶點取交集，得到疾病-藥物共同作用靶點集合，并繪制韋恩圖。將得到的疾病-藥物共同靶點基因輸入到STRING11.0(https://string-db.org)數(shù)據(jù)庫，構(gòu)建補腎活血顆粒-PD靶點PPI網(wǎng)絡(luò)[10]，設(shè)置生物類別為“Homo Sapiens”、“interaction score”設(shè)為“highest confidence>0.9”，其余設(shè)置均為系統(tǒng)默認(rèn)值。下載“string.tsv”文件，使用Cytoscape 3.7.1對PPI網(wǎng)絡(luò)文件進行編輯，并使用插件MCODE分析該網(wǎng)絡(luò)圖中潛在蛋白質(zhì)功能模塊。

1.4 補腎活血顆粒-PD靶點功能與通路的富集分析利用Metascape在線基因注釋平臺(https://metascape.org/gp/index.html)對疾病和藥物共同作用的靶點進行功能富集分析，導(dǎo)入數(shù)據(jù)后，將P值設(shè)為<0.01，將獲得的結(jié)果保存后，運用office2016 Excel工具將獲得的結(jié)果進行可視化。

1.5 構(gòu)建補腎活血顆粒-PD靶點-作用通路網(wǎng)絡(luò)圖利用Cytoscape 3.7.1將得到的藥物-疾病共同作用靶點、活性成分和KEGG信號通路構(gòu)建補腎活血顆粒-PD靶點-作用通路網(wǎng)絡(luò)圖。借助軟件內(nèi)置的計算工具，計算網(wǎng)絡(luò)節(jié)點特征值參數(shù)，將結(jié)果導(dǎo)出，根據(jù)度(degree)、介度(betweenness)和緊密度(closeness)篩選活性成分及蛋白質(zhì)靶點，為分子對接作準(zhǔn)備。

1.6 分子對接通過Cytoscape 3.7.1計算網(wǎng)絡(luò)節(jié)點特征值，篩選活性成分和蛋白質(zhì)，通過PROTEIN DATA BANK、ZINC(http://zinc.docking.org)查找受體蛋白、配體小分子，并下載其3D結(jié)構(gòu)，借助于AUTODOCK和PYMOL軟件進行分子對接和可視化操作。

2 結(jié)果

2.1 獲得補腎活血顆粒作用靶點通過TCMSP查詢補腎活血顆粒的化學(xué)成分，經(jīng)過ADME篩選之后，其所含化學(xué)成分?jǐn)?shù)量如下：赤芍29個，川芎7個，丹參65個，當(dāng)歸2個，肉蓯蓉6個，山茱萸20個，石菖蒲4個，蜈蚣等為動物類藥，數(shù)據(jù)庫中尚未收錄。同時根據(jù)uniprot數(shù)據(jù)庫查詢到的蛋白質(zhì)，對補腎活血顆粒藥物作用靶點進行注釋，篩去uniprot數(shù)據(jù)庫中不包含的作用靶點，獲得的各中藥靶點數(shù)目如下：赤芍121個，川芎31個，丹參666個，當(dāng)歸50個，肉蓯蓉171個，山茱萸93個，石菖蒲75個，合并上述靶點刪去重復(fù)值共有靶點201個。

2.2 獲取PD疾病靶點通過Genecards數(shù)據(jù)庫共檢索到與PD相關(guān)的疾病靶點7 654個，計算“relevance score”中位數(shù)值為3.31，選擇分值大于中位數(shù)的靶點，最終得到靶點3 825個。

2.3 構(gòu)建補腎活血顆粒-PD靶點PPI網(wǎng)絡(luò)通過R語言程序，取交集，并制作生成補腎活血顆粒-PD作用靶點韋恩圖，共得到共同靶點145個，見Fig 1。根據(jù)中藥-疾病共有的靶標(biāo)逆向篩選中藥復(fù)方活性成分，刪除重復(fù)項共獲得活性成分81個，見Tab 1。將獲得的共同靶點通過STRING11.0平臺，制作PPI蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)圖，將獲得的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖導(dǎo)入至cytoscape 3.7.1中，并利用MCODE分析其潛在蛋白質(zhì)功能模塊。補腎活血顆粒-帕金森病靶點PPI網(wǎng)絡(luò)中的module，見Fig 2。

Fig 1 Venn diagram of components of Bushen Huoxue granules-PD target

2.4 基因本體與作用通路富集分析通過Metascape在線基因注釋平臺，對獲得的藥物-疾病共同作用靶點進行功能和作用通路的富集分析。根據(jù)LogP值升序排列，取其前20位。由富集結(jié)果可以看出，補腎活血顆粒作用的靶點與PD的發(fā)病機制有密切的聯(lián)系。其中，補腎活血顆粒主要參與的生物學(xué)過程包括：對有毒物質(zhì)的反應(yīng)(response to toxic substance)、對脂多糖的反應(yīng)(response to lipopolysaccharide)、對細(xì)菌起源分子的反應(yīng)(response to molecule of bacterial origin)、對無機物的反應(yīng)(response to inorganic substance)、細(xì)胞因子介導(dǎo)的信號通路(cytokine-mediated signaling pathway)，見Fig 3A。參與的主要通路包括PI3K-Akt信號通路、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路、內(nèi)分泌抵抗等，見Tab 2和Fig 3D。

Tab 1 Main components of Bushen Huoxue granules

DrugCodingMOLIDActiveingredientOB(%)DLDS34MOL007108Isocryptotanshi-none54.980.39DS35MOL007111IsotanshinoneII49.920.4DS36MOL007119MiltiononeⅠ49.680.32DS37MOL007120MiltiononeⅡ71.030.44DS38MOL007121Miltipolone36.560.37DS39MOL007122Miltirone38.760.25DS40MOL007124Neocryptotanshinoneii39.460.23DS41MOL007125Neocryptotanshinone52.490.32DS42MOL0071271-methyl-8,9-dihydro-7H-naphtho[5,6-g]benzofuran-6,10,11-trione34.720.37DS43MOL007130Prolithospermicacid64.370.31DS44MOL007132(2R)-3-(3,4-dihydroxyphenyl)-2-[(Z)-3-(3,4-dihydroxyphenyl)acryloyl]oxy-propionicacid109.380.35DS45MOL007141Salvianolicacidg45.560.61DS46MOL007142Salvianolicacidj43.380.72DS47MOL007143SalvilenoneⅠ32.430.23DS48MOL007145Salviolone31.720.24DS49MOL007150(6S)-6-hydroxy-1-methyl-6-methylol-8,9-dihydro-7H-naphtho[8,7-g]benzofuran-10,11-quinone75.390.46DS50MOL007151TanshindiolB42.670.45DS51MOL007152PrzewaquinoneE42.850.45DS52MOL007154Tanshinoneiia49.890.4DS53MOL007155(6S)-6-(hydroxymethyl)-1,6-dimethyl-8,9-dihydro-7H-naphtho[8,7-g]benzofuran-10,11-dione65.260.45DS54MOL007156TanshinoneⅥ45.640.3DGDG1MOL000358Beta-sitosterol36.910.75DG2MOL000449Stigmasterol43.830.76RCRRCR1MOL000098Quercetin46.430.28RCR2MOL000358Beta-sitosterol36.910.75RCR3MOL005320Arachidonate45.570.2RCR4MOL005384Suchilactone57.520.56RCR5MOL007563Yangambin57.530.81RCR6MOL008871Marckine37.050.69SZYSZY1MOL000358Beta-sitosterol36.910.75SZY2MOL000449Stigmasterol43.830.76SZY3MOL001494Mandenol420.19SZY4MOL001495Ethyllinolenate46.10.2SZY5MOL002879Diop43.590.39SZY6MOL0054812,6,10,14,18-pentamethylicosa-2,6,10,14,18-pentaene33.40.24SZY7MOL005503Cornudentanone39.660.33SZY8MOL005530Hydroxygenkwanin36.470.27SZY9MOL008457Tetrahydroalstonine32.420.81SCPSCP1MOL000422kaempferol41.880.24SCP2MOL0035428-Isopentenyl-kaempferol38.040.39SCP3MOL003576(1R,3aS,4R,6aS)-1,4-bis(3,4-dime-thoxyphenyl)-1,3,3a,4,6,6a-hexahydro-furo[4,3-c]furan52.350.62注：CS:赤芍，DS:丹參，DG:當(dāng)歸，RCR:肉蓯蓉，SZY:山茱萸，SCP:石菖蒲

Fig 2 Module of Bushen Huoxue granules-PD target PPI network

Fig 3 Enrichment analysis of potential targets of main components of Bushen Huoxue granulesNotes:A：GO-BP；B:GO-CC；C：GO-MF；D:KEGG

Tab 2 Enrichment results of Bushen Huoxue granules treatment of PD target pathway

補腎活血顆粒靶點治療PD的功能主要富集于蛋白激酶結(jié)合(protein kinase binding)、激酶結(jié)合(kinase binding)、蛋白質(zhì)同聚活性(protein homodimerization activity)、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合(transcription factor binding)、細(xì)胞因子受體結(jié)合(cytokine receptor binding)，見Fig 3C。

Fig 4 Schematic diagram of molecular docking of interaction between quercetin and PTGS2 (1PXX)

2.5 構(gòu)建補腎活血顆粒-PD靶點-作用通路網(wǎng)絡(luò)圖利用Cytoscape 3.7.1構(gòu)建“補腎活血顆粒-PD靶點-通路網(wǎng)絡(luò)圖”。使用Cytoscape 3.7.1內(nèi)置分析功能——Network analyzer分析Fig 5網(wǎng)絡(luò)節(jié)點特征參數(shù)值，確定核心成分與核心靶點，并以連接度值的大小取其前5位，見Tab 3。

Tab 3 Network node characteristic parameters of main active ingredients of Bushen Huoxue granules

由Tab 3網(wǎng)絡(luò)節(jié)點特征值參數(shù)可知，槲皮素連接度為98、介度為0.33、緊密度為0.55，是補腎活血顆粒主要活性成分，其他活性成分有木犀草素(連接度為43、介度為0.07、緊密度為0.44)、山柰酚(連接度為36、介度為0.05、緊密度為0.41)、丹參酮(連接度為27、介度為0.04、緊密度為0.41)。

PTGS2連接度為77、介度為0.24、緊密度為0.54，是補腎活血顆粒作用的主要靶點，此外，PTGS1(連接度為45、介度為0.07、緊密度為0.47)、SCN5A(連接度為44、介度為0.04、緊密度為0.45)、ADRB2(連接度為41、介度為0.03、緊密度為0.45)、CHRM1(連接度為、介度為0.02、緊密度為0.39)亦是補腎活血顆粒作用的重要靶點，詳見Tab 4。

Tab 4 Characteristic parameters of network nodes of main active ingredients of Bushen Huoxue granules

2.6 分子對接通過得到的網(wǎng)絡(luò)節(jié)點特征參數(shù)，發(fā)現(xiàn)槲皮素連接度最高(連接度為98)是補腎活血顆粒主要活血性成分，PTGS2為主要作用靶點(連接度為77)，因此以槲皮素作為配體小分子，PTGS2為受體蛋白進行分子對接。借助于PROTEIN DATA BANK查找受體蛋白的編碼為1PXX，下載其3 d結(jié)構(gòu)，見Fig 4A；并借由ZINC(http://zinc.docking.org)查找配體小分子槲皮素，下載其3 d結(jié)構(gòu)，見Fig 4B。使用AUTODOCK軟件對受體蛋白和配體小分子進行分子對接，導(dǎo)出其對接文件，運用pymol將對接結(jié)果可視化，得到分子對接模式圖，見Fig 4C。從對接結(jié)果和分子模式圖中，可以發(fā)現(xiàn)槲皮素可以結(jié)合于1PXX蛋白質(zhì)，主要通過GLU-67、GLN-54兩個氨基酸殘基與槲皮素發(fā)生H鍵作用，氫鍵的結(jié)合能為-2.49。

3 討論

PD又稱震顫麻痹癥，中醫(yī)學(xué)雖無此病名，卻有“顫證”、“震顫”諸癥狀為病名載之。古代醫(yī)家認(rèn)為該病屬本虛標(biāo)實之證，以肝腎陰虛、氣血衰弱為發(fā)病機制，臨床以風(fēng)邪盛實之狀為特點，誠如孫一奎于《赤水玄珠·顫振門》中記載:“顫振者，人病手足搖動，如抖擻之狀，筋脈約束不住，而莫能任持，風(fēng)之象也?！睏蠲鲿淌谠诶^承前人發(fā)病觀的基礎(chǔ)上，認(rèn)為腎虛血瘀亦是顫證發(fā)生的關(guān)鍵，皆因腎乃水臟，木水互滋相生，腎虛則精虧水少，充養(yǎng)不足，引動肝風(fēng)，久之化火生痰，阻滯經(jīng)絡(luò)血脈，瘀滯之象從生。補腎活血顆粒方以丹參、山茱萸、肉蓯蓉為君藥，填精溫陽、通行血脈；當(dāng)歸、川芎、赤芍為臣藥，活血祛瘀；石菖蒲為佐藥，開隧竅逐瘀、除神志迷塞；水蛭、蜈蚣通行經(jīng)脈，為使藥。全方通補兼施，益腎活血并進，共奏補腎活血、益精填髓、通行血脈之功。

本研究發(fā)現(xiàn)，補腎活血顆粒治療PD的主要靶點有PTGS2、PTGS1、SCN5A、ADRB2和CHRM1等。PTGS2，是多表達于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的重要炎性介質(zhì)，PTGS1亦炎癥反應(yīng)介質(zhì)之一，PTGS2水平的高表達與神經(jīng)元損傷、認(rèn)知障礙具有一定的聯(lián)系[11]；ADRB2能夠與細(xì)胞膜上的離子通道受體形成復(fù)合物，從而調(diào)控離子通道，這與PD發(fā)病機制中線粒體功能障礙發(fā)病機制有一定聯(lián)系[12];CHRM1可與乙酰膽堿進行結(jié)合，能夠保護乙酰膽堿神經(jīng)元，從而能夠影響人體的睡眠、記憶和感覺運動等功能，而PD非運動癥狀中伴隨有失眠、健忘等[13]。通路富集結(jié)果中如PI3K/AKT信號通路可影響神經(jīng)元的發(fā)育，并能影響大腦黑質(zhì)多巴胺的含量[14]；Toll樣受體信號通路中的TLR4是重要的免疫炎癥受體，參與到神經(jīng)細(xì)胞損傷和破壞血腦屏障等發(fā)病機制進程中[15]。

通過PPI網(wǎng)絡(luò)節(jié)點特征值參數(shù)，發(fā)現(xiàn)主要活性成分有槲皮素、木犀草素、山柰酚、丹參酮等。研究表明，槲皮素能夠調(diào)節(jié)IKKα/NF-κB信號通路，具有抑制神經(jīng)炎癥反應(yīng)的作用[16]；木犀草素可減少α突觸核蛋白聚集水平，降低活性氧(ROS)的水平，同時還能抑制神經(jīng)炎性反應(yīng)，減輕神經(jīng)細(xì)胞凋亡，保護神經(jīng)功能；山柰酚可保護神經(jīng)元免受β淀粉樣蛋白的損傷；丹參酮具有抗炎、抗氧化和保護神經(jīng)元的作用，對PD的治療有一定價值，還可減輕細(xì)胞凋亡和保護線粒體膜的穩(wěn)定性[17-18]。

綜上所述，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)從分子層面進行研究，發(fā)現(xiàn)補腎活血顆粒有不同的活性成分，能夠參與到不同的生物學(xué)進程中去，從多層次、多環(huán)節(jié)發(fā)揮其對PD的作用機制，為臨床治療PD提供了新思路與新參考，同時為后續(xù)進一步實驗驗證補腎活血顆粒作用機制奠定了基礎(chǔ)。