青錢柳葉質(zhì)量控制方法研究△

毛菊華，余華麗，陳張金，范蕾，吳查青

麗水市質(zhì)量檢驗(yàn)檢測(cè)研究院，浙江 麗水 323000

青錢柳葉為我國特有的藥食同源珍稀植物胡桃科落葉喬木青錢柳Cyclocaryapaliurus(Batal)Iljinsk.的干燥葉，民間常作茶葉飲用，因其味甘甜，而有“甜茶”“神茶”之稱。現(xiàn)代藥理研究表明，青錢柳葉具有降血糖、調(diào)血脂、降血壓、抗氧化及防治心腦血管疾病等多種作用，其中降血糖作用尤為突出。青錢柳葉的主要活性成分為黃酮、三萜、有機(jī)酸及多糖等類化合物[1-6]。目前，民間對(duì)青錢柳葉的采收加工并無明確的指導(dǎo)標(biāo)準(zhǔn)，每年4—10月均有采集，故有必要對(duì)其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)進(jìn)行動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，優(yōu)選最佳采收期。本研究采用顯微鑒別法、薄層色譜法(TLC)、超高效液相色譜法(UPLC)分別對(duì)青錢柳葉的顯微特征、指標(biāo)性成分(槲皮素、山柰酚、綠原酸、異槲皮苷和槲皮苷)進(jìn)行定性鑒別和定量測(cè)定，優(yōu)選最佳采收期，建立質(zhì)量控制方法，以期為青錢柳葉質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供參考。

1 材料

1.1 儀器

H-class型超高效液相色譜儀(美國沃特世公司)；XS105DU型電子天平(瑞士梅特勒公司)；DL-360D型智能超聲波清洗器(上海之信儀器有限公司)；DM2500型正置顯微鏡(德國徠卡公司)；硅膠G薄層色譜板(10 cm× 20 cm，青島海洋化工有限公司)。

1.2 試藥

對(duì)照品山柰酚(批號(hào)：110861-201611，純度：93.2%)、槲皮素(批號(hào)：100081-201408，純度：99.1%)、綠原酸(批號(hào)：110753-201817，純度：98.0%)、異槲皮苷(批號(hào)：111809-201804，純度：90.5%)和槲皮苷(批號(hào)：11538-201105，純度：98.0%)均購自中國食品藥品檢定研究院；甲醇、乙腈、磷酸均為色譜純；水為超純水。

青錢柳藥材均為自行采集，經(jīng)麗水市質(zhì)量檢驗(yàn)檢測(cè)研究院余華麗副主任中藥師鑒定，為胡桃科植物青錢柳Cyclocaryapaliurus(Batal)Iljinsk.的干燥葉(表1)。

表1 青錢柳葉樣品信息

2 方法與結(jié)果

2.1 顯微鑒別

青錢柳葉粉末為黃綠色至綠褐色，非腺毛單細(xì)胞，多碎斷、彎曲，完整者長(zhǎng)60～130 μm，直徑10～20 μm；草酸鈣簇晶較多，單個(gè)散在或存在于薄壁細(xì)胞中，直徑15～30 μm，棱角銳尖；上表皮細(xì)胞不規(guī)則，壁微波狀彎曲。下表皮細(xì)胞多角形，壁波狀彎曲，氣孔橢圓形，周圍有輻射狀紋理，無副衛(wèi)細(xì)胞；腺鱗頭部由8個(gè)細(xì)胞組成，直徑約80 μm，柄短，由2～3個(gè)細(xì)胞組成；網(wǎng)紋導(dǎo)管和具緣紋孔導(dǎo)管直徑約50 μm；纖維成束，細(xì)長(zhǎng)，直徑6～12 μm，紋孔稀疏，見圖1。

注：1.具緣紋孔導(dǎo)管；2.網(wǎng)紋導(dǎo)管；3.氣孔；4.非腺毛；5.纖維；6.草酸鈣簇晶。

2.2 TLC鑒別

取本品粉末1 g，加25%鹽酸溶液-甲醇(1∶4)50 mL，加熱回流1 h，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)尤胍宜嵋阴?0 mL使溶解，濾過，乙酸乙酯液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL溶解，作為供試品溶液。另取槲皮素、山柰酚對(duì)照品，加甲醇制成質(zhì)量濃度為1 mg·mL-1的混合對(duì)照品溶液。吸取上述2種溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以正己烷-乙酸乙酯-甲酸(7∶6∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以三氯化鋁乙醇溶液，105 ℃加熱2 min，置紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。結(jié)果見圖2[比移值(Rf)為0.6～0.7]。

注：S.混合對(duì)照品；1～6.供試品。

2.3 UPLC測(cè)定綠原酸、異槲皮苷、槲皮苷的含量

2.3.1色譜條件 色譜柱：ACQUITY UPLC@HSS T3(100 mm × 2.1 mm，1.8 μm)；流動(dòng)相：乙腈(A)-0.2%磷酸水(B)，梯度洗脫(0～2.5 min，12%～13%A；2.5～3.5 min，13%～18%A；3.5～4.5 min，18%～20%A；4.5～6.2 min，20%～21%A；6.2～7.8 min，21%～28%A；7.8～12 min，28%～50%A；12～13 min，50%～70%A；13～15 min，70%～90%A；15～16 min，90%A)；流速：0.4 mL·min-1；柱溫：40 ℃；樣品溫度：15 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：330 nm；進(jìn)樣量：1 μL。

2.3.2溶液的制備

2.3.2.1對(duì)照品溶液的制備 精密稱取綠原酸、異槲皮苷、槲皮苷對(duì)照品適量，置同一量瓶中，用甲醇稀釋成綠原酸質(zhì)量濃度為449.00 μg·mL-1、異槲皮苷質(zhì)量濃度為330.80 μg·mL-1、槲皮苷質(zhì)量濃度為168.24 μg·mL-1的溶液，作為混合對(duì)照品溶液。

2.3.2.2供試品溶液的制備 取藥材粉末(過三號(hào)篩)約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇水50 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用70%甲醇水補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3.3系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 取上述2種溶液，按2.3.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，見圖3。結(jié)果顯示，在該色譜條件下，綠原酸、異槲皮苷、槲皮苷與其他成分分離度均大于1.5，理論板數(shù)均大于5000。

注：A.混合對(duì)照品；B.青錢柳葉供試品；1.綠原酸；2.異槲皮苷；3.槲皮苷。

2.3.4線性關(guān)系考察 將2.3.2.1項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液用甲醇稀釋制成系列質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液，分別進(jìn)樣測(cè)定，以峰面積(Y)對(duì)質(zhì)量濃度(X)進(jìn)行線性回歸。結(jié)果表明，綠原酸在22.45～449.00 μg·mL-1呈良好的線性關(guān)系，Y=4.913 16X-1 686.237 69(r=0.999 9)；異槲皮苷在16.54～330.80 μg·mL-1呈良好的線性關(guān)系，Y=400 651X-3 954.259 97(r=0.999 9)；槲皮苷在8.41～168.24 μg·mL-1呈良好的線性關(guān)系，Y=4.155 40X-2 572.015 79(r=0.999 9)。

2.3.5精密度試驗(yàn) 精密吸取混合對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算綠原酸、異槲皮苷、槲皮苷峰面積的RSD分別為1.37%、1.18%、1.58%，結(jié)果顯示儀器精密度良好。

2.3.6重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取同一批供試品(編號(hào)：3)，平行取樣6份，制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，按干燥品計(jì)，綠原酸、異槲皮苷、槲皮苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.53%、0.55%、0.74%，RSD分別為1.50%、1.35%、1.43%，表明方法重復(fù)性良好。

2.3.7穩(wěn)定性試驗(yàn) 取2.3.6項(xiàng)下供試品溶液，分別在0、4、8、12、24、48 h進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果綠原酸、異槲皮苷、槲皮苷峰面積的RSD分別為1.75%、1.53%、1.36%，表明供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.8加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的樣品(編號(hào)：3)6份，各0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，分別精密加入綠原酸對(duì)照品溶液(512.02 μg·mL-1)、異槲皮苷對(duì)照品溶液(536.4 μg·mL-1)、槲皮苷對(duì)照品溶液(708.12 μg·mL-1)各5 mL，另精密加入70%甲醇水45 mL，按2.3.2.2項(xiàng)下方法制備回收率試液，進(jìn)樣測(cè)定，并計(jì)算回收率，結(jié)果見表2。

表2 青錢柳葉中3個(gè)成分加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.3.9樣品含量測(cè)定 取表1中12批供試品，照2.3.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜峰，并按干燥品計(jì)，計(jì)算青錢柳葉中綠原酸、異槲皮苷、槲皮苷的含量，結(jié)果見表3。

表3 青錢柳葉中綠原酸、異槲皮苷、槲皮苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)(n=2) %

3 討論

3.1 含量測(cè)定方法考察

提取方法考察了超聲處理法及加熱回流提取法，提取溶劑考察了50%甲醇、70%甲醇、甲醇等。結(jié)果顯示，70%甲醇超聲處理60 min，樣品中3種成分的提取率最高；經(jīng)二極管陣列檢測(cè)器(DAD)掃描，綠原酸、異槲皮苷、槲皮苷在330 nm處紫外吸收均較高，可作為檢測(cè)波長(zhǎng)；本研究采用UPLC進(jìn)行檢測(cè)，可縮短出峰時(shí)間，達(dá)到快速檢測(cè)的效果。

3.2 青錢柳干燥方法考察

考察了同一批青錢柳葉(編號(hào)：5)不同加工方法干燥品的含量。結(jié)果表明，干燥溫度對(duì)各成分含量影響不大；用加熱殺青后再烘干法干燥，綠原酸含量相對(duì)增加，黃酮類成分相對(duì)減少；陰干和曬干方法的干燥品各含量相近，曬干品黃酮類成分含量最高。鑒于曬干或陰干的干燥方法簡(jiǎn)單，且青錢柳有效成分以黃酮類物質(zhì)為主[5-6]，故干燥方法建議采用曬干或陰干。

3.3 采收期對(duì)成分含量的影響

由表3可見，4—10月于青田同一地點(diǎn)采集的青錢柳葉中綠原酸的含量以4月份最高，槲皮苷和異槲皮苷的含量總和以6月份最高，考慮到葉類藥材6月份產(chǎn)量最高，且6月份采集的青錢柳葉泡茶口感較好、澀味少，故建議以6月份為采收期；不同采集地間，各成分的含量有一定的差異，可能與氣候及樹齡等有關(guān)。

本研究建立的青錢柳葉顯微鑒別方法特征性強(qiáng)，TLC鑒別各斑點(diǎn)清晰、分離良好，UPLC含量測(cè)定簡(jiǎn)便快速、準(zhǔn)確度高，均可作為青錢柳葉的質(zhì)量控制方法。若要建立各指標(biāo)成分的限度范圍，還需進(jìn)一步增大樣本量進(jìn)行分析。