忘憂安神方標(biāo)準(zhǔn)煎液HPLC指紋圖譜建立及4種成分含量測(cè)定△

汪莉，賈妙婷，孫天雄，馮慧敏，李玥，祝健鴻，何軍剛，李波，強(qiáng)正澤，李成義

甘肅中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，甘肅 蘭州 730000

傳統(tǒng)湯劑在中醫(yī)臨床應(yīng)用中較為廣泛且療效顯著，但其制備、攜帶不便，服用劑量大。在中藥新劑型的研發(fā)和生產(chǎn)過程中，保證其成品與傳統(tǒng)湯劑的化學(xué)和生物等效性是劑型變革的核心，用適宜的方法和標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)現(xiàn)代制劑質(zhì)量與傳統(tǒng)湯劑的一致性，有助于保障中醫(yī)臨床用藥更加安全有效[1]。標(biāo)準(zhǔn)湯劑、標(biāo)準(zhǔn)煎液、物質(zhì)基準(zhǔn)均是以中醫(yī)理論為指導(dǎo)，保持原方療效為目的，以傳統(tǒng)制法為依據(jù)，經(jīng)統(tǒng)一化、標(biāo)準(zhǔn)化工藝制備而成的制劑中間體[2-4]，在融合現(xiàn)代制備工藝的基礎(chǔ)上極大限度保存了傳統(tǒng)湯劑的完整性，其代表了制劑的整體內(nèi)在質(zhì)量，以這個(gè)中間體為基礎(chǔ)，可實(shí)現(xiàn)對(duì)制劑原料藥的追溯以及向成品制劑的延伸，是經(jīng)典名方乃至所有中藥及其復(fù)方制劑研發(fā)的基準(zhǔn)[5]，可用于評(píng)價(jià)制劑的制備工藝、藥效和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，是現(xiàn)代中藥研究的熱點(diǎn)與發(fā)展趨勢(shì)[6]。

甘麥大棗湯出自醫(yī)圣張仲景的《金匱要略》，為安神劑，具有養(yǎng)心安神、和中緩急之功效，主治情志不舒、思慮過度、躁擾不寧的臟躁癥[7]?，F(xiàn)代研究表明[8]，甘麥大棗湯具有鎮(zhèn)靜、催眠、抗抑郁等藥理作用。忘憂安神方是以經(jīng)典名方甘麥大棗湯為基礎(chǔ)方，由甘肅地產(chǎn)藥材黃花菜及梔子等多味藥食同源的中藥組方而成。方中君藥黃花菜，又名金針菜、忘憂草等，味甘而微涼?！侗静菥V目》記載其有利濕熱、寬胸膈、安五臟、安寐解郁，治酒疸等作用[9]。該藥與方中其他藥合用，共奏滋陰降火、舒肝和胃、養(yǎng)心安神、平衡陰陽(yáng)之功效。對(duì)目前社會(huì)環(huán)境因素影響及工作強(qiáng)度加大導(dǎo)致人群中出現(xiàn)的身體乏力、消化功能減弱、睡眠質(zhì)量下降等亞健康問題具有較好的臨床療效。

本課題組前期已優(yōu)化處方標(biāo)準(zhǔn)煎液提取工藝，方法穩(wěn)定，擬開發(fā)為療效持久、服用劑量小、質(zhì)量穩(wěn)定、攜帶方便、更易于被患者所接受的口服液制劑。為了保證忘憂安神方后續(xù)研發(fā)的口服液制劑能保持原方的療效與特點(diǎn)，有必要建立原組方標(biāo)準(zhǔn)煎液的質(zhì)量控制方法。本研究遵循經(jīng)典名方遵古溯源的研究思路[10]，以復(fù)方標(biāo)準(zhǔn)煎液為切入點(diǎn)，采用高效液相色譜法(HPLC)建立忘憂安神方標(biāo)準(zhǔn)煎液指紋圖譜，通過單味藥及陰性樣品指紋圖譜對(duì)其中的色譜峰進(jìn)行溯源研究，以獲得專屬的、整體的化學(xué)特征綜合信息，并結(jié)合多指標(biāo)成分測(cè)定[11]，建立忘憂安神方全面、有效而切實(shí)可行的質(zhì)量評(píng)價(jià)體系，為后期成品口服液制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究及飲片-標(biāo)準(zhǔn)煎液-成品制劑的量值傳遞相關(guān)性研究奠定基礎(chǔ)，同時(shí)，可為基于中藥標(biāo)準(zhǔn)煎液的中藥臨床驗(yàn)方研究及新藥開發(fā)提供有益的研究經(jīng)驗(yàn)和技術(shù)參考。

1 材料

1.1 儀器

Aglient 1260型二極管陣列檢測(cè)器(DAD)高效液相色譜儀(美國(guó)安捷倫科技有限公司)；CAV214C型電子分析天平(美國(guó)奧豪斯公司)；80-1型電動(dòng)離心機(jī)(金壇市恒豐儀器廠)；YRE-301型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)；98-1-B型電子調(diào)溫電熱套(天津市泰斯特儀器有限公司)；Milli-Q Century型超純水機(jī)。

1.2 試藥

對(duì)照品梔子苷(批號(hào)：Y25J9C53637)、甘草苷(批號(hào)：Z28M10X84164)、槲皮苷(批號(hào)：P19D10F106420)、甘草酸銨(批號(hào)：P13A9L67602)均購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司，純度均≥98%；乙腈(批號(hào)：20200302)、磷酸(批號(hào)：20160307)均購(gòu)自天津大茂化學(xué)試劑廠，均為色譜純。

收集忘憂安神方處方飲片各10批，其中黃花菜購(gòu)于各地藥材市場(chǎng)，其在《中華人民共和國(guó)藥典》(以下簡(jiǎn)稱《中國(guó)藥典》)2015年版中未記載，經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院李成義教授鑒定為百合科萱草屬植物黃花菜HemerocalliscitrinaBaroni的干燥花蕾；其余飲片采購(gòu)于各大零售藥店，經(jīng)前期的鑒定及初步質(zhì)量評(píng)價(jià)，均符合《中國(guó)藥典》2015年版規(guī)定。

2 方法與結(jié)果

2.1 全方含量測(cè)定方法建立

2.1.1色譜條件 色譜柱為Agilent HC-C18(250 mm×4.6 mm，5μm)；流動(dòng)相：乙腈(A)-0.1%磷酸水溶液(B)，梯度洗脫(0～15 min，5%～22%A；15～26 min，22%～34%A；26～34 min，34%～60%A；34～42 min，60%～70%A；42～45 min，70%～5%A)；記錄時(shí)間為 45 min；流速：1 mL·min-1；柱溫：30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：237 nm(梔子苷、甘草苷)、254 nm(槲皮苷、甘草酸)；進(jìn)樣量：10 μL。

2.1.2混合對(duì)照品制備 分別精密稱取梔子苷6.14 mg、甘草苷0.92 mg、槲皮苷1.95 mg、甘草酸銨2.32 mg，置10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，即得質(zhì)量濃度分別為梔子苷614 μg·mL-1、甘草苷92 μg·mL-1、槲皮苷195 μg·mL-1、甘草酸銨232 μg·mL-1的混合對(duì)照品母液，備用。

2.1.3供試品溶液制備 分別稱取忘憂安神方處方飲片隨機(jī)組方 T1～T10，按課題組前期研究標(biāo)準(zhǔn)煎液最佳提取工藝，即加 10倍量水，浸泡1 h，武火煮沸后改用文火，煎煮3次，每次1 h，濾過；合并濾液，濃縮并定容至500 mL(生藥量為0.31 g·mL-1)，得全方標(biāo)準(zhǔn)煎液，精密量取標(biāo)準(zhǔn)煎液2 mL，加70%甲醇8 mL，稱質(zhì)量，超聲30 min，補(bǔ)足減失的質(zhì)量，5000 r·min-1離心10 min(離心半徑8 cm)，上清液過0.45 μm濾膜，既得供試品溶液。

1.學(xué)生明確體育訓(xùn)練目的，形成正確的體育訓(xùn)練動(dòng)機(jī)。體育訓(xùn)練的目的與體育訓(xùn)練的動(dòng)機(jī)是緊密聯(lián)系的。教師應(yīng)重視加強(qiáng)體育訓(xùn)練目的和意義的教育，啟發(fā)引導(dǎo)，注意培養(yǎng)學(xué)生的內(nèi)在動(dòng)力，才能培養(yǎng)學(xué)生體育訓(xùn)練的興趣。只有使學(xué)生形成正確的體育訓(xùn)練動(dòng)機(jī)，才能發(fā)揮學(xué)生的主體作用。

2.1.4方法學(xué)考察

2.1.4.1線性關(guān)系考察 分別精密量取混合對(duì)照品母液 0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、5.0 mL于5 mL量瓶中，甲醇定容，搖勻，得到系列混合對(duì)照品溶液，用 0.45 μm微孔濾膜濾過，進(jìn)樣。以各對(duì)照品的質(zhì)量濃度(X，μg·mL-1)為橫坐標(biāo)，峰面積值(Y)為縱坐標(biāo)，通過計(jì)算，得線性方程，結(jié)果表明，各對(duì)照品在相應(yīng)濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，見表1。

表1 忘憂安神方標(biāo)準(zhǔn)煎液中4種成分的線性關(guān)系

2.1.4.2精密度試驗(yàn) 取T1供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，按2.1.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)，得各指標(biāo)性成分保留時(shí)間RSD均小于1%，峰面積的RSD均小于4%，表明儀器精密度良好。

2.1.4.3穩(wěn)定性試驗(yàn) 取T1供試品溶液，分別在0、4、8、12、24、36 h，按2.1.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)，得各指標(biāo)性成分保留時(shí)間RSD均小于1%，含量RSD均小于3%，表明各指標(biāo)成分在36 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.4.4重復(fù)性試驗(yàn) 取T1供試品溶液6份，按2.1.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)，得各指標(biāo)性成分保留時(shí)間RSD均小于1%，峰面積RSD均小于3%，表明儀器重復(fù)性良好。

2.1.4.5加樣回收率試驗(yàn) 精密量取已知含量的T1標(biāo)準(zhǔn)煎液2 mL，加入適量的各對(duì)照品溶液，按2.1.3項(xiàng)下方法制備，按2.1.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)，計(jì)算4種指標(biāo)成分的平均加樣回收率為95%～105%，RSD均小于3%，見表2。

表2 忘憂安神方標(biāo)準(zhǔn)煎液中4種成分含量測(cè)定的加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

2.2 10批標(biāo)準(zhǔn)煎液含量測(cè)定

取上述10批忘憂安神方標(biāo)準(zhǔn)煎液T1～T10，按照2.1.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照2.1.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行進(jìn)樣分析，記錄色譜峰，分別代入回歸方程，計(jì)算10批忘憂安神方標(biāo)準(zhǔn)煎液中梔子苷、甘草苷、槲皮苷、甘草酸含量，結(jié)果見表3、圖1。結(jié)果表明，10批忘憂安神方標(biāo)準(zhǔn)煎液中梔子苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)為36.84～55.86 mg·g-1、甘草苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.96～6.57 mg·g-1、槲皮苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)4.59～13.76 mg·g-1、甘草酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為16.64～21.14 mg·g-1，不同批次間4種成分含量差異較大，表明不同批次的原藥材質(zhì)量存在差異。

表3 10批忘憂安神方標(biāo)準(zhǔn)煎液中4種成分的含量測(cè)定結(jié)果 mg·g-1

圖1 混合對(duì)照品和忘憂安神方標(biāo)準(zhǔn)煎液供試品溶液的HPLC圖

2.3 全方標(biāo)準(zhǔn)煎液指紋圖譜建立

2.3.2對(duì)照品制備 精密吸取2.1.2項(xiàng)下對(duì)照品母液1 mL，加甲醇定容至5 mL，制成質(zhì)量濃度分別為梔子苷122.8 μg·mL-1、甘草苷18.4 μg·mL-1、槲皮苷39 μg·mL-1、甘草酸銨46.4 μg·mL-1的混合對(duì)照品溶液，既得。

2.3.3供試品溶液制備

2.3.3.1全方供試品制備 分別精密量取2.1.3項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)煎液T1～T10各2 mL，加蒸餾水定容至10 mL，5000 r·min-1離心10 min(離心半徑8 cm)，上清液過0.45 μm濾膜，既得全方指紋圖譜供試品溶液。

2.3.3.2單味飲片溶液制備 按照各單味藥在全方中的配比，分別稱取各單味藥，按2.3.3.1項(xiàng)下方法制備單味飲片供試品溶液。

2.3.3.3陰性樣品溶液制備 分別稱取除各單味藥的其余藥材，按2.3.3.1項(xiàng)下方法，制備缺各單味藥的陰性對(duì)照溶液。

2.3.4方法學(xué)考察

2.3.4.1精密度試驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液(T1)，按2.3.1項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣 6 次，記錄色譜圖。以峰面積較大、出峰時(shí)間穩(wěn)定的梔子苷為參照峰，計(jì)算得到各特征峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD<0.5%，相對(duì)峰面積的RSD<3%，相似度均大于0.99，表明儀器精密度良好。

2.3.4.2穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液(T1)，按2.3.1下色譜條件分別于 0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣，記錄色譜圖。以梔子苷為參照峰，計(jì)算得到各特征峰相對(duì)保留時(shí)間的 RSD<0.5%，相對(duì)峰面積的 RSD<3.0%，相似度均大于0.99，表明供試品溶液在 24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.4.3重復(fù)性試驗(yàn) 精密吸取6份T1的樣品溶液，按2.3.3.1項(xiàng)下方法制備供試品溶液 6 份，再按2.3.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖。以梔子苷為參照峰，計(jì)算得到各特征峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD<0.2%，相對(duì)峰面積的RSD<3.0%，相似度均大于0.99，表明方法具有較好的重復(fù)性。

2.4 10批標(biāo)準(zhǔn)煎液指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)及色譜峰歸屬和指認(rèn)

2.4.1指紋圖譜相似度評(píng)價(jià) 按照2.3.1項(xiàng)下色譜條件，對(duì)10批標(biāo)準(zhǔn)煎液進(jìn)行指紋圖譜測(cè)定，記錄圖譜。將10批標(biāo)準(zhǔn)煎液的指紋圖譜測(cè)定結(jié)果以AIA格式依次導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”(2012年版)，以S1為參照?qǐng)D譜，時(shí)間窗寬度為0.2 s，通過多點(diǎn)校正后，采用平均數(shù)相關(guān)系數(shù)法進(jìn)行圖譜自動(dòng)匹配，生成10批樣品共有模式圖譜，10批標(biāo)準(zhǔn)煎液的 HPLC指紋圖譜及其共有模式圖譜(R)見圖2。進(jìn)行相似度計(jì)算，結(jié)果顯示，10批樣品與對(duì)照指紋圖譜相似度分別為0.985、0.967、0.943、0.988、0.975、0.988、0.989、0.976、0.987、0.995。說明樣品制備方法及所建立指紋圖譜穩(wěn)定可靠，能反映忘憂安神方標(biāo)準(zhǔn)煎液整體特征，可作為其質(zhì)量控制的參照依據(jù)。

圖2 10批忘憂安神方標(biāo)準(zhǔn)煎液指紋圖譜及其對(duì)照指紋圖譜

2.4.2共有峰確立及指標(biāo)成分標(biāo)定 對(duì)10 批次忘憂安神方標(biāo)準(zhǔn)煎液 HPLC 共有模式圖譜進(jìn)行分析后，確定了36個(gè)共有峰。通過與混合對(duì)照品圖譜比對(duì)，確定17號(hào)峰對(duì)應(yīng)梔子苷，24號(hào)峰對(duì)應(yīng)甘草苷，26號(hào)峰為槲皮苷，35號(hào)峰對(duì)應(yīng)甘草酸，見圖3。

注：17.梔子苷；24.甘草苷；26.槲皮苷；35.甘草酸。

2.4.3色譜峰歸屬分析 取各單味藥溶液、陰性供試品溶液、全方供試品溶液，按2.3.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄各色譜圖。將各單味藥、陰性、全方共有模式色譜峰進(jìn)行匹配，同時(shí)比對(duì)各共有峰保留時(shí)間及紫外光譜圖，確定各共有峰歸屬。結(jié)果顯示，各單味藥對(duì)共有峰的貢獻(xiàn)程度有所差異，君藥黃花菜及梔子、甘草、合歡花4味藥對(duì)共有峰貢獻(xiàn)較大，其他各味藥對(duì)共有峰貢獻(xiàn)不大，但在指紋圖譜中均有體現(xiàn)，表明所建立的指紋圖譜可以反映忘憂安神方主要藥效物質(zhì)組成。

3 討論

本研究建立了忘憂安神方中4種成分的 HPLC含量測(cè)定方法及指紋圖譜質(zhì)量評(píng)價(jià)方法，考察確定了指標(biāo)性成分的選擇、提取溶劑、色譜條件。

3.1 指標(biāo)成分選擇

為了與傳統(tǒng)湯劑保持一致，本研究標(biāo)準(zhǔn)煎液的提取以水為溶媒，并結(jié)合與忘憂安神方處方組成相似的復(fù)方制劑相關(guān)的研究及《中國(guó)藥典》2015年版中飲片含量測(cè)定指標(biāo)[12-13]，確定性質(zhì)穩(wěn)定且水溶性較好、含量相對(duì)較高且具有解郁安神作用的梔子苷、甘草苷、槲皮苷、甘草酸4種成分作為含量測(cè)定成分[14-16]，同時(shí)，這4種成分具有較好的專屬性，梔子苷為梔子的指標(biāo)性成分，甘草苷、甘草酸為甘草的指標(biāo)性成分，槲皮苷為合歡花的指標(biāo)性成分，建立其含量測(cè)定的方法，可為后期忘憂安神方中梔子、甘草、合歡花飲片-標(biāo)準(zhǔn)煎液-成品制劑的轉(zhuǎn)移率研究奠定基礎(chǔ)。

3.2 提取溶劑

含量測(cè)定時(shí)分別考察了水、80%甲醇、70%甲醇、60%甲醇、50%甲醇作為提取溶劑，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，70%甲醇作為提取溶劑時(shí)4種成分的含量相對(duì)較高，故最終確定70%甲醇為含量測(cè)定提取溶劑。

3.3 色譜條件

在含量測(cè)定波長(zhǎng)選擇過程中，DAD對(duì)梔子苷、甘草苷、槲皮苷、甘草酸銨對(duì)照品進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描(190～400 nm)，結(jié)果梔子苷、甘草苷在237 nm左右有最大吸收，槲皮苷、甘草酸的最大吸收波長(zhǎng)分別為256、252 nm。綜合分析將237 nm作為梔子苷、甘草苷含量測(cè)定波長(zhǎng)，254 nm作為槲皮苷、甘草酸含量測(cè)定波長(zhǎng)。

由于大多數(shù)化學(xué)成分在254 nm均有紫外吸收，故在指紋圖譜的前期研究過程中選擇254 nm作為指紋圖譜測(cè)定波長(zhǎng)，結(jié)果梔子苷與其他色譜峰相應(yīng)值差別較大，因此，選擇254 nm附近的波長(zhǎng)：250、252、256、258、260、265 nm，最終發(fā)現(xiàn)260 nm下各色譜峰響應(yīng)值均較高，峰形較好且基線平穩(wěn)，故確定指紋圖譜測(cè)定波長(zhǎng)為260 nm。

流動(dòng)相分別考察了乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸、乙腈-0.2%甲酸、乙腈-0.1%甲酸的洗脫效果。結(jié)果乙腈-水的色譜峰的數(shù)量少且峰形不好，加入適量的酸后色譜峰變得豐富，而含0.1%甲酸流動(dòng)相洗脫后色譜峰分離度略優(yōu)于0.1%磷酸。增加甲酸含量至0.2%后，色譜峰峰形及分離度幾乎沒有變化，由于酸性過強(qiáng)容易對(duì)色譜柱造成損耗，最終確定選擇乙腈-0.1%甲酸作為指紋圖譜流動(dòng)相。

目前，很多學(xué)者致力于單味藥材-飲片-標(biāo)準(zhǔn)湯劑-配方顆粒的研究[17-20]，也有少數(shù)學(xué)者對(duì)于經(jīng)典名方標(biāo)準(zhǔn)湯劑(物質(zhì)基準(zhǔn))進(jìn)行研究[21-22]。中藥用藥講求君臣佐使，即復(fù)方配伍的湯劑是中藥用藥的主要形式，本研究以復(fù)方標(biāo)準(zhǔn)煎液為模式標(biāo)準(zhǔn)，選擇指紋圖譜結(jié)合多指標(biāo)成分定量分析的方法，建立忘憂安神方的質(zhì)量控制技術(shù)及評(píng)價(jià)體系，在明確臨床患者所用煎服湯劑的藥學(xué)品質(zhì)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步將這一標(biāo)準(zhǔn)用于后續(xù)的制劑研發(fā)和生產(chǎn)上，通過對(duì)飲片-標(biāo)準(zhǔn)煎液-成品制劑進(jìn)行出膏率、指標(biāo)成分轉(zhuǎn)移率的快速測(cè)定及指紋圖譜相似度分析，實(shí)現(xiàn)對(duì)單味飲片-中間體-成品制劑的量值傳遞相關(guān)性研究及制劑生產(chǎn)全過程質(zhì)量控制，縮小成品制劑的批間差異，以保證制劑的有效物質(zhì)群和質(zhì)量基本穩(wěn)定。另外，通過將各單味飲片中各成分信息與全方標(biāo)準(zhǔn)煎液的比較，能夠更好地提升中藥配伍、組方的科學(xué)性和規(guī)范性。