雙黃連色譜指紋圖譜和譜效關(guān)系研究進(jìn)展*

李 楠，杜怡婷，馬 鑫，李冬梅

（華北理工大學(xué)藥學(xué)院，河北唐山 063210）

0 引 言

中藥是中華民族的瑰寶，是中國(guó)特色和文化自信的組成部分.中藥品質(zhì)是中藥臨床用藥安全有效的基礎(chǔ)，亦是保障中藥產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的生命線，直接關(guān)乎中藥標(biāo)準(zhǔn)化和國(guó)際化發(fā)展.中藥質(zhì)量控制具有一定難度，這是因?yàn)橹兴幎嗑咭詮?fù)方制劑和多成分給藥的特點(diǎn)，即“多組分、多靶點(diǎn)和多通路”［1］，其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)也從過(guò)去的定性鑒別為主，發(fā)展到同時(shí)測(cè)定多成分、多靶點(diǎn)的整體質(zhì)量評(píng)價(jià).近年來(lái)，一測(cè)多評(píng)法、中藥指紋圖譜技術(shù)、快速檢測(cè)技術(shù)和仿生技術(shù)等多種現(xiàn)代分析方法和技術(shù)廣泛應(yīng)用于中藥質(zhì)量控制研究［2］，使其朝著標(biāo)準(zhǔn)化、現(xiàn)代化和全面化的方向發(fā)展.

中藥色譜指紋圖譜技術(shù)指中藥經(jīng)適當(dāng)前處理后，采用色譜分析方法，得到能夠標(biāo)示其化學(xué)特征的色譜圖［3］.該技術(shù)能夠很好地反映中藥品質(zhì)的真實(shí)性、一致性和穩(wěn)定性，得到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的普遍認(rèn)可.為進(jìn)一步將中藥所含化學(xué)成分和其藥效相關(guān)聯(lián)，建立能夠通過(guò)色譜指紋圖譜而預(yù)測(cè)其藥效的質(zhì)量控制和評(píng)價(jià)新模式［4］，譜效關(guān)系的研究應(yīng)運(yùn)而生［5-6］.有關(guān)中藥譜效關(guān)系的研究論文不多，柯昌虎等［7］從色譜指紋圖譜、光譜指紋圖譜和聯(lián)用技術(shù)指紋圖譜等方面對(duì)金銀花指紋圖譜的研究方法進(jìn)行歸納總結(jié)，為制定科學(xué)可靠的金銀花質(zhì)量評(píng)價(jià)體系提供依據(jù)；王常瞵等［8］對(duì)中藥黃芩色譜指紋圖譜、光譜指紋圖譜和生物指紋圖譜的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，為合理評(píng)價(jià)和控制黃芩藥材品質(zhì)提供依據(jù).

雙黃連是一味由金銀花、黃芩和連翹組成的中成藥，具有疏風(fēng)解表、清熱解毒的功效，作為臨床常用藥，具有廣泛的抗菌、消炎和解毒作用，如抑制肺炎雙球菌，治療小兒支原體肺炎、小兒皰疹性咽峽炎，治療口腔潰瘍甚至有抗結(jié)腸癌的活性等［9］.目前，尚未見雙黃連指紋圖譜和譜效關(guān)系方面的綜述報(bào)道.為了建立全面、系統(tǒng)的雙黃連質(zhì)量控制和評(píng)價(jià)體系，以指導(dǎo)其臨床用藥.本文從不同劑型雙黃連樣品的前處理方法，不同色譜分析方法對(duì)其色譜指紋圖譜的研究方法進(jìn)行歸納整理，分析目前雙黃連譜效關(guān)系研究進(jìn)展，并對(duì)其發(fā)展前景進(jìn)行展望.

1 雙黃連樣品前處理

臨床常用雙黃連劑型有口服液、注射劑、片劑、顆粒劑、膠囊劑和凝膠劑等，不同劑型的樣品前處理方法略有不同.

1.1 口服液

雙黃連口服液型樣品前處理方法主要是通過(guò)溶劑對(duì)樣品進(jìn)行稀釋或稀釋、過(guò)濾后備用.如陳?。?0］將400μL雙黃連口服液置于25 mL的容量瓶中并加入體積分?jǐn)?shù)為50%（文中如無(wú)特殊說(shuō)明時(shí)均為體積分?jǐn)?shù)）甲醇溶劑，超聲20 min后室溫放置，再次加入50%甲醇定容后搖勻，以此作為供試品備用.馮宏玲等［11］取10支雙黃連口服液混合，量取500μL混合液置于10 mL容量瓶中，同樣加入50%甲醇進(jìn)行定容，搖勻后用0.45 μm微孔濾膜進(jìn)行濾過(guò)；王新宏等［12］取雙黃連口服液5支，混勻后量取500μL用50%甲醇定容至10 mL，作為供試品溶液備用.

1.2 注射劑

雙黃連凍干粉類注射劑型通常需要經(jīng)溶劑溶解，之后前處理方法類似于口服液的處理方法.如郭潔等［13］選擇雙黃連凍干粉制備供試品溶液，取適量樣品至10 mL容量瓶，用30%甲醇定容，超聲分散備用；Luan等［14］直接將雙黃連注射液經(jīng) 0.45 μm尼龍膜過(guò)濾后，進(jìn)行樣品分析；Zhang等［15］首先用50%甲醇稀釋雙黃連注射液，再以0.22 μm濾膜進(jìn)行濾過(guò)后備用.

1.3 片劑

雙黃連片劑型樣品前處理方法是通過(guò)對(duì)樣品研磨、超聲溶解和過(guò)濾后備用.如唐佩琴［16］取雙黃連片劑研細(xì)后，稱質(zhì)量為1.0 g，置于50 mL棕色容量瓶中并加入60%甲醇，恒溫超聲45 min后，待樣品溫度降至室溫，繼續(xù)加60%甲醇定容并搖勻、過(guò)濾后備用；趙洪濤等［17］取20片雙黃連片劑于研缽中研細(xì)，稱取粉末0.2 g，用50%甲醇/水溶解，超聲30 min后，再用50%甲醇/水補(bǔ)齊溶液至10 mL，0.45 μm濾膜過(guò)濾，得到待分析供試品溶液.

1.4 顆粒劑

雙黃連顆粒劑型樣品前處理方法類同于片劑.如周志等［18］取3袋雙黃連顆粒的內(nèi)容物，研細(xì)后，稱取1.0 g，置具塞錐形瓶中，加50%甲醇并超聲處理20 min，最后用 0.45 μm濾膜過(guò)濾備用；高利利等［19］也是將雙黃連顆粒研細(xì)后，采用溶劑溶解，過(guò)濾除雜等，制得待測(cè)樣品.

1.5 膠囊劑

雙黃連膠囊劑型樣品在分析時(shí)取膠囊內(nèi)的內(nèi)容物，后續(xù)樣品處理方法與片劑和顆粒劑類似，也可采用溶劑回流提取的樣品前處理方法.如王建會(huì)和孫國(guó)祥［20］取5粒雙黃連膠囊的內(nèi)容物，稱質(zhì)量后置于25 mL容量瓶中，甲醇溶解，超聲分散30 min后冷卻至室溫，再用甲醇定容至刻度，離心后取上清液，用0.45 μm濾膜過(guò)濾得到待測(cè)溶液；張紅偉等［21］取膠囊內(nèi)容物1.0 g，用70%乙醇加熱回流，過(guò)濾后將沉淀洗滌2次，合并上清液，通過(guò)AB-8型大孔徑樹脂柱分離純化，用水和70%乙醇梯度洗脫，洗脫液濃縮成干膏，再用甲醇溶解定容至100 mL，最后以0.20 μm濾膜過(guò)濾得供試液.

1.6 凝膠劑

雙黃連凝膠劑型樣品需用適宜溶劑超聲溶解，再經(jīng)過(guò)濾后備用.如陳兩綿等［22］取雙黃連凝膠劑約0.7 g，置于50 mL容量瓶中，加適量50%甲醇，超聲使其溶解，放置室溫后，用50%甲醇定容至刻度，搖勻后0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，取濾液作為供試品溶液；趙永慧等［23］同樣選取雙黃連凝膠為樣品，處理步驟與上述類似，不同的是溶劑使用乙腈/水（體積比為27∶73）進(jìn)行溶解，得到待測(cè)樣品.

2 色譜指紋圖譜

色譜指紋圖譜分析雙黃連的方法主要有液相色譜（liquid chromatography，LC）及其聯(lián)用、薄層色譜（thin-layer chromatography，TLC）、氣相色譜（gas chromatography，GC）和毛細(xì)管電泳（capillary electrophoresis，CE）等方法.

2.1 LC

常用LC及聯(lián)用方法主要包括高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）、高效液相色譜-二極管陣列聯(lián)用技術(shù)（HPLC-photo-diode array，HPLC-PDA）、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（HPLC-mass spectrometry，HPLC-MS）、高效液相色譜-電噴霧電離串聯(lián)質(zhì)譜（HPLC-electrospray ionization-MS，HPLC-ESI-MS）、超高效液相色譜（ultra performance liquid chromatography，UPLC）、超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（UPLC-MS）和超高效液相色譜-電噴霧電離串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-ESI-MS）等.

2.1.1 HPLC及其聯(lián)用方法

HPLC因具有高壓、高效和高靈敏度的優(yōu)點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用于中藥質(zhì)量控制檢測(cè)［24-25］.其原理是依據(jù)各組分在流動(dòng)相中的吸附性能和分配系數(shù)不同而進(jìn)行分離，并進(jìn)入檢測(cè)器檢驗(yàn)，實(shí)現(xiàn)試樣分析.至今，許多學(xué)者已采用該技術(shù)，對(duì)多種劑型的雙黃連進(jìn)行檢測(cè)分析，為雙黃連的質(zhì)量控制帶來(lái)了新的可能.以下圍繞HPLC、HPLC-MS及HPLC-ESI-MS等方法在雙黃連色譜指紋圖譜分析中的研究情況展開綜述.

陳?。?0］采用HPLC對(duì)10批雙黃連口服液的藥用成分進(jìn)行了檢驗(yàn)，在100.0 g雙黃連產(chǎn)品中分析黃芩、連翹和金銀花，3種主成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為25%、50%和25%，其中連翹的占比最大，且連翹苷和連翹脂苷在相應(yīng)的范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系，研究得出不同批次的雙黃連口服液品質(zhì)差異較小；馮宏玲等［11］采用HPLC建立了雙黃連口服液化學(xué)成分的指紋圖譜，設(shè)置柱溫為30℃，流動(dòng)相為甲醇/冰乙酸，流速為1.0 mL/min，梯度洗脫，同時(shí)分離黃芩苷、連翹苷和綠原酸，其分析速率較藥典法明顯提高，以此提供了簡(jiǎn)便易行的雙黃連多組分同時(shí)分離新方法；郭潔等［13］建立雙黃連凍干粉指紋圖譜并進(jìn)行研究，以流動(dòng)相乙腈/甲酸梯度洗脫，設(shè)置流速為1.0 mL/min、柱溫為25℃、檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm、洗脫時(shí)間為25 min時(shí)，結(jié)果檢測(cè)到21個(gè)色譜峰，并對(duì)7個(gè)色譜峰進(jìn)行了歸屬，較為全面地反映了雙黃連凍干粉所含的化學(xué)成分，有利于對(duì)其質(zhì)量控制與評(píng)價(jià)；武煊［26］對(duì)10批獸用雙黃連注射液HPLC指紋圖譜進(jìn)行了研究，流動(dòng)相采用乙腈/乙酸，檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm，檢測(cè)到16個(gè)共有峰，并對(duì)黃芩苷、連翹苷和綠原酸的含量進(jìn)行了測(cè)定，該實(shí)驗(yàn)為后期中獸藥的品質(zhì)研究提供了很大的幫助；周志等［18］建立雙黃連顆粒HPLC指紋圖譜并進(jìn)行探究（圖1），流動(dòng)相為乙腈/甲酸/水溶液，流速為1.0 mL/min，柱溫為35℃，檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm，檢測(cè)出12批顆粒的圖譜相似度≥0.998，得到共有色譜峰18個(gè)，確定了7個(gè)特征峰譜的歸屬，該方法穩(wěn)定性好、重現(xiàn)性好，為雙黃連顆粒質(zhì)量控制與評(píng)價(jià)提供了依據(jù).

圖1 雙黃連顆粒與各單味藥的高效液相色譜（HPLC）［18］

PDA目前已廣泛應(yīng)用于HPLC分析中，應(yīng)用其作為檢測(cè)器的優(yōu)點(diǎn)是可進(jìn)行全波長(zhǎng)測(cè)定，并可在多通道模式進(jìn)行分析，同時(shí)給出紫外吸收光譜和色譜圖，便于組分定性和定量分析.王新宏等［12］對(duì)不同廠家的雙黃連口服液和同一廠家的不同批號(hào)雙黃連片劑的數(shù)字化色譜指紋圖譜進(jìn)行研究，以乙腈/乙酸/水溶液作流動(dòng)相梯度洗脫，流速1.0 mL/min，柱溫為室溫，采用PDA檢測(cè)器，在檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm時(shí)，鑒定了金銀花、連翹和黃芩3種藥材，且不同批號(hào)的圖譜顯示，每一批號(hào)片劑總色譜峰為28個(gè)，3個(gè)以上批號(hào)都出現(xiàn)的峰為23個(gè)，其色譜峰個(gè)數(shù)重疊率＞82%，該實(shí)驗(yàn)采用1次進(jìn)樣進(jìn)行測(cè)定，證實(shí)HPLC-PDA檢測(cè)方法既簡(jiǎn)便又穩(wěn)定，為雙黃連制劑和中藥材的測(cè)定提供可行的新方法.

HPLC-MS聯(lián)用技術(shù)適用于極性強(qiáng)、揮發(fā)度低、相對(duì)分子質(zhì)量大及熱不穩(wěn)定的混合有機(jī)物體系，更利于復(fù)雜物質(zhì)的分離與檢測(cè).Han等［27］利用HPLCMS結(jié)合RBL-2H3/CMC柱層析，建立雙黃連注射液中潛在過(guò)敏成分的二維分析體系，在保證具有良好重現(xiàn)性的基礎(chǔ)上分析出雙黃連潛在過(guò)敏成分——黃芩苷，該方法成功地實(shí)現(xiàn)了雙黃連注射液中潛在過(guò)敏成分黃芩苷的篩選.

ESI是一種產(chǎn)生氣相離子的軟電離技術(shù)，可同時(shí)提供精確的相對(duì)分子質(zhì)量和碎片結(jié)構(gòu)信息，且可與各種色譜聯(lián)用，特別適合于復(fù)雜樣品分析.Zhang等［15］采用HPLC-ESI-MS建立雙黃連注射液的色譜指紋圖譜（圖2），研究分析得出黃芩苷和蘆丁都會(huì)促進(jìn)組胺的釋放進(jìn)而引起過(guò)敏反應(yīng)，此結(jié)果科學(xué)有效地揭示了雙黃連注射液的過(guò)敏原因；羅奇志和羅佳波［28］利用HPLC-ESI-MS得到雙黃連粉針劑的總離子流圖，分析了雙黃連粉針中的化學(xué)成分，采用全離子模式進(jìn)行掃描，流動(dòng)相為乙腈/水溶液，結(jié)果確定了18種化合物的相對(duì)分子質(zhì)量，鑒定出9種化合物，除檢測(cè)到已有報(bào)道的黃芩苷、連翹苷、綠原酸和咖啡酸等，還分析到未曾報(bào)道的奎尼酸（來(lái)自金銀花）；Luo等［29］利用HPLC-ESI-MS聯(lián)用技術(shù)，在總離子流圖中檢測(cè)到43個(gè)色譜峰（圖3），并對(duì)雙黃連粉針劑中的各個(gè)成分進(jìn)行了歸屬，其中21個(gè)峰來(lái)自金銀花，20個(gè)峰來(lái)自連翹，4個(gè)峰來(lái)自黃芩（金銀花和連翹有共有峰）；王有志等［30］利用HPLC-ESI-MS首先得出奎寧酸標(biāo)準(zhǔn)品的MS圖和離子掃描圖（圖4），依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)得雙黃連粉針劑供試液中奎寧酸的含量，為紫外吸收能力弱的奎尼酸的含量測(cè)定找到了可行的辦法.

圖2 不同批次雙黃連注射液的HPLC指紋圖譜［15］

注：數(shù)字為峰編號(hào).圖3 不同性狀雙黃連的離子掃描［29］（a）雙黃連粉針供試液；（b）自制雙黃連粉針提取物；（c）金銀花與連翹合煎提取物；（d）金銀花提取物；（e）連翹提取物；（f）黃芩提取物

圖4 奎寧酸標(biāo)準(zhǔn)品的檢測(cè)圖譜［30］

2.1.2 UPLC及其聯(lián)用方法

UPLC與HPLC的原理基本相同，但前者的分析速度更快，與MS聯(lián)用后表現(xiàn)出更加優(yōu)異的性能.石朗等［31］在對(duì)雙黃連制劑進(jìn)行UPLC-MS指紋圖譜分析的同時(shí)，建立了雙黃連中間體指紋圖譜，在雙黃連制劑和中間體圖譜中都找到了指認(rèn)的3個(gè)共有峰，表明其相關(guān)性良好，為雙黃連高效、全面的質(zhì)量控制提供了參考.

UPLC-MS同樣可選用ESI作為電離源，提高分析的靈敏度和選擇性.劉雪紅等［32］建立雙黃連口服液UPLC-MS指紋圖譜，同時(shí)測(cè)定黃芩苷、連翹苷和綠原酸的含量，以甲酸/水/乙腈為流動(dòng)相，在ESI負(fù)離子模式多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式下進(jìn)行檢測(cè)，相較之前HPLC或HPLC-MS技術(shù)，該方法可同時(shí)測(cè)定3種有效成分的含量，結(jié)果更快速、更高效、更準(zhǔn)確且重現(xiàn)性好；張紅偉等［21］同樣采用 UPLC-ESI-MS方法，對(duì)以上3種有效成分同時(shí)測(cè)定，以醋酸鈉/甲醇為流動(dòng)相，在ESI正離子模式下進(jìn)行檢測(cè)，得出第1、2和3批雙黃連膠囊提取液樣品中綠原酸、黃芩苷和連翹苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)依次為 15.32、149.00和 4.05，16.05、158.00和 4.11，15.89、143.00 和4.14 mg/g，為雙黃連膠囊的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供了簡(jiǎn)單、快速的檢測(cè)方法；Yan等［33］利用UPLC-ESI-MS方法，在正離子和負(fù)離子2種ESI模式下對(duì)雙黃連的成分進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果得到46個(gè)峰并對(duì)其進(jìn)行了歸屬，結(jié)合背景減法為研究雙黃連的代謝產(chǎn)物提供了依據(jù)，有助于檢測(cè)雙黃連的活性成分.

2.2 TLC

TLC是將適宜的固定相（如硅膠、氧化鋁等）涂布在玻璃板或塑料等基片上，制成均勻薄層.待點(diǎn)樣后并選用合適的展開劑進(jìn)行展開后，與對(duì)照物的比移值進(jìn)行對(duì)比分析的一種分離檢測(cè)技術(shù).該技術(shù)具有簡(jiǎn)便、高效的特點(diǎn).

肖宏華等［34］利用TLC對(duì)雙黃連口服液中的金銀花進(jìn)行鑒別，以乙酸乙酯/丙酮/甲酸/水（體積比為7∶3∶1∶1）作為展開劑，分別采用金銀花中的木犀草苷和綠原酸，山銀花中的灰氈毛忍冬皂苷乙、川續(xù)斷皂苷乙作為特征成分，通過(guò)比較圖譜中熒光條斑的有無(wú)和深淺，成功鑒別金銀花中是否摻入山銀花；程建國(guó)等［35］曾對(duì)《中華人民共和國(guó)獸藥典2000年版》［36］和《中華人民共和國(guó)獸藥典 2005年版》［37］收載的2種雙黃連口服液成分的TLC方法進(jìn)行了比較，結(jié)果前者的斑點(diǎn)更清晰，分離得更好，后者沒(méi)有顯示任何斑點(diǎn)，所以其推薦使用2000年版.李宇偉和連瑞麗［38］在用正交試驗(yàn)法優(yōu)選雙黃連口服液時(shí)，采用TLC對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行確證，分別對(duì)處方中的金銀花、黃芩和連翹進(jìn)行鑒別，TLC中供試品與對(duì)照品及對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上呈相同顏色的熒光斑點(diǎn)（圖5），而陰性對(duì)照則無(wú)此斑點(diǎn).該方法操作簡(jiǎn)便，重現(xiàn)性好，結(jié)果可靠，利于雙黃連口服液及其中間產(chǎn)品的質(zhì)量控制.

注：數(shù)字指不同樣品點(diǎn).圖5 雙黃連中3種中藥材的TLC指紋圖譜［38］（a）金銀花；（b）黃芩；（c）連翹

2.3 GC

GC法適用于有揮發(fā)性且不易分解的化合物的分離和分析，該方法具有分離效率高、速度快、樣品量少、靈敏度高和選擇性高等優(yōu)點(diǎn).

茹鑫等［39］建立GC指紋圖譜和標(biāo)準(zhǔn)譜對(duì)照?qǐng)D（圖6），對(duì)雙黃連口服液中的可揮發(fā)物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)和分析，結(jié)果共檢測(cè)出96種揮發(fā)性物質(zhì)，并歸屬了43種化合物，為雙黃連的質(zhì)量控制提供了有力依據(jù)；王栗等［40］利用GC法對(duì)雙黃連粉針劑中的農(nóng)藥殘留進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果檢測(cè)到連翹、黃芩和金銀花中均含微量的有機(jī)氯農(nóng)藥，但遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于我國(guó)對(duì)糧食中農(nóng)藥殘留規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)，該方法利于雙黃連的用藥安全性檢測(cè).

注：S1～S10是10批相同濃度的雙黃連注射液編號(hào)；R是參比色譜.圖6 雙黃連注射液的檢測(cè)圖譜［39］（a）氣相色譜指紋圖譜；（b）標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照譜

2.4 CE

CE技術(shù)是依據(jù)樣品中各組分之間的淌度和分配行為的差異來(lái)進(jìn)行分離，主要用來(lái)分析在毛細(xì)管緩沖溶液中能離解為離子的物質(zhì).CE具有多種模式，如毛細(xì)管電泳色譜法（capillary electrochromatography，CEC）和膠束電動(dòng)毛細(xì)管色譜法（micellar electrokinetic capillary chromatography，MEKC）等，該方法既能分離離子又能分離中性分子.

CEC是CE與HPLC相結(jié)合的一種快速、高效的分離方法，利用緩沖溶液的電滲流作為泵，具有操作簡(jiǎn)單、成本低和毛細(xì)管柱壽命長(zhǎng)的優(yōu)點(diǎn)，但是靈敏度稍遜于高效液相色譜.孫國(guó)祥等［41］建立了雙黃連膠囊雙波長(zhǎng)CEC指紋圖譜，以50 mmol/L硼砂（含20 mmol/L β環(huán)糊精和5%乙腈，溶液pH 7.55）為背景電解質(zhì)，電壓為12 kV，檢測(cè)波長(zhǎng)為203和256 nm，分別檢測(cè)出16和11個(gè)共有指紋峰，為雙黃連的質(zhì)量控制提供了新依據(jù)；呂元琦等［42］建立CEC圖（圖7），分離并檢測(cè)到以上3種成分，還測(cè)得了黃芩甙元的含量；Luan等［43］通過(guò)建立高效CEC方法，對(duì)雙黃連中的重金屬（Cd2+、Cr3+、Cu2+和 Zn2+）進(jìn)行了有效測(cè)定，為雙黃連中重金屬離子的安全性進(jìn)行把控.

圖7 雙黃連口服液毛細(xì)管電泳色譜［42］

MEKC是毛細(xì)管區(qū)帶電泳與膠束液相色譜相結(jié)合而發(fā)展的方法，具有分離速度快、分離效率高和毛細(xì)管柱不易被污染等優(yōu)點(diǎn).Zhou等［44］采用MEKC對(duì)雙黃連進(jìn)行品質(zhì)評(píng)價(jià)，以硼酸鹽/二氫磷酸鈉/十二烷基硫酸鈉為緩沖液，甲醇和乙腈為有機(jī)改性劑，電壓為15 kV.對(duì)雙黃連中黃芩素、黃芩苷、綠原酸、漢黃芩素、黃芩素、連翹苷和金絲桃苷等7種主要成分進(jìn)行定量測(cè)定，為提高雙黃連制劑的整體分析和質(zhì)量控制提供依據(jù).

3 譜效學(xué)

譜效關(guān)系的研究是數(shù)學(xué)相關(guān)分析與藥學(xué)的一個(gè)交叉應(yīng)用，因此，一方面需要鑒定色譜指紋圖譜中的主要化學(xué)成分，在此基礎(chǔ)上通過(guò)譜效學(xué)研究揭示特征色譜峰；另一方面運(yùn)用合理的數(shù)據(jù)處理分析方法，主要包括相關(guān)分析、回歸分析、主成分分析、典型相關(guān)分析、聚類分析和灰度關(guān)聯(lián)度分析等，實(shí)現(xiàn)數(shù)學(xué)相關(guān)分析與色譜指紋圖譜的關(guān)聯(lián).目前，雙黃連的譜效關(guān)系研究仍處于初步探索階段，已形成一定的研究思路和模式.劉廷等［45］首次把HPLC色譜指紋圖譜與雙黃連對(duì)H1N1流感病毒致犬腎（Madin-Darby canine kidney，MDCK）細(xì)胞損傷的保護(hù)作用聯(lián)系起來(lái)，通過(guò)HPLC數(shù)據(jù)和藥效數(shù)據(jù)的SPSS分析，得出17個(gè)特征色譜共有峰，其中與該保護(hù)作用關(guān)系較大的峰有5個(gè)（3個(gè)峰對(duì)應(yīng)金銀花，2個(gè)峰對(duì)應(yīng)連翹），得出雙黃連中可以保護(hù)H1N1流感病毒致MDCK細(xì)胞損傷的成分為雙黃連和連翹，該實(shí)驗(yàn)將雙黃連的療效與圖譜結(jié)合，有效地分析出發(fā)揮藥理作用的化學(xué)成分，為后期雙黃連療效與圖譜的結(jié)合提供思路，并奠定了雙黃連譜效學(xué)研究的基礎(chǔ)；王建明和趙楚文［46］利用HPLC法測(cè)定雙黃連中連翹苷的含量，再以大鼠為研究對(duì)象并設(shè)立實(shí)驗(yàn)組、模型組和對(duì)照組，采用不同方式處理后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果證實(shí)，先給予雙黃連的大鼠在體溫升高后有明顯的下降趨勢(shì)，驗(yàn)證了雙黃連中的連翹苷成分有退熱的效果，即該方法成功地探索出雙黃連中與H1N1流感病毒致MDCK細(xì)胞損傷作用和退熱作用相對(duì)應(yīng)的有效成分.

雙黃連作為一種中成藥，其化學(xué)成分的構(gòu)成并不能代表在體內(nèi)產(chǎn)生生物效應(yīng)的化學(xué)形式，色譜指紋圖譜與譜效學(xué)的研究可以有效地闡釋藥物效應(yīng)動(dòng)力學(xué)，有利于雙黃連品質(zhì)的控制與評(píng)價(jià).雙黃連是一個(gè)多組分、多靶點(diǎn)和多作用途徑的復(fù)雜體系，用精確的處理方法處理模糊的中藥成分和藥效關(guān)系尚且存在一定的局限性，色譜指紋圖譜技術(shù)目前只能部分解決對(duì)共有峰成分的鑒定，體現(xiàn)某個(gè)組分與藥效的相關(guān)性，而每個(gè)成分及成分之間的相互作用或協(xié)同作用沒(méi)有闡述清楚，導(dǎo)致成分與功效只能達(dá)到部分相關(guān)，而未能實(shí)現(xiàn)完全相關(guān).

2020年1月31日，中國(guó)科學(xué)院上海藥物研究所和武漢病毒研究所開展的聯(lián)合研究表明，雙黃連口服液可抑制新型冠狀病毒肺炎（COVID-19）［47］，目前為止，該結(jié)果尚未納入COVID-19的診治方案中，其療效有待于進(jìn)一步的思考與研究.因此，進(jìn)行雙黃連的譜效學(xué)的研究是大有裨益的.目前，有關(guān)中藥譜效學(xué)理論的研究方向及方法主要包括［48-51］：通過(guò)藥物信息學(xué)方法尋找藥效成分，建立多組分藥效預(yù)測(cè)模型，對(duì)藥效組分配伍進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計(jì)，構(gòu)建藥效作用的多因素調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)模型，探索多種藥效組分協(xié)同作用機(jī)制；建立與動(dòng)物（人）“證”模型相對(duì)應(yīng)的狀態(tài)函數(shù)關(guān)系式的現(xiàn)代中醫(yī)藥數(shù)理表述體系，根據(jù)特性蛋白質(zhì)與效應(yīng)體（藥物）的齒合關(guān)系，按親和色譜，以效應(yīng)體靶向分離物——特性蛋白質(zhì)為固定相，采用LC聯(lián)用技術(shù)，建立品質(zhì)或效應(yīng)指紋圖譜.因此，接下來(lái)的研究需要一方面建立雙黃連多組分藥效預(yù)測(cè)模型，對(duì)藥效進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計(jì)，探索多種藥效組分協(xié)同作用機(jī)制；另一方面建立動(dòng)物（人）“證”模型相對(duì)應(yīng)的狀態(tài)函數(shù)關(guān)系式，根據(jù)特性蛋白質(zhì)與雙黃連藥效成分的齒合關(guān)系，采用LC聯(lián)用技術(shù)建立質(zhì)量或效應(yīng)指紋圖譜.

在現(xiàn)有的探索研究中，面臨的難題主要包括：建立高重復(fù)性和高精度的適用于進(jìn)行生物測(cè)定的方法難度高，這與生物個(gè)體的復(fù)雜性和待分析樣品的復(fù)雜性有關(guān)；將指紋圖譜所獲取的化學(xué)成分特征信息與生物效應(yīng)相關(guān)信息進(jìn)行關(guān)聯(lián)具有一定的困難；化合物對(duì)照品數(shù)量有限，部分樣品價(jià)格昂貴；部分檢驗(yàn)部門的硬件設(shè)施不夠，難以滿足實(shí)驗(yàn)要求.

4 結(jié)束語(yǔ)

不同劑型雙黃連樣品的前處理方法中，通常以甲醇/水進(jìn)行溶解，也可選用乙腈/水體系，且多借助超聲助溶，其中片劑和顆粒劑因其粒徑相對(duì)較大，需研磨后再進(jìn)行溶解，在色譜分析前多采用微孔濾膜進(jìn)行過(guò)濾.色譜指紋圖譜作為中藥質(zhì)量控制的關(guān)鍵技術(shù)在雙黃連品質(zhì)評(píng)價(jià)中有著舉足輕重的地位，色譜相關(guān)的方法（LC、TLC、GC和CE）可以有效地對(duì)雙黃連中間體及其成品進(jìn)行成分鑒定和品質(zhì)檢測(cè)，可用于生產(chǎn)工藝與流程的監(jiān)管.目前有關(guān)雙黃連譜效關(guān)系的研究遠(yuǎn)不能滿足實(shí)際需求.因此，仍需依據(jù)不同研究目的建立雙黃連色譜指紋圖譜與相應(yīng)藥效的關(guān)聯(lián)，進(jìn)一步探索其應(yīng)用.

當(dāng)前，中藥色譜指紋圖譜與譜效關(guān)系的研究逐漸增多，主要包括對(duì)中藥的品質(zhì)評(píng)價(jià)，提取與純化，炒炭前后的作用等，但是由于譜效學(xué)的發(fā)展時(shí)間短暫，目前理論體系不夠完善，技術(shù)尚有不足，從研究成分到藥效再到臨床應(yīng)用之間尚有一定距離，未來(lái)仍需不斷地發(fā)展與完善，為實(shí)現(xiàn)中藥的現(xiàn)代化和國(guó)際化而努力.