食管鱗狀細胞癌組織中β-catenin、LEF1的表達變化及其意義

米優(yōu)嘉，原翔，賈瑞諾，閆錦陽，郭藝博，高社干

1河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院，河南洛陽471000；2河南科技大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院；3河南省腫瘤表觀遺傳重點實驗室

食管鱗狀細胞癌（ESCC）是臨床常見的惡性腫瘤之一，具有侵襲性強、預(yù)后差的特點。近年來，ES?CC在診斷和治療方面取得了進展，但根治性切除術(shù)后的復(fù)發(fā)率約為50%，總體5年生存率仍不容樂觀［1］。β-連環(huán)蛋白（β-catenin）是Wnt通路中的關(guān)鍵因子，Wnt/β-catenin信號通路的異常激活將導(dǎo)致β-catenin在細胞核中顯著增加，從而引發(fā)細胞過度增殖和惡性轉(zhuǎn)化［2］。淋巴細胞結(jié)合增強因子1（LEF1）是LEF/T細胞因子家族的成員之一，以轉(zhuǎn)錄因子著稱，在造血中起著關(guān)鍵作用。在細胞癌變過程中，β-catenin因Wnt信號通路激活從細胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細胞核，并與T細胞因子（TCF4）和LEF1的成員結(jié)合，成為轉(zhuǎn)錄的中心介體，TCF4-β-catenin復(fù)合物可能調(diào)節(jié)LEF1的轉(zhuǎn)錄，并可能導(dǎo)致腫瘤的形成及進展［3］。β-catenin與LEF1的表達被認為是口咽癌［4］、肺腺癌［5］不良的預(yù)后因素，并且與較短的生存期相關(guān)。然而有關(guān)β-catenin與LEF1在食管黏膜癌變進展過程中的作用研究甚少。本研究觀察了ESCC組織中β-catenin、LEF1的表達變化，并探討其意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2018年1月—2020年1月河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院收治的ESCC患者97例，男58例，女39例；年齡≤60歲33例，＞60歲64例；腫瘤直徑≥5 cm 88例，＜5 cm 9例；侵及外膜層57例，侵及肌層及黏膜下層40例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移21例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移76例；高中分化58例，低分化37例。所有患者均未接受過放化療及生物免疫治療。手術(shù)留取ESCC組織97例份，另選癌前病變組織40例（低級別上皮內(nèi)瘤變19例，高級別上皮內(nèi)瘤變21例）、食管癌旁（距瘤體5 cm以上）正常黏膜組織20例份作對照。本研究征得患者及家屬知情同意并簽署知情同意書，并獲得醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2 食管組織β-catenin、LEF1檢測方法 取各組織標(biāo)本，在10%中性甲醛中浸泡固定，石蠟包埋處理，按照3μm厚度為標(biāo)準連續(xù)切片，放入溫度為60℃的烤箱內(nèi)恒溫烘烤4～6 h干燥保存。使用前將組織切片放于60℃的烤箱中烘烤2 h，而后依次進行脫蠟、水化、檸檬酸高溫修復(fù)，冷卻沖洗后進行內(nèi)源性過氧化物酶阻斷滅活后，加一抗β-catenin（即用型）、LEF1（即用型）37℃恒溫箱2.5 h，取出復(fù)溫1 h后，加二抗置于室溫濕盒內(nèi)20 min孵育，再行顯色及復(fù)染、脫水、二甲苯透明及樹脂膠封片。同時用PBS代替一抗做作陰性對照。根據(jù)參考文獻［6］標(biāo)準，β-catenin為均勻一致的細胞質(zhì)/細胞核表達陽性，或病變部位組織細胞膜表達＜75%，再或者病變上皮的廣泛細胞質(zhì)表達＞50%；LEF1為細胞核表達，細胞核中如果出現(xiàn)棕黃色顆?；蛑?，則視為陽性。先以10個高倍鏡視野中觀察到的腫瘤細胞陽性數(shù)為依據(jù)，計算出陽性百分率，靶細胞如果陽性率不足5%，則記0分；如果在5～25%，則記1分；如果在26%～50%，則記2分，如果超過51～75%則記3分；如果＞75%則記4分。再根據(jù)切片中細胞染色程度進行記分，細胞無染色，則記0分；呈淺黃色，則記1分；呈棕黃色，則記2分；呈棕褐色，則記3分。兩者相乘如果＜2分，則視為陰性；如果≥2分以上，則視為陽性。所有閱片結(jié)果均由2名資深病理醫(yī)師獨立觀察。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS24.0統(tǒng)計軟件。計數(shù)資料比較采用χ2檢驗，相關(guān)性分析采用Spearman等級相關(guān)分析法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各食管組織β-catenin、LEF1陽性率比較ES?CC組織、低級別上皮內(nèi)瘤變組織、高級別上皮內(nèi)瘤變組織、食管癌旁正常黏膜組織β-catenin陽性率分別為71.1%、21.1%、66.7%、10.0%，ESCC組織、低級別上皮內(nèi)瘤變組織、高級別上皮內(nèi)瘤變組織分別與食管癌旁正常黏膜組織比較，ESCC組織分別與低級別上皮內(nèi)瘤變組織、高級別上皮內(nèi)瘤變組織比較，低級別上皮內(nèi)瘤變組織與高級別上皮內(nèi)瘤變組織比較，P均＜0.05；LEF1陽性率分別為56.7%、31.6%、28.5%、5.0%，ESCC組織、低級別上皮內(nèi)瘤變組織、高級別上皮內(nèi)瘤變組織分別與食管癌旁正常黏膜組織比較，ESCC組織分別與低級別上皮內(nèi)瘤變組織、高級別上皮內(nèi)瘤變組織比較，P均＜0.05。詳見圖1、2。

圖1 β-catenin在各食管組織中的表達情況

2.2 β-catenin、LEF-1表達與ESCC臨床病理參數(shù)的關(guān)系 β-catenin、LEF-1表達與ESCC臨床病理參數(shù)的關(guān)系見表1，由表1可知，β-catenin陽性表達與ESCC分化程度、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，LEF-1陽性表達與ESCC腫瘤分化程度、浸潤深度有關(guān)（P均＜0.05）。

2.3 ESCC組 織 中β-catenin、LEF1表 達 的 相 關(guān)性ESCC組織中β-catenin、LEF1表達呈正相關(guān)（rs=0.591，P＜0.05）。

3 討論

圖2 LEF1蛋白在各食管組織中的表達情況

表1 β-catenin、LEF-1表達與ESCC臨床病理參數(shù)的關(guān)系

食管癌是世界上造成癌癥死亡的第六大原因之一，其病因因組織學(xué)類型、人群及性別而異［7-9］。ES?CC與食管腺癌（EADC）發(fā)生的地理位置、主要風(fēng)險因素幾乎都不同，由于大多數(shù)患者一經(jīng)發(fā)現(xiàn)都處于晚期，因此任何一種類型的食管癌患者預(yù)后都較差［10］。食管癌的發(fā)病率不僅在不同國家間存在差異，并且在各國內(nèi)也存在差異。盡管近年來我國食管癌發(fā)病率有所下降，但各地區(qū)之間的發(fā)病率仍存在差異，在中國北部中部泰宏山脈一帶ESCC是癌癥的主要死因之一［11］。中國高危地區(qū)癌癥細胞學(xué)和內(nèi)窺鏡檢查顯示，高度不典型增生是主要的癌前病變，并被證明與ESCC密切相關(guān)［10］。ESCC的發(fā)生與發(fā)展涉及多通路、多因子的參與，這些因子的表達變化往往與患者病情轉(zhuǎn)歸相關(guān)［12-14］，因此近年來研究ESCC重要分子通路及其中關(guān)鍵作用靶點為ESCC的靶向治療提供了新思路。

β-catenin是Wnt通路的關(guān)鍵因子，當(dāng)Wnt/β-catenin通路的發(fā)生異常激活時，β-catenin由細胞膜轉(zhuǎn)移至細胞質(zhì)或胞核內(nèi)，競爭性結(jié)合TCF4，抑制TCF4的轉(zhuǎn)錄激活，從而誘導(dǎo)細胞發(fā)生癌變，并產(chǎn)生惡性生物學(xué)行為。同時β-catenin是E-cadherincatenin復(fù)合物的組成部分，在上皮細胞黏附和組織結(jié)構(gòu)維持中具有至關(guān)重要的作用［15］。β-catenin結(jié)構(gòu)分布或功能的異常會導(dǎo)致細胞之間的黏附力喪失，并可能導(dǎo)致細胞轉(zhuǎn)化和癌癥發(fā)展。研究［15］發(fā)現(xiàn)，β-catenin定位于細胞核和細胞質(zhì)，ESCC組織陽性高于相鄰正常組織，且β-catenin陽性表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、漿膜浸潤和PTNM分期有關(guān)。作為Wnt/β-catenin信號通路的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，LEF1在正常細胞中促進涉及細胞增殖、胚胎和器官發(fā)育基因的表達［16］。同時LEF1也是上皮—間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）的促進劑，它將導(dǎo)致癌細胞遷移、侵襲，并增強癌細胞的增殖和生存能力［17］。MORGAN等［18］研究表明，經(jīng)典Wnt/β-catenin信號在髓系白血病中經(jīng)常失調(diào)，并與白血病的發(fā)生有關(guān)，LEF-1是白血病中核β-catenin定位的調(diào)節(jié)因子，并證明了控制髓樣白血病細胞中LEF-1表達的轉(zhuǎn)錄后蛋白水解降解機制。ZHANG等［19］認為，在結(jié)直腸癌中，MicroRNAs可直接靶向LEF1的非編碼區(qū)，從而抑制內(nèi)源性LEF1的表達，實驗證實miR26b的表達是結(jié)腸癌細胞增殖的有效抑制因子，并顯著降低LEF1的表達，并抑制結(jié)腸癌細胞的侵襲。FANG等［20］證實，LEF1可以增強肝癌細胞的自我更新能力、耐藥性、去分化和侵襲能力。缺口抑制劑能有效抑制LEF1的致癌作用和對腫瘤干性的影響。臨床治療中時常出現(xiàn)食管癌臨床分期相近的患者但放療后療效差異顯著，可能由于其基因突變譜的差異。研究［21］表明，LEF1蛋白陽性核表達率在放療無效組高于放療有效組，提示食管癌放射抵抗中可能存在Wnt/β-catenin信號通路異常，致使細胞核中LEF1的激活。本研究顯示，ESCC組織β-catenin、LEF1陽性率高于低級別上皮內(nèi)瘤變組織、高級別上皮內(nèi)瘤變組織、食管癌旁正常黏膜組織，β-catenin陽性表達與ESCC分化程度、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，LEF-1陽性表達與ESCC腫瘤分化程度、浸潤深度有關(guān)，ESCC組織中β-catenin、LEF1表達呈正相關(guān)。

總之，ESCC組織中β-catenin、LEF1的表達升高，兩指標(biāo)可作為ESCC病變進展的有效評估指標(biāo)及潛在的治療靶點。