超聲微泡爆破輔助骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療大鼠慢性腎病

夏春娟，王家平，楊楊，李天祎，邵麗詩，馬逸群，張婭

昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院，昆明650101

慢性腎?。–KD）是一種慢性疾病，臨床表現(xiàn)為蛋白尿、腎小球濾過率正?；蚪档?，以及進行性腎小球、腎小管和間質(zhì)損害［1］。CKD的特征在于腎功能的進行性喪失，導(dǎo)致終末期腎臟疾病和膠原蛋白的積累，引起的炎癥，導(dǎo)致腎臟纖維化［2］。目前針對CKD患者采用藥物、透析或腎臟移植等方式治療，盡管可以改善整體腎臟功能，但不能促進周圍組織再生和功能恢復(fù)［3］。近年來，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSC）移植已廣泛應(yīng)用于各類型腎病的治療，BM?SC能分化成腎臟細(xì)胞和血管組織，實現(xiàn)受損腎臟細(xì)胞再生，從而改善腎臟功能［4］。盡管大量研究證實干細(xì)胞對各類腎臟疾病治療具有有效性，但其歸巢率和存活率低仍限制著其對靶器官充分發(fā)揮作用，因此促進干細(xì)胞向靶器官歸巢是治療的關(guān)鍵。超聲造影劑是一種含直徑0.5～10μm氣泡的液體，含有的微氣泡由于破壞后產(chǎn)生空化效應(yīng)、生物學(xué)效應(yīng)等，因此可提高藥物靶向和基因治療［5］。本研究基于經(jīng)腎動脈移植BMSC基礎(chǔ)上加入超聲微泡，觀察兩者聯(lián)合治療大鼠CKD的療效，旨在探索安全有效的方法來提高BMSC歸巢率，從而更有效的發(fā)揮對CKD腎臟的保護作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物18周齡健康雄性SD大鼠44只，清潔級（由昆明醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供），體質(zhì)量150～180 g；選取34只用于構(gòu)建CKD動物模型，10只為正常對照。另選4周齡健康雄性SD大鼠2只，體質(zhì)量100 g，為BMSC供體。

1.2 BMSC制備 選4周齡SD大鼠2只，脫頸處死，75%乙醇全身浸泡10 min，生理鹽水沖洗干凈，嚴(yán)格按無菌操作分別取雙側(cè)脛骨、股骨，骨髓腔充分暴露，5 mL注射器抽取磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗骨髓腔3～4次，骨髓腔沖洗液收集后混勻、過濾、離心，用10%胎牛血清（美國Gibco公司）、含1%青鏈霉素雙抗（美國Gibco公司）L-DMEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，隨后接種至T25細(xì)胞培養(yǎng)皿中，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育，2 d后首次換液，之后依次間隔3 d換液，待細(xì)胞生長融合90%～100%時用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液（北京索萊寶科技公司）消化細(xì)胞，P3代細(xì)胞培養(yǎng)行成脂、成骨誘導(dǎo)分化，流式細(xì)胞儀（德國Beckman coulter公司）檢測細(xì)胞表面抗原CD45、CD90。倒置相差顯微鏡下見BMSC間有一定黏附性，呈長梭形、多邊形、“渦狀”貼壁生長。成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)2周末油紅O染色，可見染成紅色的脂肪細(xì)胞；成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)4周末茜素紅染色，可見細(xì)胞質(zhì)內(nèi)鈣結(jié)節(jié)被染成橘紅色（證明骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞具有多向分化潛能）。P3代BMSC表面抗原CD45表達(dá)率為11.5%、CD90表達(dá)率為99.96%（鑒定骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞）。

1.3 超聲微泡制備 將超聲微泡造影劑（聲諾維造影劑，意大利Braco公司）按照說明書配置成混懸液，即在裝有造影劑的小瓶里注入0.9%生理鹽水5 mL，然后用力振搖瓶子，直至凍干粉末完全分散，微泡濃度為2×108個/mL，平均直徑為2.5μm（配置標(biāo)準(zhǔn)超聲微泡劑量）。

1.4 CKD模型制備及超聲微泡爆破輔助骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療方法 選取18周齡SD大鼠34只，自由飲水、飲食適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。固定后經(jīng)尾靜注阿霉素3 mg/kg（美國Sigma公司），14 d時再次注射相同劑量阿霉素。之后每周經(jīng)尾靜脈采血，平均為7周，以血肌酐（Cr）、血尿素氮（BUN）和24 h尿蛋白水平升高，且病理切片行HE染色示CKD改變?yōu)樵炷３晒?biāo)準(zhǔn)［6］。造模實驗過程中死亡1只，造模后飼養(yǎng)期間死亡3只，最終30只制模成功并納入后續(xù)實驗。30只CKD大鼠隨機分為BMSC+微泡組、BMSC組、CKD組各10只，造模7周末各組開始同時治療。各組大鼠均以10%水合氯醛（0.3 mL/100 g）腹腔注射麻醉，無菌手術(shù)臺固定，暴露腹部，脫毛，碘伏消毒，鋪無菌手術(shù)單，切開皮膚，逐層分離至顯示腎動脈。BMSC+微泡組：經(jīng)腎動脈注射0.5 mL的BMSC（2×106/mL），緊接著注入0.5 mL的聲諾維造影劑（2×108個/mL），注射完畢后立即啟動西門子S3000超聲診斷儀（美國西門子醫(yī)療系統(tǒng)公司），采用9L4高頻線陣探頭配備造影模式：傳輸頻率為7.5 MHz，機械指數(shù)0.04，每隔10 s對兩側(cè)腎臟分別爆破1次，共3次。BMSC組：經(jīng)腎動脈注射0.5 mL的BMSC（2×106/mL）懸液。對照組及CKD組：經(jīng)腎動脈輸注等量0.9%氯化鈉溶液。術(shù)畢，逐層縫合大鼠腹部切口，切口處及肌內(nèi)分別注射抗生素抗感染，置入飼養(yǎng)籠保溫、飼養(yǎng)。

1.5 尿蛋白及血清BUN、Cr檢測和腎臟病理評估 ①尿蛋白及血清BUN、Cr檢測方法：造模第8周，將各組大鼠置于代謝籠中，收集24 h尿液，存儲在-70℃冰箱。經(jīng)腹腔注射10%水合氯醛（0.3 mL/100 g），待完全處于麻醉狀態(tài)下，經(jīng)尾靜脈采血，使用自動生化分析儀（日立7170型，日本）檢測尿蛋白及血清BUN、Cr。治療1周后，將各組大鼠置于代謝籠中，收集24 h尿液，經(jīng)尾靜脈采血，使用自動生化分析儀檢測尿蛋白及血清BUN、Cr。治療2周后，將各組大鼠置于代謝籠中，收集24 h尿液。第2天依次經(jīng)腹腔注射10%水合氯醛，待完全處于麻醉狀態(tài)下，使用一次性靜脈采血針穿刺心臟采血后，一部分將血液樣品收集到血清收集凝膠管中放置室溫1 h進行凝結(jié)，然后將樣品以3 500 r/min離心15 min分離血清，使用自動生化分析儀檢測尿蛋白及血清BUN、Cr。②腎臟病理評估方法：緊接著灌注后立即取出各組腎臟組織，固定在10%甲醛中，選取部分腎皮質(zhì)（1 mm×1 mm×1 mm）組織放入多聚甲醇溶液中。經(jīng)過固定、脫水、包埋、制作石蠟切片，HE、Masson染色后，在光學(xué)顯微鏡下（日本Nikon公司）由3名不同病理科醫(yī)生觀察并描述，纖維化評分依病變由輕至重的程度，陰性記0分，少量記1分，中等量記2分，多量記3分，大量記4分。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS20.0統(tǒng)計軟件。計量資料以±s表示，治療前后比較采用配對T檢驗，采用方差分析行多組間比較，兩兩比較采用L-LSD-t法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組治療前后血清Cr、BUN及24 h尿蛋白水平比較 治療前后血清Cr、BUN及24 h尿蛋白水平比較見表1。

表1 各組治療前后血清Cr、BUN及24 h尿蛋白水平比較（±s）

表1 各組治療前后血清Cr、BUN及24 h尿蛋白水平比較（±s）

注：與同組治療前比較，aP＜0.05；與對照組比較，bP＜0.05；與CKD組比較，cP＜0.05；與BMSC組比較，dP＜0.05。

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2.2 各組腎臟組織病理變化比較 對照組HE染色顯示腎小球及腎小管正常、基底膜未見增生、未見炎性細(xì)胞；Masson三色染色未見染色膠原纖維，評分為0分。CKD組HE染色顯示腎小球囊擴張、腎小球內(nèi)見大量空泡、部分腎小管萎縮、基底膜不同程度增生、間質(zhì)部炎性細(xì)胞大量分布；Masson三色染色顯示腎小管間質(zhì)周圍大量藍(lán)色著染膠原纖維，評分為4分。BMSC組HE染色顯示少量腎小球囊擴張、腎小球內(nèi)見少量空泡、少量腎小管萎縮、部分腎小管管型、基底膜增生程度減少、間質(zhì)炎性細(xì)胞分布減少；Masson三色染色顯示腎小管間質(zhì)周圍少量藍(lán)色著染膠原纖維，評分為2分。BMSC+微泡組HE染色顯示極少量腎小球囊擴張、腎小球內(nèi)見極少量空泡、極少量腎小管萎縮及腎小管管型、基底膜增生程度減少、間質(zhì)炎性細(xì)胞分布明顯減少；Masson三色染色顯示腎小管間質(zhì)周圍極少量藍(lán)色著染膠原維，評分為1分。詳見圖1。

3 討論

阿霉素是一種蒽環(huán)類抗生素，廣泛應(yīng)用于多種腫瘤治療，其主要不良反應(yīng)是引起心臟和腎臟毒性。阿霉素誘導(dǎo)的腎損傷性腎病是公認(rèn)的嚙齒動物模型，目前大量應(yīng)用于腎臟疾病進展機制、治療方法等研究［7］。阿霉素引起的腎毒性其機制復(fù)雜，病理上主要表現(xiàn)為腎小球破壞和腎小管間質(zhì)損害導(dǎo)致腎小管間質(zhì)纖維化和腎小球硬化［8］，主要表現(xiàn)為嚴(yán)重的蛋白尿，血尿和水腫。以往治療阿霉素腎病主要采取藥物、透析或者腎移植［9］，但其治療費用昂貴且無法逆轉(zhuǎn)腎臟修復(fù)，因此治療受到限制。

圖1 各組大鼠腎臟組織HE染色和Masson三色染色病理圖片（×400）

BMSC是一類在特定條件下具有自我更新和多能分化潛能的細(xì)胞群。國內(nèi)外實驗研究表明，BMSC通過促進分泌細(xì)胞生長的因子、細(xì)胞旁分泌、細(xì)胞外囊泡分泌等機制為BMSC細(xì)胞移植營造良好的微環(huán)境，從而抑制炎癥反應(yīng)、引發(fā)組織再生、促進血管生成［10］。隨著研究的不斷深入，證實BMSC在各類型腎臟疾病治療中取得較好的效果［11］。BMSC移植治療CKD受影響因素頗多，包括體內(nèi)受環(huán)境、免疫、代謝等［12］。體外細(xì)胞增殖、定向歸巢能力、移植過程中細(xì)胞數(shù)量及次數(shù)不同等，均會造成BMSC衰老、凋亡甚至死亡，影響治療效果。目前提高BMSC的移植成功率是研究熱點，包括不同移植途徑、移植次數(shù)、基因修飾，細(xì)胞表面工程和體外誘導(dǎo)等方式［13］，其中移植方式的選擇很大程度影響移植成功率。超聲微泡在受到機械波的作用下產(chǎn)生爆破后發(fā)射微射流，細(xì)胞膜上鈣、鈉離子等通道開放，周圍毛細(xì)血管通透性增加，使得BMSC更有效地進入靶器官和組織。同時通過改變細(xì)胞周圍微環(huán)境促進內(nèi)分泌因子分泌，有利于干細(xì)胞向靶器官的歸巢［14］。由于超聲微泡爆破作用于靶器官時間短暫因此對BMSC的增殖和存活沒有影響［15］。因此，本研究采取以往前期研究團隊的移植方式即經(jīng)腎動脈移植［16］基礎(chǔ)上加入超聲微泡爆破以觀察其療效。

本研究通過BMSC組、BMSC+微泡組與CKD組比較，BMSC組24 h尿蛋白；BMSC+微泡組24 h尿蛋白、血清Cr、血清BUN移植第2周末降低明顯，HE提示兩組均腎小球囊部分?jǐn)U張、腎小球內(nèi)空泡減少、部分腎小管擴張、基底膜增生不同程度減少、間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤有所減少。Masson三色染色顯示腎小管間質(zhì)周圍膠原纖維減少，證明BMSC可使部分受損腎組織修復(fù)。研究［17］表明，BMSC通過減輕炎癥反應(yīng)、增強對受損組織的修復(fù)能力等來減輕或逆轉(zhuǎn)CKD腎臟受損程度相符。本研究還顯示，BMSC+微泡組與BMSC組比較24 h尿蛋白、血清Cr、血清BUN降低；且較CKD組降低明顯，HE染色及Masson三色染色顯示CKD病理改變較BMSC組改善明顯。證明超聲微泡聯(lián)合BMSC移植，能更有效的減輕纖維化及恢復(fù)部分結(jié)構(gòu)，促進大鼠CKD腎臟其功能恢復(fù)。這與部分研究認(rèn)為超聲介導(dǎo)的微泡促使BMSC相應(yīng)組織或器官修復(fù)，從而改善相應(yīng)功能相符［18］。研究［19］發(fā)現(xiàn)，超聲介導(dǎo)的微泡對急性心肌梗死大鼠受損心肌可起到修復(fù)作用。研究［20］證明，超聲微泡介導(dǎo)的BMSC可以通過抑制炎癥、減少腫瘤壞死因子-α及白細(xì)胞介素-1β表達(dá)進而治療大鼠前列腺炎。超聲微泡爆破聯(lián)合BMSC移植促進修復(fù)大鼠CKD腎臟的機制可能為：①超聲微泡爆破后會引起腎微血管短暫炎性信號反應(yīng)吸引更多BMSC向腎臟歸巢；②超聲微泡爆破后瞬時產(chǎn)生流體微噴、沖擊波和空化效應(yīng)，作用于細(xì)胞膜上產(chǎn)生剪切應(yīng)力，從而破壞血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)膜、內(nèi)皮細(xì)胞短暫收縮、間隙增寬并增加血管通透性，促使BMSC在腎微血管里聚集、循環(huán)增多［21］；③超聲微泡爆破后可能引起腎臟微環(huán)境改變，某些生長因子或細(xì)胞因子表達(dá)增加，如腫瘤壞死因子-α、白細(xì)胞介素-1β、白細(xì)胞介素-6，這些因素均吸引BMSC向腎臟區(qū)域歸巢，促進腎臟局部血管生成及減少纖維化；④超聲微泡爆破后導(dǎo)致靶向區(qū)域腎細(xì)胞內(nèi)、外熱力學(xué)改變、能量聚集、代謝增強，有利于BMSC分化、增殖。

總之，超聲微泡爆破聯(lián)合BMSC移植治療大鼠CKD效果較好，其可減輕大鼠CKD腎臟損傷程度，改善腎臟功能。