急性加重期慢性阻塞性肺疾病患者血漿趨化因子27水平變化及其意義

梁子毅，黃丹，吳東，冼舒平，陳敏

廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，廣東湛江524023

慢性阻塞性肺疾病（COPD）簡(jiǎn)稱慢阻肺，是一種慢性氣道炎性疾病，以持續(xù)氣流受限和進(jìn)行性加重為主要病變特征，嚴(yán)重侵害人類健康的主要慢性氣道疾病之一［1］。急性加重期慢性阻塞性肺疾?。ˋECOPD）是慢阻肺患者死亡、經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)增加的重要因素，給人民健康、國(guó)民經(jīng)濟(jì)帶來(lái)沉重負(fù)擔(dān)。慢阻肺急性加重最多見的發(fā)病誘因是上呼吸道病原體感染，其可產(chǎn)生的特異性免疫反應(yīng)，并且導(dǎo)致以中性粒細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞為主的炎癥。AECOPD的急性加重還和氣道的炎癥加劇有關(guān)［2］。AECOPD的診斷完全依賴于臨床癥狀，是一種臨床排除性診斷，缺乏診斷的金標(biāo)準(zhǔn)或精確的生物標(biāo)志物［3］。趨化因子27（CCL27）屬于CC趨化因子家族的小細(xì)胞因子，又被稱為皮膚T細(xì)胞虜獲趨化因子，主要由表皮基底層角質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生［4］。CCL27通過和其受體趨化因子受體10（CCR10）相互作用，可以介導(dǎo)循環(huán)血液中記憶T細(xì)胞遷移至皮膚等靶器官［5］。COPD的發(fā)病過程以及急性加重存在Ⅱ型固有淋巴細(xì)胞（ILC2）的參與［6-7］。最新研究發(fā)現(xiàn)，CCL27參與了ILC2細(xì)胞促進(jìn)哮喘氣道炎癥反應(yīng)的發(fā)病過程［8-9］。目前，關(guān)于CCL27是否參與了慢阻肺急性加重過程的相關(guān)研究尚少。本研究觀察了AECOPD患者血漿CCL27水平，并探討其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2019年11月—2020年11月廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院收治的COPD患者50例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①簽署知情同意書；②符合COPD的肺功能診斷標(biāo)準(zhǔn)，即使用支氣管擴(kuò)張劑后FEV1/FVC＜70%；③年齡≥40歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并有其他呼吸系統(tǒng)疾?。ㄈ缰夤軘U(kuò)張、支氣管哮喘、肺纖維化、氣道內(nèi)腫瘤、結(jié)核后遺癥等）；②有炎癥性及過敏性皮膚疾??；③有除呼吸系統(tǒng)以外的急性炎癥性疾??；④有嚴(yán)重心、肝、腎功能不全；⑤有風(fēng)濕免疫系統(tǒng)疾病；⑥有免疫缺陷、惡性腫瘤；⑦需要長(zhǎng)期使用激素或免疫抑制劑；⑧入組前兩周使用過抗生素、口服激素治療；⑨孕婦；⑩不能配合完成研究的精神心理疾病。50例COPD患者根據(jù)GOLD指南（2019版）［1］中慢阻肺急性加重的診斷標(biāo)準(zhǔn)分為兩組。急性加重組25例，男20例，女5例；年齡（68.40±8.28）歲；BMI（20.85±3.29）kg/m2；吸煙指數(shù)36.20±19.77。穩(wěn)定組25例，男20例，女5例；年齡（66.92±8.45）歲；BMI（20.63±3.96）kg/m2；吸煙指數(shù)29.20±17.14。另選24例同期健康體檢者作對(duì)照（對(duì)照組），男17例，女7例；年齡（64.88±9.579）歲；BMI（20.70±2.54）kg/m2；吸煙指數(shù)24.37±12.87。納入標(biāo)準(zhǔn)：①簽署知情同意書；②需要完成肺功能測(cè)定，且不滿足慢阻肺的肺功能診斷標(biāo)準(zhǔn)，即舒張后FEV1/FVC＞70%，且FEV1＞80%；③年齡≥40歲。本研究已得到本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有研究對(duì)象均完成簽署知情同意書。

1.2 血漿CCL27及WBC檢測(cè) 用檸檬酸鈉抗凝管、乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝管留取外周靜脈血各5 mL；檸檬酸鈉抗凝管的血標(biāo)本靜置5 min后，以3 000 r/min速度離心，持續(xù)時(shí)間為15 min，分離血漿后置于-80℃冰箱；采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)技術(shù)（ELISA法）檢測(cè)血漿CCL27，所有操作均嚴(yán)格按照試劑盒的操作說(shuō)明書進(jìn)行。EDTA抗凝管的血標(biāo)本采集后立即送至我院檢驗(yàn)科，使用貝克曼庫(kù)爾特LH 750全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀檢測(cè)血常規(guī)項(xiàng)目。

1.3 肺功能檢查 所有入組研究對(duì)象均采用德國(guó)耶格公司Master Screen PFT System肺功能儀行肺功能檢查，根據(jù)中華醫(yī)學(xué)會(huì)呼吸病學(xué)分會(huì)肺功能專業(yè)組發(fā)布的《肺功能檢查指南》執(zhí)行規(guī)范操作，經(jīng)過計(jì)算得出患者第一秒用力呼氣容積預(yù)計(jì)值（FEV1pred），通過測(cè)量患者第一秒用力呼氣容積（FEV1）、用力肺活量（FVC），得出并記錄患者第一秒用力呼氣容積占預(yù)計(jì)值百分比（FEV1%pred）、第一秒用力呼氣容積與用力肺活量之比（FEV1/FVC）。

1.4 病情嚴(yán)重程度評(píng)估 急性加重組以及穩(wěn)定組的COPD患者均需要根據(jù)自身病情填寫COPD評(píng)估測(cè)試問卷（CAT問卷）、改良版英國(guó)醫(yī)學(xué)研究委員會(huì)呼吸困難問卷（mMRC問卷），分別對(duì)其健康損害程度、呼吸困難程度進(jìn)行評(píng)估，并收集患者一年內(nèi)COPD急性加重次數(shù)。CAT評(píng)分越高提示患者癥狀越多，病情控制越差；mMRC分級(jí)增加，則提示患者的呼吸困難程度更加嚴(yán)重。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以±s表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANO?VA）；運(yùn)用Pearson相關(guān)分析法分析COPD患者血漿CCL27水平與WBC、FEV1%pred、FEV1/FVC、CAT評(píng)分、mMRC分級(jí)、一年內(nèi)急性加重次數(shù)之間的關(guān)系；繪制受試者工作特征曲線（ROC），以COPD患者是否為慢阻肺急性加重為因變量，評(píng)估CCL27在COPD患者中鑒別診斷AECOPD的效能。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組CCL27水平、WBC、肺功能及兩組病情嚴(yán)重程度比較 急性加重組及穩(wěn)定組和對(duì)照組CCL27水平、WBC、肺功能比較見表1，急性加重組和穩(wěn)定 組病情嚴(yán)重程度比較見表2。

表1 急性加重組及穩(wěn)定組和對(duì)照組CCL27水平、WBC、肺功能比較（±s）

表1 急性加重組及穩(wěn)定組和對(duì)照組CCL27水平、WBC、肺功能比較（±s）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與穩(wěn)定組比較，△P＜0.05。

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表2 急性加重組和穩(wěn)定組病情嚴(yán)重程度比較（±s）

表2 急性加重組和穩(wěn)定組病情嚴(yán)重程度比較（±s）

注：與穩(wěn)定組比較，*P＜0.05。

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2.2 COPD患者血漿CCL27水平與WBC、肺功能、病情嚴(yán)重程度的相關(guān)性COPD患者CCL27與WBC、FEV1%pred、FEV1/FVC、一年內(nèi)急性加重次數(shù)、CAT評(píng)分、mMRC分級(jí)均無(wú)相關(guān)性（r分別為0.164、0.105、0.003、-0.019、-0.029、-0.055，P均＞0.05）。

2.3 血漿CCL27水平診斷AECOPD的效能 依據(jù)GOLD指南（2019版）中對(duì)于慢阻肺急性加重的臨床定義為標(biāo)準(zhǔn)，以COPD患者是否為慢阻肺急性加重為因變量，ROC曲線分析血漿CCL27水平鑒別診斷AECOPD的ROC曲 線 下 面 積 為0.720（95%CI：0.580～0.860，P=0.008），靈敏度為0.720，特異度為0.640，約登指數(shù)為0.360，其對(duì)應(yīng)的截?cái)嘀禐? 302.09 pg/mL。

3 討論

COPD以氣流持續(xù)性受限為特征，氣道持續(xù)存在的慢性炎癥損傷氣管壁，導(dǎo)致小氣道的重塑、氣管壁痙攣，引起氣流受限，加速肺功能下降，在慢阻肺疾病的病情進(jìn)展進(jìn)程中有著關(guān)鍵的作用［10］。目前研究認(rèn)為，慢阻肺的發(fā)病以及急性加重主要與氣道炎癥反應(yīng)有關(guān)，通過復(fù)雜的機(jī)制肺內(nèi)炎癥細(xì)胞被激活，釋放炎癥因子和趨化因子，損毀肺的結(jié)構(gòu)和（或）推動(dòng)中性粒細(xì)胞炎癥反應(yīng)［11］。在臨床上最廣泛應(yīng)用的GOLD指南中，AECOPD的定義是呼吸癥狀急性惡化，需要接受額外的治療，故對(duì)于AECOPD的診斷更多是根據(jù)其臨床表現(xiàn)，而缺乏客觀指標(biāo)作為診斷的金標(biāo)準(zhǔn)。而在臨床實(shí)踐中經(jīng)常會(huì)遇到，一些AE?COPD患者呼吸癥狀較前加重，但是通過抗感染并加強(qiáng)改善癥狀的治療措施后，治療效果并不理想。對(duì)這些病例進(jìn)行重新分析評(píng)估后，發(fā)現(xiàn)有相當(dāng)一部分患者或是實(shí)際患有與AECOPD難以鑒別的其他疾病，如肺炎、充血性心力衰竭等；或是因?yàn)樗幬镏委熞缽男圆钜鸬陌Y狀加重［1］。這些診斷不明的病例不但有可能會(huì)延誤病情，還會(huì)加重患者家庭經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，造成難以彌補(bǔ)的不良后果。所以尋找一個(gè)能反應(yīng)病情變化，幫助更好診斷AECOPD的輔助檢查指標(biāo)，成為目前慢阻肺研究領(lǐng)域的一個(gè)熱點(diǎn)方向。現(xiàn)有研究表明，在慢阻肺急性加重過程中，患者肺部炎癥細(xì)胞聚集，以肺泡巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞為著，激活的炎癥細(xì)胞釋放一些能夠破壞肺的結(jié)構(gòu)和（或）促進(jìn)中性粒細(xì)胞炎癥反應(yīng)的多種炎性介質(zhì)，包括白細(xì)胞介素-6、白三烯B4、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等［12-14］。由于細(xì)胞因子種類繁多，每種因子作用各不相同，因此關(guān)于不同炎癥介質(zhì)在AE?COPD患者中的表達(dá)水平變化以及其臨床意義成為了研究人員亟需探索的領(lǐng)域。

趨化因子是一類結(jié)構(gòu)類似，相對(duì)分子質(zhì)量多為8 000～10 000的有著多種作用的小分子蛋白質(zhì)。CCL27是一種CC型趨化因子，主要由表皮基底層角質(zhì)形成細(xì)胞產(chǎn)生［4］。CCL27的受體為CCR10，廣泛分布在皮膚的淋巴管和毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞以及記憶T細(xì)胞表面［15］，CCL27通過與其受體CCR10相互作用，可以轉(zhuǎn)導(dǎo)血液循環(huán)系統(tǒng)和皮膚淋巴管中的記憶T細(xì)胞遷徙至皮膚等靶器官，從而參與炎癥反應(yīng)。此前對(duì)于研究CCL27的研究還廣泛集中在過敏性皮膚病以及炎癥性皮膚病上，但最新研究顯示CCL27和其受體CCR10在肺部有著較高的表達(dá)，并且CCL27被發(fā)現(xiàn)在COPD患者中表達(dá)水平相對(duì)更高［16-17］。目前，關(guān)于CCL27參與COPD氣道炎癥反應(yīng)的途徑主要有兩種可能——Ⅱ型固有淋巴樣細(xì)胞表面CCR10增多從而募集CCL27或者TNF-α激活CCL27等炎癥介質(zhì)進(jìn)一步參與炎癥反應(yīng)。Ⅱ型固有淋巴樣細(xì)胞主要分布在人體的肺部、腸道、腭扁桃體中，被認(rèn)為是在哮喘、呼吸道炎癥疾病發(fā)病過程中的發(fā)揮重要作用的先天免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞，其在氣道慢性炎癥發(fā)病過程中的氣道膠原沉積、纖維化等方面起到重要作用［18-19］。最新研究顯示［8-9，20］，CCR10蛋白質(zhì)在ILC2表面也有著很高的表達(dá)，而且ILC2和CCL27被發(fā)現(xiàn)在哮喘模型小鼠肺組織中有著很高表達(dá)水平，并在哮喘模型小鼠血液和肺泡灌洗液中CCL27水平較對(duì)照組小鼠升高，提示CCL27參與了ILC2細(xì)胞促進(jìn)氣道慢性炎癥反應(yīng)的發(fā)病過程。研究顯示，ILC2細(xì)胞不但在COPD的早期發(fā)病過程中扮演了重要角色，還在AECOPD中發(fā)揮關(guān)鍵作用［21］。越來(lái)越多的研究表明，肺部的上皮細(xì)胞和其余結(jié)構(gòu)細(xì)胞以及免疫細(xì)胞釋放的炎性介質(zhì)可以激活Ⅱ型固有淋巴細(xì)胞，通過促進(jìn)肺部的病理性炎癥反應(yīng)，從而參與了COPD等慢性呼吸道疾病急性加重的發(fā)病過程［22］。ILC2細(xì)胞被認(rèn)為通過分泌白細(xì)胞介素-13（IL-13）、白細(xì)胞介素-5（IL-5）等炎癥介質(zhì)促進(jìn)嗜酸性粒細(xì)胞等炎癥細(xì)胞增殖從而參與COPD患者氣道炎癥反應(yīng)［23-24］。另外，AECOPD患者誘導(dǎo)痰的中性粒細(xì)胞彈性酶和組織蛋白酶G水平升高，會(huì)誘導(dǎo)白細(xì)胞介素-33（IL-33）從壞死的上皮或內(nèi)皮細(xì)胞釋放并成熟為具有較強(qiáng)生物活性的分子［25］，成熟的IL-33可以誘導(dǎo)肺組織內(nèi)ILC2細(xì)胞的積累并激活其細(xì)胞活性［26］，導(dǎo)致AECOPD患者肺部IL-5、IL-13表達(dá)增強(qiáng)和嗜酸性粒細(xì)胞增多。CCL27是ILC2細(xì)胞重要潛在生物標(biāo)志物［8］，ILC2細(xì)胞在AECOPD患者中表達(dá)增強(qiáng)，提示CCL27很可能參與了AECOPD發(fā)病的過程中。另外，被認(rèn)為與AECO?PD有著非常密切關(guān)系的TNF-α等炎癥因子亦可刺激CCL27的產(chǎn)生，從而進(jìn)一步加重AECOPD患者炎癥反應(yīng)［27-29］。根據(jù)目前研究成果，可推測(cè)CCL27在AECOPD病情進(jìn)展過程中有著緊密的聯(lián)系，于是檢測(cè)CCL27在AECOPD患者中表達(dá)水平變化，并探究其與AECOPD患者病情嚴(yán)重程度、WBC、肺功能等是否存在關(guān)聯(lián)性，又能否成為診斷AECOPD的潛在生物標(biāo)志物成為了本研究的主要研究目的。

本研究發(fā)現(xiàn)，急性加重組、穩(wěn)定期組血漿CCL27水平高于對(duì)照組，并且急性加重組血漿CCL27水平高于穩(wěn)定組，這一結(jié)果證實(shí)CCL27不但可能在COPD氣道慢性炎癥的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，還參與了AECOPD的炎癥急性加重反應(yīng)。本研究還發(fā)現(xiàn)，急性加重組WBC高于穩(wěn)定組及對(duì)照組，提示CCL27作為一種炎癥趨化因子，可能通過刺激WBC等炎癥細(xì)胞增殖，并且趨化其在肺組織聚集，從而參與AECOPD炎癥反應(yīng)的過程。但本研究中COPD患者血漿CCL27水平與WBC水平、氣流受限程度、癥狀、呼吸困難程度等均未發(fā)現(xiàn)明顯的相關(guān)性，提示COPD的發(fā)病、急性加重過程和病情嚴(yán)重程度還存在多種因素共同作用，CCL27與COPD以及急性加重的關(guān)系更為復(fù)雜，需要我們進(jìn)一步加大樣本量和進(jìn)行前瞻性的研究證實(shí)。血漿CCL27水平在COPD患者中鑒別診斷AECOPD的ROC曲線分析證明，其在幫助診斷AECOPD方面具有一定的特異度和敏感度，但是特異度和敏感度均較弱，反映CCL27并不適合作為單獨(dú)指標(biāo)來(lái)診斷AECOPD，但可作為生物標(biāo)志物組群之一共同協(xié)助診斷AECO?PD，在提高AECOPD診斷效能上具有一定的臨床意義。

總之，AECOPD患者血漿CCL27水平升高，可能介導(dǎo)了COPD氣道炎癥的炎癥細(xì)胞遷移，并且參與了AECOPD急性加重的發(fā)病過程。CCL27可能是AECOPD的重要生物標(biāo)志物，對(duì)于協(xié)助提高在COPD患者中鑒別診斷AECOPD具有一定的價(jià)值。這一發(fā)現(xiàn)為AECOPD診療提供了新的思路。