曲馬多下調(diào)miR-574-5p對(duì)胃癌細(xì)胞增殖及凋亡的影響機(jī)制研究

范璦霞

胃癌是臨床常見惡性腫瘤之一，我國(guó)胃癌發(fā)病率與死亡率較高，目前臨床主要采用手術(shù)的方式治療胃癌，但麻醉藥物等均可影響治療效果[1,2]。研究表明曲馬多(Tramadol)可通過調(diào)控免疫因子表達(dá)從而影響胃癌患者的免疫功能[3,4]。曲馬多可減輕腫瘤患者中前炎因子水平而抑制應(yīng)激反應(yīng)[5]。但曲馬多對(duì)胃癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響尚未完全闡明。研究表明微小RNA-574-5p(microRNA-574-5p，miR-574-5p)在胃癌組織中高表達(dá)，其表達(dá)水平與腫瘤大小、TNM分期等臨床參數(shù)密切相關(guān)[6]。研究表明miR-574-5p在多種惡性腫瘤中高表達(dá)，還可促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞增殖及抑制其凋亡[7,8]。但曲馬多是否可通過調(diào)控miR-574-5p表達(dá)而發(fā)揮作用尚未可知。本研究以人胃癌SGC-7901細(xì)胞為研究對(duì)象，觀察曲馬多對(duì)胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖及凋亡的影響，及其對(duì)miR-574-5p表達(dá)的調(diào)控作用，進(jìn)一步探討其內(nèi)在作用機(jī)制，旨在為曲馬多用于治療胃癌提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 曲馬多購自德國(guó)格蘭泰有限公司；胃癌SGC-7901細(xì)胞購自武漢普諾賽生命科技有限公司。miR-574-5p inhibitor、Inhibitor control、miR-574-5p mimic、mimic control購自廣州銳博生物科技有限公司；RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清購自上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司；青霉素與鏈霉素購自上海信帆生物科技有限公司；Lipofectamine2000購自上海潤(rùn)成生物科技有限公司；MTT購自北京博潤(rùn)萊特科技有限公司；細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；RIPA裂解液購自南京森貝咖生物科技有限公司；Trizol試劑購自美國(guó)Thermo Fisher公司；反轉(zhuǎn)錄與實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒均購自大連寶生物工程有限公司；B淋巴細(xì)胞瘤2(Bcl2)、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)單克隆抗體購自上海鈺博生物科技有限公司；HRP標(biāo)記的IgG二抗購自武漢艾美捷科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)處理與分組:胃癌SGC-7901細(xì)胞貼壁培養(yǎng)于RPMI 1640完全培養(yǎng)基，含有10%胎牛血清、100 U/ml的青霉素以及鏈霉素(0.1 mg/ml)，置于37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每隔2 d更換1次培養(yǎng)液，待細(xì)胞匯合至90%，棄上清，0.25 %胰蛋白酶消化1 min，加入RPMI 1640完全培養(yǎng)基(5 ml)，反復(fù)吹打至細(xì)胞脫落，收集細(xì)胞，1 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心5 min后棄上清(重復(fù)2次)，加入RPMI 1640完全培養(yǎng)基(10 ml)重懸細(xì)胞，傳代培養(yǎng)。取SGC-7901單細(xì)胞懸液接種于24孔板(1.5×105個(gè)/孔)，實(shí)驗(yàn)分組：Tramadol 3 μg/ml組、Tramadol 30 μg/ml組、Tramadol 300 μg/ml組。MTT檢測(cè)細(xì)胞吸光度值，篩選Tramadol 300 μg/ml進(jìn)行后續(xù)研究。實(shí)驗(yàn)細(xì)胞轉(zhuǎn)染：胃癌SGC-7901細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染Inhibitor control(Inhibitor control組)、miR-574-5p inhibitor(miR-574-5p inhibitor組)，轉(zhuǎn)染前1 h更換為不含血清及雙抗的RPMI 1640培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染后6 h，更換為含有血清及雙抗的RPMI 1640完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。后續(xù)研究中將轉(zhuǎn)染miR-574-5p mimic、mimic control的胃癌SGC-7901細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)分組：Tramadol+mimic control組、Tramadol+miR-574-5p mimic組。

1.2.2 MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖:收集4組SGC-7901細(xì)胞，胰蛋白酶消化，制備細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度(3×105個(gè)/ml)，每孔加入100 μl細(xì)胞懸液接種于96孔板，加入20 μl MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清液，每孔分別加入150 μl DMSO溶液，低速振蕩混勻，應(yīng)用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔吸光度值(A)。每組實(shí)驗(yàn)均設(shè)置3次重復(fù)。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率:取各組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SGC-7901細(xì)胞，預(yù)冷PBS洗滌，胰蛋白酶消化，1 000 r/min轉(zhuǎn)速離心5 min，PBS洗滌，加入100 μl結(jié)合緩沖液，依次分別加入5 μl Annexin V-FITC與PI，室溫避光孵育20 min，各流式管內(nèi)分別加入400 μl結(jié)合緩沖液，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.2.4 qRT-PCR檢測(cè)細(xì)胞中miR-574-5p表達(dá)水平:取各組SGC-7901細(xì)胞，按照Trizol法提取細(xì)胞總RNA，利用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度，置于-80℃超低溫冰箱保存待測(cè)。反轉(zhuǎn)錄：根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書配置反應(yīng)體系，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，RNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。qRT-PCR反應(yīng)：參照試劑盒說明書配置反應(yīng)體系20 μl，應(yīng)用ABI 7500熒光定量PCR儀檢測(cè)miR-574-5p的Ct值；反應(yīng)條件：95℃ 2 min(1×)，95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s(35×)。miR-574-5p以U6為內(nèi)參，采用 2-ΔΔCt法計(jì)算miR-574-5p相對(duì)表達(dá)量。

1.2.5 蛋白免疫吸附法(Western blot)檢測(cè)Bax、Bcl2蛋白表達(dá):取各組SGC-7901細(xì)胞，加入RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白，BCA法定量蛋白，應(yīng)用RIPA裂解液調(diào)整蛋白濃度(60 μg/μl)，高溫煮沸5 min(99℃)蛋白變性，取10 μl變性蛋白根據(jù)分組加入不同泳道內(nèi)，經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳反應(yīng)，待溴酚藍(lán)至凝膠底部邊緣時(shí)將分離的蛋白凝膠轉(zhuǎn)移至PVDF膜，取PVDF膜放入含有5%脫脂奶粉中封閉1 h，加入一抗稀釋液(1∶500)，4℃孵育24 h，TBST洗膜，加入二抗稀釋液(1∶2 000)，4℃孵育1 h，TBST洗膜，滴加ECL化學(xué)發(fā)光劑，曝光，利用凝膠成像系統(tǒng)及ImageJ軟件檢測(cè)條帶灰度值，以目的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參條帶灰度值的比值作為目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 曲馬多對(duì)胃癌細(xì)胞SGC-7901增殖的影響 用不同濃度的曲馬多處理胃癌細(xì)胞，與Control組比較，Tramadol 3 μg/ml組、Tramadol 30 μg/ml組、Tramadol 300 μg/ml組胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖能力顯著降低(P<0.05)。選用曲馬多濃度300 μg/ml進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。見表1。

2.2 曲馬多對(duì)SGC-7901細(xì)胞凋亡的影響 流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，與Control組比較，Tramadol組SGC-7901細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05)。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與Control組比較，Sevoflurane組SGC-7901細(xì)胞中Bax蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，Bcl2蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。見圖1、2，表2。

表1 不同濃度曲馬多對(duì)SGC-7901細(xì)胞增殖的影響

圖1 曲馬多對(duì)SGC-7901細(xì)胞凋亡的影響

圖2 Western blot檢測(cè)曲馬多對(duì)SGC-7901細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響;A Control；B Tramadol

表2 曲馬多對(duì)SGC-7901細(xì)胞凋亡的影響

2.3 曲馬多對(duì)SGC-7901細(xì)胞中miR-574-5p表達(dá)的影響 qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，與Control組比較，Tramadol組SGC-7901細(xì)胞中miR-574-5p的表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。見表3。

表3 qRT-PCR檢測(cè)曲馬多對(duì)SGC-7901細(xì)胞中miR-574-5p表達(dá)的影響

2.4 miR-574-5p對(duì)SGC-7901細(xì)胞增殖及凋亡的影響 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與Inhibitor control組比較，miR-574-5p inhibitor組SGC-7901細(xì)胞增殖能力顯著降低(P<0.05)，細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05)，Bax蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，Bcl2蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。見圖3，表4。

圖3 抑制miR-574-5p的表達(dá)對(duì)SGC-7901細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響；A Inhibitor control;B miR-574-5p inhibitor

表4 抑制miR-574-5p的表達(dá)對(duì)SGC-7901細(xì)胞增殖及凋亡的影響

2.5 miR-574-5p阻斷曲馬多對(duì)SGC-7901細(xì)胞的抑制 與Tramadol+mimic control組比較，Tramadol+miR-574-5p mimic組SGC-7901細(xì)胞增殖能力顯著升高(P<0.05)，細(xì)胞凋亡率顯著減低(P<0.05)，Bax蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，Bcl2蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。見表5，圖4。

3 討論

近年來，隨著現(xiàn)代生活節(jié)奏的加快，胃癌發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，針對(duì)胃癌的治療方式較多，而輔助藥物在治療過程中扮演重要角色，如何抑制圍手術(shù)期胃癌細(xì)胞遷移及侵襲成為研究重點(diǎn)[9,10]。因此本研究主要探究曲馬多對(duì)胃癌細(xì)胞增殖及凋亡的影響及其內(nèi)在作用機(jī)制。

表5 過表達(dá)miR-574-5p阻斷曲馬多對(duì)SGC-7901細(xì)胞的抑制

圖4 Western blot檢測(cè)SGC-7901細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)量；A Tramadol；B Tramadol+mimic control；C Tramadol+miR-574-5p mimic

曲馬多通過α2-腎上腺素受體信號(hào)傳導(dǎo)抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖，遷移及侵襲[11]。曲馬多影響結(jié)腸癌細(xì)胞系代謝變化[12]。曲馬多還可減輕膠質(zhì)瘤細(xì)胞誘導(dǎo)的大鼠股骨癌疼痛程度[13]。曲馬多通過PTEN/ PI3K/ AKT信號(hào)傳導(dǎo)抑制肺腺癌細(xì)胞的增殖，遷移及侵襲[14]。本研究通過采用不同濃度的曲馬多處理胃癌細(xì)胞，結(jié)果顯示細(xì)胞增殖能力顯著降低，細(xì)胞凋亡率顯著升高，提示曲馬多可抑制胃癌細(xì)胞增殖及促進(jìn)其凋亡。研究表明細(xì)胞凋亡相關(guān)基因Bax在胃癌組織中呈低表達(dá)，而Bcl2的表達(dá)水平升高，Bax可與Bcl2結(jié)合形成二聚體從而抑制Bcl2表達(dá)，Bcl2可抑制細(xì)胞凋亡，而Bax可通過激活線粒體途徑促進(jìn)細(xì)胞凋亡[15,16]。本研究結(jié)果顯示曲馬多處理后，胃癌細(xì)胞中Bax的表達(dá)水平升高，Bcl2的表達(dá)水平降低，提示曲馬多可能通過促進(jìn)Bax表達(dá)及抑制Bcl2表達(dá)從而促進(jìn)胃癌細(xì)胞凋亡。

miR-574-5p在肺癌組織中呈高表達(dá)，抑制miR-574-5p表達(dá)可抑制肺癌惡性進(jìn)展[17]。研究表明miR-574-5p可通過靶向PTPRU而促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌轉(zhuǎn)移[18]。LncRNA PTCSC3 在甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞中呈低表達(dá)，上調(diào)其表達(dá)可抑制miR-574-5p表達(dá)從而抑制Wnt/β-Catenin信號(hào)通路激活進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞增殖及遷移[19]。本研究結(jié)果顯示曲馬多處理后，胃癌細(xì)胞中miR-574-5p的表達(dá)水平顯著降低，進(jìn)一步研究顯示抑制miR-574-5p表達(dá)可顯著降低胃癌細(xì)胞增殖能力，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。提示曲馬多可能通過下調(diào)miR-574-5p的表達(dá)而抑制胃癌細(xì)胞增殖及促進(jìn)其凋亡。本研究進(jìn)一步證實(shí)miR-574-5p過表達(dá)后可明顯逆轉(zhuǎn)曲馬多對(duì)胃癌細(xì)胞增殖及凋亡的作用。提示曲馬多可通過抑制miR-574-5p的表達(dá)從而降低胃癌細(xì)胞增殖能力，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

綜上所述，曲馬多可抑制胃癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制與下調(diào)miR-574-5p的表達(dá)，抑制Bcl2蛋白表達(dá)及促進(jìn)Bax蛋白表達(dá)有關(guān)，為曲馬多對(duì)胃癌細(xì)胞增殖與凋亡的影響的分子機(jī)制探究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。本研究存在不足之處，關(guān)于曲馬多對(duì)胃癌細(xì)胞遷移及侵襲等其他生物學(xué)行為的影響尚未可知，同時(shí)胃癌細(xì)胞增殖與凋亡程中miR-574-5p對(duì)下游靶基因及其他相關(guān)信號(hào)通路的調(diào)控作用仍需進(jìn)一步研究。