LncRNA ZFPM2-AS1靶向miR-515-5p調控膽管癌細胞增殖、遷移和侵襲

陳杰

膽管癌(cholangiocarcinoma，CCA)是一種起源于膽管上皮細胞的高度惡性腫瘤。近年來，全球CCA發(fā)病率和死亡率不斷上升[1]。早期侵襲轉移是CCA的主要特征，確診后平均生存期低于24個月[2]。盡管化療在一定程度上改善了CCA治療現(xiàn)狀，但CCA患者5年存活率僅為30%左右[3]。因此，迫切需要了解CCA發(fā)生和轉移的分子機制，尋求新的診斷和治療方法。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，LncRNA)是一類缺乏編碼功能性蛋白功能的RNA分子，雖然最初被認為是轉錄噪聲，但有研究表明LncRNA在細胞中呈高度特異性表達，具有改變惡性腫瘤細胞增殖、侵襲和轉移能力的強大功能[4]。ZFPM2反義RNA1(ZFPM2 antisense RNA1，ZFPM2-AS1)是由ZFPM2基因座DNA反義鏈衍生而來的lncRNA，ZFPM2-AS1高表達與肺癌[5]、胃癌[6]、肝癌[7]的發(fā)生和轉移有關，是一種潛在的診斷和預后生物標志物以及治療靶點。然而，ZFPM2-AS1在CCA中的表達模式和潛在功能作用尚不清楚。本研究揭示ZFPM2-AS1在膽管癌中的表達模式，并探討了其作為CCA治療靶點的可行性。

1 材料與方法

1.1 細胞株 人膽管上皮細胞HIBEpic、人膽管癌細胞HuCCT1、人膽管癌細胞RBE購于上海通派生物科技有限公司；人膽管癌細胞TFK1細胞購自上海雅吉生物科技有限公司。

1.2 主要試劑 DMEM培養(yǎng)基、RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清購于美國Hyclone公司；LipofectamineTM 2000購于北京宜科思源科技有限公司；青鏈霉素溶液、Trizol試劑、四甲基偶氮唑藍(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)試劑、二甲基亞砜均購自北京索萊寶生物技術有限公司；Transwell小室和基質膠購于北京優(yōu)尼康生物科技有限公司；兔源細胞周期素D1(CyclinD1)抗體、兔源基質金屬蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2，MMP-2)抗體、兔源MMP-9抗體、兔源β-actin抗體、山羊抗兔IgG二抗購自武漢愛博泰克生物科技有限公司；實驗中所用載體、模擬物、抑制物及對照均在上海生工生物科技有限公司合成。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養(yǎng):HIBEpic細胞、HuCCT1細胞、TFK1細胞分別培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基中，RBE細胞培養(yǎng)于RPMI-1640培養(yǎng)基中，所有培養(yǎng)基添加10%胎牛血清和1%的青鏈霉素雙抗。置于37℃、CO2體積分數(shù)5%的培養(yǎng)箱內培養(yǎng)。

1.3.2 細胞轉染和實驗分組:將對數(shù)期RBE細胞接種到96孔板，當細胞融合度為50%時，隨機分為si-NC組(轉染小干擾RNA銀杏對照)、si-ZFPM2-AS1(轉染ZFPM2-AS1小干擾RNA)、miR-NC(轉染miRNA mimics陰性對照)、miR-515-5p組(轉染miR-515-5p mimics)、si-ZFPM2-AS1+anti-miR-NC組(共轉染si-ZFPM2-AS1和miRNA抑制物陰性對照)、si-ZFPM2-AS1+anti-miR-515-5p組(共轉染si-ZFPM2-AS1和miR-515-5p抑制物)。細胞轉染按照LipofectamineTM 2000轉染試劑說明操作步驟進行，轉染48 h檢測轉染效果。

1.3.3 RT-qPCR檢測膽管癌細胞中ZFPM2-AS1和miR-515-5p的表達:細胞總RNA抽提使用Trizol試劑，檢測RNA樣品純度和完整性均符合實驗要求，采用Takara逆轉錄酶將RNA逆轉為cDNA，利用SYBR Green qPCR Master Mix進行qPCR反應。分別以β-actin和U6為內參基因，運用2-ΔΔCt法分析ZFPM2-AS1和miR-515-5p的相對表達量。ZFPM2-AS1上游引物5’-TTTCCTACAATGAATCCACCAG-3’，下游引物5’-TTTGAGCCACTCTTTGAGG-3’；β-actin上游引物5’-GAGCCTCGCCTTTGCCGATCC-3’，下游引物5’-CGATGCCGTGCTCGATGGGG-3’；miR-515-5p上游引物TTCTCCAAAAGAAAGCACTTTCTG，下游為通用引物；U6上游引物5’-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3’，下游引物5’-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3’。

1.3.4 MTT實驗檢測膽管癌細胞的增殖活力:將對數(shù)期RBE細胞接種于96孔板，按照上述分組進行瞬時轉染，轉染48 h后，每孔加入20 μl的MTT試劑(質量分數(shù)為5 mg/ml)，培養(yǎng)箱孵育4 h，吸除各孔上清液，每孔加入150 μl二甲基亞砜反應10 min。酶標儀下檢測490 nm波長處每孔的光密度值，計算細胞增殖率。細胞增殖率=實驗組OD值/空白組OD值。

1.3.5 Transwell實驗檢測膽管癌細胞遷移和侵襲能力:細胞轉染48 h，收獲細胞，采用無血清細胞培養(yǎng)基調整為細胞濃度為1×106cells/ml的單細胞懸液。侵襲實驗時取50 μl稀釋的Matrigel基質膠小心包被于Transwell小室上室膜，風干后備用。遷移實驗采用未包被基質膠的小室。向Transwell小室上室加入300 μl細胞懸液，24孔板下室加入600 μl含20%胎牛血清的細胞培養(yǎng)基，培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)24 h。取出小室棄去上室細胞懸液，無菌棉簽輕輕擦去上室表面細胞，PBS液沖洗2次。5%戊二醛固定下室膜20 min，結晶紫染色0.1%結晶紫染色30 min。顯微鏡下隨機選擇5個視野，取均值表示細胞遷移和侵襲數(shù)目。

1.3.6 Western Blot檢測CyclinD1、MMP-2和MMP-9蛋白的表達:細胞轉染48 h分別進行細胞裂解收集細胞蛋白，檢測蛋白濃度和純度符合實驗要求。取適量蛋白樣品進行聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，并常規(guī)濕法轉移至聚偏二氟乙烯膜，封閉膜后分別進行一抗孵育和二抗孵育，最后進行化學發(fā)光顯色。采用ImageJ軟件分析，以目的條帶的灰度值和內參蛋白β-actin灰度值比值表示目的蛋白的相對表達水平。

1.3.7 雙熒光素酶報告基因實驗驗證ZFPM2-AS1對miR-515-5p的靶向調控:Starbase分析顯示ZFPM2-AS1與miR-515-5p之間存在部分特性性互補的核苷酸序列。為驗證ZFPM2-AS1對miR-515-5p的靶向作用，將含有miR-515-5p結合位點的野生型(WT-ZFPM2-AS1)以及含有miR-515-5p結合位點突變序列的突變型(MUT-ZFPM2-AS1)熒光素酶報告基因載體分別與miR-NC、miR-515-5p mimics分別共轉染RBE細胞，48 h后收獲各組細胞，采用熒光素酶活性檢測試劑盒測定各組RBE細胞中熒光素酶活性。

2 結果

2.1 膽管癌細胞系中ZFPM2-AS1和miR-515-5p表達情況 與人膽管上皮細胞HIBEpic比較，3種膽管癌細胞(RBE、HuCCT1、TFK1)中ZFPM2-AS1的表達顯著升高，miR-515-5p的表達顯著降低(P<0.05)。選擇ZFPM2-AS1上調和miR-515-5p下調最顯著的膽管癌細胞RBE進行后續(xù)研究。見表1。

表1 膽管癌細胞系中miR-515-5p和ZFPM2-AS1表達量

2.2 干擾ZFPM2-AS1表達對RBE膽管癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響 與si-NC組比較，si-ZFPM2-AS1組RBE細胞ZFPM2-AS1的表達顯著降低，CyclinD1、MMP2和MMP9蛋白的表達顯著降低，細胞增殖率、遷移和侵襲數(shù)顯著降低(P<0.05)。見表2，圖1。

表2 干擾ZFPM2-AS1表達對RBE膽管癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響

圖1 Western Blot檢測CyclinD1、MMP2和MMP9蛋白的表達

2.3 過表達miR-515-5p對RBE膽管癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響 與miR-NC組比較，miR-515-5p組RBE細胞miR-515-5p的表達顯著升高，CyclinD1、MMP-2和MMP-9蛋白的表達顯著降低，細胞增殖率、遷移和侵襲數(shù)顯著降低(P<0.05)。見圖2，表3。

圖2 Western Blot檢測CyclinD1、MMP-2和MMP-9蛋白的表達

表3 過表達miR-515-5p對RBE膽管癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響

2.4 ZFPM2-AS1靶向miR-515-5p 采用生物信息學分析工具starbase進行靶基因預測顯示ZFPM2-AS1與miR-515-5p之間存在互補配對的核苷酸序列。雙熒光素酶報告基因實驗顯示，miR-515-5p mimics和WT-ZFPM2-AS1共轉染組RBE細胞的熒光素酶活性與miR-NC和WT-ZFPM2-AS1共轉染組比較顯著降低(P<0.05)；而miR-515-5p mimics和MUT-ZFPM2-AS1共轉染組RBE細胞的熒光素酶活性與miR-NC和MUT-ZFPM2-AS1共轉染組比較無顯著變化(P>0.05)，RT-qPCR檢測ZFPM2-AS1對miR-515-5p的調控作用顯示，pcDNA-ZFPM2-AS1組RBE細胞miR-515-5p的表達較pcDNA-NC組顯著降低；si-ZFPM2-AS1組RBE細胞miR-515-5p的表達較si-NC組顯著升高(P<0.05)，提示，ZFPM2-AS1通過與miR-515-5p相互作用負性調控miR-515-5p表達。見圖3，表4、5。

圖3 starbase對miR-515-5p和ZFPM2-AS1結合進行預測

表4 miR-NC或miR-515-5p與報告質粒共轉染RBE細胞后雙熒光素酶活性檢測

表5 RT-qPCR檢測miR-515-5p的表達

2.5 抑制miR-515-5p可減弱干擾ZFPM2-AS1表達對RBE增殖、遷移和侵襲的影響 與si-ZFPM2-AS1+anti-miR-NC組比較，si-ZFPM2-AS1+anti-miR-515-5p組RBE細胞miR-515-5p的表達顯著降低，CyclinD1、MMP2和MMP9蛋白的表達顯著升高，細胞增殖率、遷移和侵襲數(shù)顯著升高(P<0.05)。見表6，圖4。

表6 抑制miR-515-5p可減弱干擾ZFPM2-AS1表達對RBE增殖、遷移和侵襲的影響

圖4 Western Blot檢測CyclinD1、MMP2和MMP9蛋白的表達

2.6 抑制miR-515-5p可減弱干擾ZFPM2-AS1表達對Wnt/β-catenin信號通路的影響 與si-NC組比較，si-ZFPM2-AS1組RBE細胞β-catenin蛋白的表達顯著降低；與si-ZFPM2-AS1+anti-miR-NC組比較，si-ZFPM2-AS1+anti-miR-515-5p組RBE細胞β-catenin蛋白的表達顯著升高(P<0.05)。見圖5，表7。

3 討論

ZFPM2-AS1在胃癌組織中表達上調，其高表達與腫瘤浸潤深度、分化程度、腫瘤大小、TNM期呈正相關，ZFPM2-AS1表達水平較高的患者總體生存期和無病生存期較差，ZFPM2-AS1促進胃癌細胞增殖，抑制細胞凋亡，并促進腫瘤生長[6]。ZFPM2-AS1在腎細胞癌中也呈高表達，其表達水平與腎細胞癌患者的淋巴結轉移、腫瘤分期及生存時間有關，ZFPM2-AS1高表達顯著促進腫瘤細胞的生長、侵襲和遷移，而對細胞凋亡有明顯的抑制作用[8]。此外，ZFPM2-AS1高表達還可促進肺癌細胞的增殖[9]。與上述研究發(fā)現(xiàn)類似，本研究顯示3種CCA細胞中ZFPM2-AS1的表達顯著升高。隨后本研究通過檢測干擾ZFPM2-AS1表達后CCA細胞生物學行為的改變進一步探索ZFPM2-AS1在CCA中的作用。功能分析表明干擾ZFPM2-AS1可抑制CCA細胞的增殖、遷移和侵襲能力。進一步分析增殖、遷移侵襲相關蛋白的表達水平發(fā)現(xiàn)促增殖蛋白CyclinD1以及促轉移蛋白MMP2、MMP9的表達顯著降低，與功能分析實驗結果一致。以上研究說明ZFPM2-AS1在CCA中發(fā)揮癌基因作用，干擾ZFPM2-AS1表達可抑制CCA進展。

圖5 Western Blot檢測β-catenin蛋白的表達

表7 低表達miR-515-5p可以部分逆轉ZFPM2-AS1低表達對Wnt/β-catenin信號通路蛋白表達的影響

LncRNA通過多種機制參與癌癥進展，其中一種是miRNA分子海綿效應[10，11]。目前，miRNA分子海綿效應已成為癌癥研究的重要工具。對CCA的相關研究顯示，LncRNA結腸癌相關轉錄子1(Colon cancer associated transcript 1，CCAT1)通過吸附miR-152促進肝內膽管癌的遷移、侵襲和上皮間充質轉化[12]。LINC01296通過吸附miR-5095在人膽管癌中促進腫瘤生長和進展[13]。為探討ZFPM2-AS1在CCA中作用機制，采用starbase預測與ZFPM2-AS1特異性結合的miRNA，發(fā)現(xiàn)miR-515-5p與ZFPM2-AS1之間存在相互作用。miR-515-5p是一種抑癌基因，研究顯示miR-515-5p在轉移性乳腺癌患者中表達較原發(fā)腫瘤患者顯著降低，miR-515-5p高表達可抑制乳腺癌細胞的遷移、轉移以及小鼠轉移模型中腫瘤的擴散，與乳腺癌患者的生存期延長有關[14，15]。此外，miR-515-5p可抑制胃癌[16]和非小細胞肺癌細胞[17]的存活和轉移。本研究顯示3種CCA細胞中miR-515-5p的表達顯著降低，與CCA中ZFPM2-AS1表達模式相反。進一步分析顯示過表達miR-515-5p抑制CCA細胞的增殖、遷移和侵襲，抑制CyclinD1、MMP2和MMP9蛋白表達。同時本研究發(fā)現(xiàn)FPM2-AS1靶向結合miR-515-5p并負調控miR-515-5p表達。此外，恢復實驗顯示抑制miR-515-5p表達可減弱干擾FPM2-AS1對CCA細胞增殖、遷移和侵襲的影響。Wnt/β-catenin信號通路在CCA中異常激活，抑制Wnt/β-catenin可抑制CCA進展[18]。本研究顯示干擾FPM2-AS1表達后Wnt/β-catenin信號通路關鍵蛋白β-catenin的表達顯著降低，且抑制miR-515-5p表達可減弱干擾FPM2-AS1對CCA細胞β-catenin表達的影響。以上結果提示，F(xiàn)PM2-AS1通過調節(jié)miR-515-5p表達參與CCA進展，其機制可能與抑制Wnt/β-catenin信號通路有關。

綜上所述，在膽管癌中FPM2-AS1呈高表達，miR-515-5p呈低表達。干擾FPM2-AS1通過上調miR-515-5p可抑制CCA細胞的增殖、遷移和侵襲，其機制可能與抑制Wnt/β-catenin信號通路有關。FPM2-AS1/miR-515-5p分子軸有望成為膽管癌診療的新靶點。