藤茶總黃酮固體脂質(zhì)納米粒在大鼠體內(nèi)腸吸收特性研究

張瑜倪，楊毛毛，張 瑞，林珠燦，郭素華

（福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建 福州350122）

藤茶為葡萄科植物顯齒蛇葡萄［Ampelopsis grossedentata（Hand-Mazz）W.T.Wang］的 嫩 莖 葉［1］，其味甘淡、性涼，具有清熱解毒、祛風(fēng)濕之功效［2］?，F(xiàn)代研究表明：藤茶中富含黃酮類化合物，其中，二氫楊梅素（又稱福建茶素）為其主要活性成分，其含量可達(dá)30%［3］?，F(xiàn)代藥理研究表明：藤茶總黃酮具有增強(qiáng)免疫功能、抗腫瘤、抗氧化、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抑菌消炎、保肝護(hù)肝、降糖降脂、改善胰島素抵抗等多種功能及對(duì)腦缺血再灌損傷的保護(hù)作用［4-7］。然而藤茶總黃酮中主要活性成分二氫楊梅素具有鄰三酚羥基結(jié)構(gòu)，易被氧化，穩(wěn)定性較差，有較低的水溶性和脂溶性［8-9］，且其穿透腸道黏膜的能力較差，體內(nèi)半衰期短，口服生物利用度低等［10-11］，嚴(yán)重影響了體內(nèi)藥效和臨床應(yīng)用。

固體脂質(zhì)納米粒（SLN）作為一種新型的藥物載體，可延長(zhǎng)藥物的半衰期，進(jìn)而提高藥效成分的生物利用度；同時(shí)具備降低毒性、改善藥物溶解性和生物相容性、提高穩(wěn)定性及靶向性、緩釋控釋等特點(diǎn)［12-15］；此外，SLN可有效減少胃腸道環(huán)境對(duì)藥物的破壞，當(dāng)小粒徑納米粒攜帶藥物經(jīng)過(guò)胃腸道時(shí)，可以通過(guò)胃腸道及其淋巴吸收，減少肝臟首過(guò)效應(yīng)［16］?；谇捌谔俨杩傸S酮固體脂質(zhì)納米粒的研制、處方的優(yōu)化及體外釋藥行為的考察，本研究通過(guò)大鼠在體單向腸灌流實(shí)驗(yàn)，考察了藤茶總黃酮原料藥和固體脂質(zhì)納米粒在腸道不同部位的吸收情況。

1 材 料

1.1 試藥 藤茶總黃酮固體脂質(zhì)納米粒凍干粉（課題組成員自制，批號(hào)：20181215，納米粒中二氫楊梅素含量為40.15 mg／mL）；藤茶總黃酮原料藥（課題組成員自制，批號(hào)：20180402）；二氫楊梅素（上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)：160422，純度≥98%）；楊梅苷（北盈澤納新化工技術(shù)研究院，批號(hào)：15081713，純度為99.41%）；楊梅素（北京盈澤納新化工技術(shù)研究院，批號(hào)：15050810，純度為98.31%）；酚紅（北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)：20060767）；甲醇為色譜純（德國(guó)Merck公司）；水為超純水；氯化鈉、氯化鉀、磷酸二氫鈉、碳酸氫鈉、六水氯化鎂、無(wú)水氯化鈣、葡萄糖均為分析純。

1.2 儀器 BT100-1F蠕動(dòng)泵（河北保定蘭格恒流泵有限公司）；HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州普森電子儀器廠）；LC-20A高效液相色譜儀、SPD-M20A紫外檢測(cè)器、UV 3600紫外分光光度儀（日本島津公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)SD雄性大鼠12只，體質(zhì)量（220±20）g，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，實(shí)驗(yàn)前在福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院動(dòng)物房適應(yīng)7 d，許可證號(hào)：SCXK（滬）2017-0005，合格證編號(hào)：20170005005003。腸吸收實(shí)驗(yàn)需大鼠體重增長(zhǎng)至300～330 g。

2 方 法

2.1 溶液的配制

2.1.1 Krebs-Ringer溶液的配制 稱量NaCl 7.80 g、CaCl20.37g、KCl 0.35 g、MgCl20.02 g、NaHCO31.37 g、NaH2PO4·2H2O 0.32 g、葡萄糖1.40 g（臨用前添加），加入適量蒸餾水溶解，并用1 mol／L磷酸溶液調(diào)pH值至6.8，加蒸餾水定容至1 L，備用。

2.1.2 酚紅溶液的配制 稱量20 mg酚紅粉末溶解于1 L的Krebs-Ringer溶液中，攪拌并混勻。

2.1.3 灌流液的配制 將藤茶總黃酮固體脂質(zhì)納米粒凍干粉及其原料藥分別溶解于酚紅溶液中，得到濃度為48 mg／mL的2種灌流液。

2.1.4 混合對(duì)照品的配制 分別精密稱取一定量的二氫楊梅素、楊梅苷、楊梅素置于10 mL容量瓶，甲醇溶解定容，配制濃度分別為560.00、7.31、14.24μg／mL，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 腸灌流液中酚紅濃度的測(cè)定

2.2.1 酚紅最大吸收波長(zhǎng)的測(cè)定 取“2.1.3”項(xiàng)中含酚紅和藥物的灌流液，以及含酚紅Krebs-Ringer溶液各0.5 mL于試管中，加入0.2 mol／L NaOH溶液5 mL，搖勻，置于紫外分光光度儀400～700 nm下掃描（空白對(duì)照為0.2 mol／L NaOH溶液），測(cè)得酚紅的最佳吸收波長(zhǎng)是559 nm。

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的配制 配制酚紅的標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度依次為2.5、10.0、20.0、30.0、40.0、50.0、60.0μg／mL，各取0.5 mL，再加入0.2 mol／L NaOH溶液5 mL，搖勻，在559 nm下測(cè)定并記錄其吸光度（空白對(duì)照為0.2 mol／L NaOH溶液），以吸光度（A）和濃度（C）分別為縱坐標(biāo)和橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1。

圖1 酚紅濃度測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2.3 酚紅濃度的確定 將大鼠各腸段各時(shí)間點(diǎn)（每15 min收集1次）流出的腸灌流液樣品過(guò)濾，取續(xù)濾液0.5 mL，按照“2.2.2”項(xiàng)下的方法測(cè)得吸光度，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算大鼠腸灌流液樣品中的酚紅濃度。

2.3 腸灌流液中總黃酮含量測(cè)定及方法學(xué)考察

2.3.1 色譜條件 色譜柱：TOPODS-AQ柱（4.6 mm×250 mm，5μm）；流動(dòng)相：甲醇（A）-0.1%磷酸水溶液（D）；梯度洗脫：0～10 min，35%A；10～20 min，35%A→80%A；20～30 min，80%A。檢測(cè)波長(zhǎng)：二氫楊梅素為291 nm，楊梅苷與楊梅素為252 nm；流速：1.0 ml／min；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10μL。

2.3.2 專屬性 分別取混合對(duì)照品溶液、空白灌流液（酚紅溶液）、藤茶總黃酮固體脂質(zhì)納米粒灌流液及原料藥灌流液，按照“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，獲取譜圖。見(jiàn)圖2。

2.3.3 線性關(guān)系 精密吸取混合對(duì)照品溶液0.2、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、10.0 mL分別置于10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋成系列濃度的對(duì)照品溶液。按照“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析。以對(duì)照品峰面積（A）為縱坐標(biāo)，濃度（C）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到二氫楊梅素、楊梅苷、楊梅素的線性回歸方程，結(jié)果見(jiàn)“3.1.2”。

2.3.4 精密度試驗(yàn) 精密移取混合對(duì)照品溶液100μL置于2 mL離心管，加入200μL酚紅溶液和700μL甲醇，渦旋混勻，離心，取上清液按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件檢測(cè)。其中日內(nèi)精密度為1 d內(nèi)連續(xù)測(cè)定上清液6次，日間精密度為取上清液連續(xù)測(cè)定3 d，分別計(jì)算日內(nèi)精密度和日間精密度的RSD。

2.3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 按照“2.3.4”項(xiàng)同法制備上清液，分別于0、2、4、6、8、12、24 h按照“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積以計(jì)算RSD。

2.3.6 提取回收率試驗(yàn) 精密移取混合對(duì)照品溶液500μL，分別置于6個(gè)10 mL容量瓶中，接著以含有酚紅、空白SLN的Krebs-Ringer溶液定容，混勻，則3個(gè)成分的濃度分別為28、0.37、0.71μg／mL溶液；精密吸取6個(gè)容量瓶中上述溶液各100μL，按照“2.3.4”項(xiàng)下方法處理得上清液，用HPLC測(cè)定，記錄峰面積為A1；另精密吸取6個(gè)容量瓶中上述溶液各100μL，加入900μL甲醇渦旋混勻，0.45μm濾膜過(guò)濾，用HPLC精密檢測(cè)，記錄峰面積為A2，計(jì)算回收率。公式為：

2.4 大鼠在體腸吸收試驗(yàn)

2.4.1 在體單向腸灌流實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷慕?將SD大鼠隨機(jī)分為藤茶總黃酮納米粒組、原料藥組，每組6只。取自由飲水條件下禁食12 h的大鼠，腹腔注射烏拉坦溶液5 mL／kg麻醉并固定，保持大鼠37℃的體溫，沿腹中線切開(kāi)腹部約4 cm，尋找待分析腸段（十二指腸、空腸、回腸、結(jié)腸），在兩端剪口插管，結(jié)扎；先用37℃生理鹽水清洗腸道，排空；接著用37℃灌流液以0.2 mL／min的恒速灌注腸道，平衡30 min后開(kāi)始計(jì)時(shí)，每15 min收集一次出口管的腸灌流液。灌注實(shí)驗(yàn)結(jié)束后分別測(cè)量每段腸段的長(zhǎng)度（L）和內(nèi)徑（R），以計(jì)算相應(yīng)灌流腸段的體積（V）與表面積（A），最后采用HPLC檢測(cè)出口管腸灌流液中的藥物濃度。

2.4.2 吸收參數(shù)的計(jì)算 小腸在吸收藥物的同時(shí)也吸收、分泌水分，致使灌流液體積發(fā)生變化，故計(jì)算腸吸收參數(shù)采用酚紅法。數(shù)據(jù)采用SPSS 28.0軟件分析。公式為：

ρin和ρout分別表示進(jìn)出口待測(cè)藥物的濃度，ρ（PR）in和ρ（PR）out分別表示灌流液中酚紅（PR）在腸段進(jìn)、出口的濃度，Q為灌流速度，A為所灌流腸段的面積，F(xiàn)a為各時(shí)間段樣品中藥物的平均吸收分?jǐn)?shù)，Papp為表觀通透系數(shù)。

3 結(jié) 果

3.1 灌流液中總黃酮含量測(cè)定及方法學(xué)考察結(jié)果

3.1.1 專屬性 如圖2所示，灌流液中其他雜質(zhì)對(duì)二氫楊梅素、楊梅苷、楊梅素檢測(cè)無(wú)干擾。

圖2 各樣品的HPLC色譜圖

3.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 二氫楊梅素的回歸方程：y＝25 908x＋37 417，r＝0.999 9，表明二氫楊梅素在11.2～560.00μg／mL線性關(guān)系良好；楊梅苷的回歸方程：y＝26 152x－3 612.5，r＝0.999 2，表明楊梅苷在0.15～7.31μg／mL線性關(guān)系良好；楊梅素的回歸方程：y＝45 234x－1 851.8，r＝0.999 5，表明楊梅素在0.28～14.24μg／mL線性關(guān)系良好。

3.1.3 精密度試驗(yàn) 由表1和表2可知，日內(nèi)、日間精密度平均RSD均小于3%，符合要求。

3.1.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 由表3可知，RSD結(jié)果在0.53%～2.77%內(nèi)，符合方法學(xué)要求。

表1 灌流液中總黃酮日內(nèi)精密度

表2 灌流液中總黃酮日間精密度（n＝6）

表3 灌流液中總黃酮穩(wěn)定性（n＝6）

3.1.5 回收率試驗(yàn) 由表4可知，二氫楊梅素提取回收率平均值為101.08%，楊梅苷為94.47%，楊梅素為97.80%，說(shuō)明樣品的處理及檢測(cè)過(guò)程對(duì)3個(gè)成分的含量影響較小，符合要求。

3.2 在體單向腸灌流實(shí)驗(yàn)結(jié)果 見(jiàn)圖3和圖4，結(jié)果顯示：總黃酮原料藥及納米粒在整個(gè)小腸腸段均有不同程度的吸收，在中上腸段的吸收尤其明顯，納米粒在4個(gè)腸段的平均吸收分?jǐn)?shù)（Fa）和表觀通透系數(shù)（Papp）均高于原料藥。納米粒在十二指腸、空腸、回腸、結(jié)腸的Fa值分別為原料藥的1.89、2.07、1.47、1.84倍，在四個(gè)腸段的Papp分別是原料藥的1.80、3.02、1.65、1.95倍。經(jīng)兩樣本t檢驗(yàn)，與原料藥相比，納米粒在十二指腸、空腸的Fa有非常顯著升高（P＜0.01），在回腸和結(jié)腸明顯升高（P＜0.05），納米粒在空腸的Papp顯著升高（P＜0.05），而在其他3個(gè)腸段的Papp均無(wú)差異（P＞0.05）。

圖3 納米粒組及原料藥組總黃酮在不同腸段F a比較

圖4 納米粒組及原料藥組總黃酮在不同腸段P app比較

綜合平均吸收分?jǐn)?shù)和表觀通透系數(shù)的結(jié)果來(lái)看，藤茶總黃酮固體脂質(zhì)納米粒在空腸的吸收較好，其次是回腸、十二指腸、結(jié)腸；而總黃酮原料藥的最大吸收在回腸，其次是空腸、十二指腸和結(jié)腸，說(shuō)明將藤茶總黃酮制備成固體脂質(zhì)納米粒口服制劑，可增強(qiáng)總黃酮在腸道的吸收，甚至改變了最佳吸收腸段。

4 討 論

口服給藥是中藥最主要的傳統(tǒng)給藥方式，腸吸收是其最主要的吸收途徑。研究藥物口服后腸道的吸收情況對(duì)評(píng)價(jià)藥物的生物利用度、改進(jìn)藥物的劑型、提高療效具有非常重要的意義［17］。本實(shí)驗(yàn)采用在體實(shí)驗(yàn)法，向大鼠腸道單向灌流藥物溶液，以評(píng)價(jià)藤茶總黃酮固體脂質(zhì)納米粒及其原料藥在不同腸段的吸收。相較于外翻腸囊法，在體單向腸灌流能夠保證腸道神經(jīng)和內(nèi)分泌輸入的完整性，同時(shí)也保證血液和淋巴液的供應(yīng)。藥物透過(guò)上皮細(xì)胞后被血液運(yùn)走，避免了胃內(nèi)容物、消化管固有運(yùn)動(dòng)等生理影響。

對(duì)照組藤茶總黃酮溶液在4個(gè)腸段的平均吸收分?jǐn)?shù)和表觀通透系數(shù)均低于納米粒組，可能是因?yàn)榭傸S酮的水溶性差，被腸道吸收困難。而納米粒組的平均吸收分?jǐn)?shù)和表觀通透系數(shù)均有所提高，推測(cè)可能與納米粒所帶電荷有關(guān)，帶負(fù)電荷的納米粒，具有較好的生物黏附特性，更容易透過(guò)腸道的粘液層，有效增加了其與腸道的接觸，從而以被動(dòng)擴(kuò)散或內(nèi)吞的方式被小腸上皮細(xì)胞吸收。這需要通過(guò)Caco-2細(xì)胞攝取和轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步確證［18-21］。另一方面，制備固體脂質(zhì)納米粒所用脂質(zhì)載體和乳化劑的特殊性，以及制備過(guò)程中水油兩相混合乳化充分，再經(jīng)過(guò)探頭超聲后減小粒徑，增強(qiáng)總黃酮納米粒的滲透性，從而能迅速穿過(guò)黏液層接觸腸細(xì)胞被吸收。

本實(shí)驗(yàn)借助大鼠在體單向腸灌流模型，以酚紅作為指示方法來(lái)檢測(cè)比較納米粒制劑和其原料藥在體內(nèi)不同腸段的吸收程度，該法穩(wěn)定、可靠，實(shí)驗(yàn)的可操作性強(qiáng)，可以普遍應(yīng)用。經(jīng)實(shí)驗(yàn)考察發(fā)現(xiàn)，將藤茶總黃酮制備成固體脂質(zhì)納米?？诜苿?，可增強(qiáng)總黃酮在腸道的吸收，甚至改變了最佳吸收腸段，即納米粒的最佳吸收腸段為空腸腸段，而原料藥為回腸。