母源因子boule在光棘球海膽性腺中的表達(dá)與定位

韓亞倫，魏金亮，崔洲平，張健，張偉杰，溫斌，常亞青，孫志惠

(大連海洋大學(xué) 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部北方海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連 116023)

精子缺乏基因(deleted in azoospermia,DAZ)是精子生成調(diào)控因子，DAZ基因家族成員均包含一個(gè)保守的RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，并在生殖細(xì)胞中特異表達(dá)。由DAZ基因家族編碼的RNA結(jié)合蛋白在調(diào)控動(dòng)物生殖細(xì)胞分化與發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用[1-3]。目前,在DAZ基因家族中，研究較多的基因?yàn)閎oule、daz和dazl，其中，boule和dazl位于常染色體，daz位于Y染色體。boule是DAZ基因家族的最原始成員，在生殖細(xì)胞中特異表達(dá)，其分子結(jié)構(gòu)和功能高度保守[4-5]。

boule基因在調(diào)控生殖細(xì)胞發(fā)育和分化的過程中發(fā)揮了重要作用，在不同物種中其表達(dá)模式也不同。在哺乳動(dòng)物中，boule在精巢中特異表達(dá)，缺失boule會(huì)導(dǎo)致生精細(xì)胞分化為成熟精子的過程受阻，使人類患無精子癥[6]；在果蠅中，boule也在精巢中特異表達(dá)，缺失boule會(huì)使精子發(fā)生的進(jìn)程一直停滯在初級(jí)精母細(xì)胞向次級(jí)精母細(xì)胞分化的階段，從而使精子發(fā)生停止[7]；在線蟲中，boule僅在卵巢中表達(dá)[8]，boule的缺失會(huì)使卵子發(fā)生的減數(shù)分裂過程受阻，從而造成卵子發(fā)生障礙[9]；在淡水養(yǎng)殖動(dòng)物中，青鳉和虹鱒卵巢和精巢中均能檢測(cè)到boule的表達(dá)[10-11]；在海水養(yǎng)殖動(dòng)物中，櫛孔扇貝boule在除了成熟精子外的一切雄性生殖細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)[12]，紫海膽boule在其精巢中表達(dá)，但在卵巢中的表達(dá)較精巢微弱[13]。目前，針對(duì)boule在海水養(yǎng)殖動(dòng)物尤其是棘皮動(dòng)物中的研究較少，其表達(dá)情況及作用機(jī)理尚不明確。

光棘球海膽Mesocentrotusnudus隸屬于棘皮動(dòng)物門Echinodermata游在亞門Eleutherozea海膽綱Echinoidea正形目Camarodonta球海膽科Strongylocentrotidae，俗稱大連紫海膽，是西北太平洋沿岸水域較常見的經(jīng)濟(jì)海膽類之一，也是中國(guó)北方沿海最主要的經(jīng)濟(jì)種類之一[14]。光棘球海膽體型屬于大中型，性腺是其唯一可食用部分，成熟季節(jié)生殖腺呈淡黃色至橙黃色，質(zhì)量好，富含不飽和脂肪酸[15]，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，適合于加工冰鮮海膽。本研究中，以光棘球海膽為研究對(duì)象，通過克隆獲得光棘球海膽boulecDNA序列全長(zhǎng)，追蹤了boule在光棘球海膽組織、各時(shí)期性腺及早期胚胎發(fā)育過程中的表達(dá)情況，并通過切片原位雜交技術(shù)對(duì)boule基因在性腺細(xì)胞中的定位情況進(jìn)行了分析，旨在為海膽生殖細(xì)胞的深入研究提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)用光棘球海膽采自大連黃海海域(121°33′47″E，38°51′55″N)，直徑為(60.2±3.8)mm，濕體質(zhì)量為(76.8±10.0)g。試驗(yàn)開始前將海膽暫養(yǎng)于大連海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部北方海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室循環(huán)水槽，水溫為(12.41±0.11)℃，pH 為7.96±0.02，每?jī)商鞊Q水一次(換水量約30 L)，每天投喂一次海帶[16]。

試驗(yàn)用去離子甲酰胺購(gòu)自AMRESCO(美國(guó))，DiethylPyrocarbonate(DEPC)購(gòu)于Sigma-Aldrich?(上海)，馬來酸、Tween、20×SSC和PBS磷酸緩沖液粉末均購(gòu)自索萊寶公司(北京)。

1.2 方法

1.2.1 組織總RNA的提取及cDNA的合成 解剖海膽，將所取組織樣品迅速置于液氮中速凍后保存于超低溫冰箱(-80 ℃)中備用。組織總RNA的提取按照SV Total RNA Isolation System(Promega Z3100)說明書進(jìn)行，提取完畢后利用微量分光光度計(jì)Agilent 2100 Bioanalyzer (Aligent Technologies, Santa Clara, CA, USA)及瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的濃度及完整性。然后取1 μg總RNA，按照SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit(Clontech 634923)說明書操作建立cDNA文庫?？俁NA的反轉(zhuǎn)錄參照PrimerScriptTMRT reagent Kit(TaKaRa 634860)說明書進(jìn)行。

1.2.2 cDNA全長(zhǎng)克隆 在前期研究中，本實(shí)驗(yàn)室獲得了光棘球海膽性腺轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫[17]，本研究中以人DAZL蛋白序列中保守的RRM結(jié)構(gòu)域?yàn)椴樵冃蛄校樵兊搅薭oule基因部分序列，設(shè)計(jì)5′和3′RACE引物(表1，設(shè)計(jì)網(wǎng)站：http://biotools. nubic.northwestern,edu/OligoCalc.html),并按照SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit(Clontech 634923)說明書克隆boulecDNA全長(zhǎng)。PCR擴(kuò)增使用的酶為L(zhǎng)A Taq酶(TaKaRa RR02MA)。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃下預(yù)變性2 min；94 ℃下循環(huán)變性30 s，55 ℃下退火復(fù)性30 s，72 ℃下延伸1 min，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；最后在72 ℃下再延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，將其切膠回收并純化，隨后連接至pMD18-T 載體并轉(zhuǎn)化入Trans5α感受態(tài)細(xì)胞中，搖床震蕩1 h后將其均勻涂布于LB培養(yǎng)基平板上，37 ℃下倒置過夜。次日，用滅菌牙簽挑取單菌落于盛有液體LB培養(yǎng)基的離心管中，搖床震蕩，菌落PCR篩選陽性克隆并測(cè)序。

表1 PCR所用引物Tab.1 Sequences of the primers used for PCR

1.2.3boule序列及系統(tǒng)進(jìn)化分析 利用NCBI中ORF-Finder預(yù)測(cè)boule基因的開放閱讀框；使用SMART(http：//smart.embl-heidelberg.de/)及ExPasy中的Protparam工具(https：//web.expasy. org/ protparam/)預(yù)測(cè)Boule蛋白的結(jié)構(gòu)域和基本理化性質(zhì)；使用Predict(Proteinhttps://www. predictprotein.org/)及Swiss-model(https：//swissmodel.expasy.org/)分析Boule蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)；利用Clustal W進(jìn)行多重序列比對(duì)，并用MEGA 7.0軟件對(duì)Boule氨基酸序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析。

1.2.4 熒光定量PCR檢測(cè)基因表達(dá) 首先，取3只光棘球海膽，獲得腸、管足、體腔液、性腺的組織樣品。其次，考慮到boule基因在性腺中的表達(dá)量較高，本試驗(yàn)中通過持續(xù)取樣，獲得處于不同發(fā)育時(shí)期包括恢復(fù)期(stage Ⅰ)、生長(zhǎng)期(stage Ⅱ)、成熟前期(stage Ⅲ)和成熟期(stage Ⅳ)的性腺樣品。最后，通過催產(chǎn)并持續(xù)取樣，獲得光棘球海膽受精卵、4細(xì)胞期、8細(xì)胞期、16細(xì)胞期、囊胚、破膜期、棱柱幼蟲、四腕幼蟲和六腕幼蟲的胚胎樣品。

利用熒光定量PCR檢測(cè)各樣品的boule基因表達(dá)，每個(gè)樣品孔進(jìn)行3次技術(shù)重復(fù)，熒光定量PCR試驗(yàn)總體進(jìn)行3次驗(yàn)證。以Ubiquitin為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt方法計(jì)算boule基因在各組織、各時(shí)期性腺組織、各胚胎發(fā)育時(shí)期的表達(dá)情況。熒光定量PCR儀器為L(zhǎng)ightCycler?96(Roche)。PCR反應(yīng)體系(共20 μL)包括：Fast Start Essential DNA Green Master 10 μL，上、下游引物各0.8 μL，cDNA 2 μL，DEPC水 6.4 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃下預(yù)變性10 min；95 ℃下循環(huán)變性15 s，60 ℃下退火復(fù)性60 s，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)；95 ℃下反應(yīng)10 s，65 ℃下反應(yīng)60 s，97 ℃下反應(yīng)1 s。

1.2.5 RNA探針合成 在boule的cDNA全長(zhǎng)序列中設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增后將特異的目的片段用切膠回收的方式進(jìn)行DNA純化，置于-20 ℃下備用。按照T7 RNA Polymerase(Roche，10881767001)和DIG RNA labeling mix(Roche，11277073910)說明書制備RNA探針，即在無酶微量離心管中配制PCR反應(yīng)體系，PCR product or DNA 1 μg，DIG RNA Labeling Mix 1 μL，Transcription buffer 1 μL，T7酶 1 μL，RNAsein 0.5 μL，用DEPC水補(bǔ)足至總體積為10 μL，離心混勻后于37 ℃下反應(yīng)2 h。完成后，加入1 μL DNA酶，37 ℃反應(yīng)15 min，以消化剩余模板，反應(yīng)結(jié)束后加入1 μL 0.2 mol/L EDTA終止消化，隨后加入預(yù)冷后的2.5 μL 4 mol/L LiCl和75 μL無水乙醇，-20 ℃下沉淀過夜。次日，在4 ℃條件下，以16 170×g離心15 min，再用體積分?jǐn)?shù)為75%的無水乙醇洗滌兩次，最后加入25 μL DEPC水溶解RNA，并用微量分光光度計(jì)及瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA探針的濃度及質(zhì)量。

1.2.6 RNA原位雜交 參照本實(shí)驗(yàn)室以前的方法進(jìn)行[18]。

1) 樣品處理。以光棘球海膽卵巢及精巢各時(shí)期的性腺樣品為試驗(yàn)組，以光棘球海膽精巢生長(zhǎng)期性腺樣品為對(duì)照組。將海膽性腺組織置于4%(體積分?jǐn)?shù))多聚甲醛中固定過夜；第2天，用DEPC-PBS搖洗3次，每次5 min，然后用300 g/L蔗糖-PBS溶液滲透過夜；第3天，使用冰凍包埋劑(OCT)進(jìn)行包埋，包埋時(shí)注意組織方向；隨后用LeicaCM1900-1-1進(jìn)行冷凍切片，切片完畢后，將玻片于37 ℃烤箱中烘烤1 h。

2) 固定。烘烤后的玻片置于盛滿DEPC-PBS的臥缸中復(fù)水，室溫?fù)u洗2次，每次5 min，用4%(體積分?jǐn)?shù))多聚甲醛固定30 min后，再將玻片置于盛滿DEPC-PBS的臥缸中搖洗2次，每次5 min。

3) 雜交。在每個(gè)濕盒上平鋪3張濾紙，用濕盒緩沖液(20×SSC 2.5 mL、DEPC水22.5 mL、去離子甲酰胺25 mL)充分浸透濾紙，探針預(yù)變性(70 ℃，5 min)后，每個(gè)玻片上滴加200 μL雜交液，蓋上蓋玻片，用封口膜封住濕盒邊緣，置于60 ℃雜交箱中，雜交16～20 h。

4) 洗脫。配制洗脫液(20×SSC 12.5 mL、去離子甲酰胺125 mL、Tween 0.25 mL、無菌水112.5 mL)和0.2×SSC，預(yù)熱至63 ℃。將玻片浸入盛有洗脫液的臥缸，輕柔搖掉蓋玻片，63 ℃下?lián)u洗2次，每次30 min；用0.2×SSC在63 ℃下?lián)u洗2次，每次30 min；MABT室溫?fù)u洗2次，每次30 min；隨后用封阻液(體積分?jǐn)?shù)為10%的山羊血清+體積分?jǐn)?shù)為90%的MABT)室溫封阻1 h；抗體孵育(體積分?jǐn)?shù)為2%的山羊血清+體積分?jǐn)?shù)為98%MABT+Anti-dig-body，抗體的使用比例為 1∶5 000)，4 ℃下過夜。

5) 顯色及鏡檢。用MABT室溫?fù)u洗3次，每次5 min；用堿性磷酸酶顯色緩沖液室溫?fù)u洗3次，每次5 min；按照說明書配制顯色液(碧云天，C3206)，避光顯色，顯色完成后， 用PBS室溫?fù)u洗2次，每次5 min；然后進(jìn)行甲醇梯度脫色(25%、50%、75%、100%、75%、50%、25%，均為體積分?jǐn)?shù))，每次5 min；再用PBS室溫?fù)u洗2次，每次5 min，完成后甘油封片，并使用顯微鏡(Leica DM4B)拍照。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA)，采用Duncan法進(jìn)行組間多重比較，顯著性水平設(shè)為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 boule cDNA全長(zhǎng)序列分析

本研究中，克隆得到boulecDNA全長(zhǎng)序列為1 788 bp，其中，5′UTR為146 bp，3′UTR為601 bp，開放閱讀框(open reading frame，ORF)長(zhǎng)度為1 041 bp，共編碼346個(gè)氨基酸。結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)結(jié)果表明，Boule蛋白具有一個(gè)進(jìn)化上高度保守的RRM結(jié)構(gòu)域(圖1)，Boule蛋白理論相對(duì)分子質(zhì)量為38 070，理論等電點(diǎn)為7.84。Boule蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中包含27.46%的α -螺旋(Alpha helix，H)、13.58%的延伸鏈(Extended strand，E)和58.96%的無規(guī)則卷曲(Random coli，C)。將Boule蛋白以人的Dazl蛋白三維結(jié)構(gòu)為模板(模板號(hào)：2xs5.1.A)進(jìn)行同源建模，發(fā)現(xiàn)Boule蛋白在第39個(gè)氨基酸(右框)和第112個(gè)氨基酸(左框)處存在彎曲和延伸的β1、β4鏈，這種構(gòu)象在不同物種的蛋白序列中十分保守，對(duì)于RNA識(shí)別至關(guān)重要(圖2)。Boule蛋白疏水殘基106個(gè)，親水殘基232個(gè)，親水殘基數(shù)大于疏水殘基數(shù)，為親水性蛋白。

加粗部分為起始和終止密碼子；畫線部分為RRM。 Bold part indicates the start codon and the stop codon;RRM is indicated by underlined part.圖1 光棘球海膽boule基因cDNA序列及預(yù)測(cè)的氨基酸序列Fig.1 Full-length cDNA and the deduced amino acid sequence of boule gene in the sea urchin Mesocentrotus nudus

黑色框架內(nèi)代表的是以人Dazl蛋白為模板推測(cè)的Boule蛋白存在的β1、β4卷曲結(jié)構(gòu)。Black frame represents the β1 and β4 coil structure of Boule protein based on human Dazl protein as template.圖2 Boule蛋白結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)及其蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.2 Prediction of Boule protein domain and protein tertiary structure

2.2 多重序列比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化分析

用于多重序列比對(duì)物種及其Boule氨基酸序列在NCBI中的登錄號(hào)見表2。氨基酸序列比對(duì)結(jié)果，光棘球海膽與紫海膽StrongylocentrotuspurpuratusBoule氨基酸序列一致性最高，為66.48%，與長(zhǎng)棘海星Acanthasterplanci的一致性達(dá)到43.26%，與其他脊椎動(dòng)物如黑腹果蠅Drosophilamelanogaster、虹鱒Oncorhynchusmykiss、大西洋鮭Salmosalar、原雞Gallusgallus和人Homosapiens的一致性較低，分別為22.83%、20.62%、30.45%、27.43%、29.55%(圖3(a))。光棘球海膽B(tài)oule蛋白具有一個(gè)進(jìn)化上保守的RRM結(jié)構(gòu)域，與紫海膽B(tài)oule氨基酸序列的一致性高達(dá)99.15%，與其他動(dòng)物的一致性為41.53%～56.78%(圖3(b))。

表2 多重序列比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化樹所用的Boule信息

圖3 boule基因編碼的氨基酸多序列比對(duì)及結(jié)構(gòu)域序列比對(duì)Fig.3 Multiple sequence alignment and domain sequence alignment of amino acids encoded by the boule gene

基于以上試驗(yàn)結(jié)果，利用MEGA7構(gòu)建了Neighbor-joining(NJ)系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果顯示，光棘球海膽、紫海膽和長(zhǎng)棘海星的Boule氨基酸序列聚為一支，基本符合物種親緣進(jìn)化趨勢(shì)(圖4)。

圖4 Boule氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.4 Phylogenetic tree of Boule amino acid sequences

2.3 boule基因的組織表達(dá)分析

在光棘球海膽生長(zhǎng)期(stageⅡ)的腸、管足、體腔細(xì)胞、卵巢及精巢中，均檢測(cè)到了boule的表達(dá)，表達(dá)情況為精巢>卵巢>管足>腸>體腔液,其中，boule在精巢中表達(dá)量最高，且在精巢與卵巢中呈現(xiàn)差異表達(dá)，在精巢中的表達(dá)量約為卵巢中的25倍(圖5)。

圖5 boule基因的組織表達(dá)分析Fig.5 Expression of boule gene in adult tissues

2.4 boule基因在不同時(shí)期性腺中的動(dòng)態(tài)表達(dá)分析

熒光定量PCR結(jié)果表明，boule基因表達(dá)量在卵巢中總體呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，直至成熟期(stage Ⅳ)表達(dá)量最高；精巢中的boule表達(dá)量?jī)H在生長(zhǎng)期(stage Ⅱ)及成熟前期(stage Ⅲ)較高(圖6)。

*表示與卵巢恢復(fù)期有顯著性差異(P<0.05)。 * means significant difference compared with stage Ⅰ of the ovary(P<0.05).圖6 boule基因在不同性腺發(fā)育時(shí)期的動(dòng)態(tài)表達(dá)分析Fig.6 Dynamic expression analysis of boule gene in different gonadal development stages

通過RNA切片原位雜交技術(shù)檢測(cè)boule基因在性腺細(xì)胞中的定位，結(jié)果顯示，僅在生長(zhǎng)期及成熟前期的精巢中檢測(cè)到陽性細(xì)胞信號(hào)，其余時(shí)期未檢測(cè)到信號(hào)(圖7)。可能是由于表達(dá)量低、卵巢中的RNA不穩(wěn)定及卵黃沉積等原因，并未在卵巢中檢測(cè)到明顯的陽性細(xì)胞信號(hào)。

NP—營(yíng)養(yǎng)吞噬細(xì)胞；SC—精細(xì)胞；GC—生殖細(xì)胞。 NP—nutritive phagocyte；SC—sperm cell；GC—germ cell.圖7 切片原位雜交分析boule基因在精巢組織中的表達(dá)情況Fig.7 Expression of boule gene in testis by section in situ hybridization (SISH) analyses

2.5 boule基因在胚胎發(fā)育時(shí)期的表達(dá)特性分析

通過熒光定量PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：光棘球海膽胚胎發(fā)育過程中，在受精卵內(nèi)檢測(cè)到大量boule轉(zhuǎn)錄本，由此說明boule為母源因子；隨著細(xì)胞的增殖與分化和胚胎發(fā)育過程的進(jìn)行，boule基因表達(dá)量逐漸降低，直到棱柱幼蟲時(shí)期降到最低；從棱柱幼蟲時(shí)期開始，由于幼蟲開始變態(tài)及開始攝取餌料，boule基因表達(dá)量隨著幼蟲的發(fā)育，又呈現(xiàn)出逐漸升高的態(tài)勢(shì)(圖8)。

圖8 boule基因在胚胎發(fā)育時(shí)期的表達(dá)分析Fig.8 Expression of boule gene in embryonic development

3 討論

3.1 光棘球海膽boule基因序列全長(zhǎng)及RRM結(jié)構(gòu)域分析

本研究中克隆了光棘球海膽boulecDNA全長(zhǎng)序列，預(yù)測(cè)出Boule蛋白存在一個(gè)結(jié)構(gòu)與功能十分保守的RRM結(jié)構(gòu)域，RRM結(jié)構(gòu)域隸屬于RRM superfamily，包含兩段保守的序列，即RNP1和RNP2 (RNP: Ribonucleoprotein，核糖核蛋白)。RRM結(jié)構(gòu)域是由DAZ基因家族編碼的RNA結(jié)合蛋白，在調(diào)控動(dòng)物的生殖細(xì)胞分化與發(fā)育中發(fā)揮重要作用，為生殖細(xì)胞發(fā)育所必需。雖然不同物種間Boule氨基酸序列全長(zhǎng)一致性較低(20.62%～66.48%)，但Boule的RRM結(jié)構(gòu)域氨基酸序列比對(duì)一致性較高，尤其與紫海膽的一致性高達(dá)99.15%，boule基因的進(jìn)化趨勢(shì)與光棘球海膽物種基本一致。

3.2 光棘球海膽boule基因在性腺中的表達(dá)情況

本研究中發(fā)現(xiàn)，不同于哺乳動(dòng)物、果蠅等多種生物的boule僅在精巢或卵巢中特異表達(dá)，光棘球海膽中的boule在雌、雄性腺中均有表達(dá)，尤其是精巢中的表達(dá)量較高，這與櫛孔扇貝中boule的表達(dá)情況類似。此外，boule在腸、管足、體腔液中也有少量的表達(dá)，意味著boule不僅在生殖細(xì)胞發(fā)育過程中發(fā)揮作用，還可能有未知的生物學(xué)功能。

本研究中，通過追蹤boule在不同發(fā)育時(shí)期性腺中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)boule在精巢中的表達(dá)量高于卵巢，在生長(zhǎng)期(stage Ⅱ)約為卵巢表達(dá)量的25倍，且在精巢生長(zhǎng)期(stageⅡ)及成熟前期(stage Ⅲ)中的表達(dá)量最高。這種表達(dá)模式與紫海膽中的表達(dá)情況類似。在其他物種中，boule主要在精巢中表達(dá)，如boule基因特異地表達(dá)于果蠅的精巢，并參與調(diào)控果蠅的精子發(fā)生[7]。由此可以預(yù)測(cè)，boule可能參與調(diào)控光棘球海膽的精子發(fā)生過程。此外，本研究中還發(fā)現(xiàn)，boule基因的表達(dá)量隨著雌性光棘球海膽卵母細(xì)胞的發(fā)育成熟而逐漸升高，由此推測(cè)，boule基因可能與光棘球海膽卵母細(xì)胞的成熟有關(guān)。

3.3 光棘球海膽boule基因在早期胚胎發(fā)育過程中的表達(dá)情況

在脊椎動(dòng)物中，作為蠑螈母源因子的dazl基因在早期胚胎發(fā)育過程中持續(xù)表達(dá)[19]，在硬骨魚中，牙鲆dazl基因在起始階段的表達(dá)量高于其他階段[20]；在無脊椎動(dòng)物中，櫛孔扇貝合子基因開始表達(dá)前，boule的表達(dá)量變化不大，但當(dāng)胚胎發(fā)育至原腸胚期時(shí)其表達(dá)量明顯增加[13]。這些均與本研究結(jié)果相似，因此，無論是無脊椎動(dòng)物還是脊椎動(dòng)物，boule在胚胎發(fā)育時(shí)期的表達(dá)模式均較相近，這表明boule在生殖細(xì)胞特化及形成中可能比較保守。

綜上所述，本研究中既完善了無脊椎動(dòng)物中棘皮動(dòng)物門動(dòng)物生殖腺的生長(zhǎng)發(fā)育，又開拓了生殖細(xì)胞的分化在非模式生物中的研究空間。以上結(jié)果也預(yù)示光棘球海膽boule基因可作為生殖細(xì)胞標(biāo)記基因，可為生殖細(xì)胞相關(guān)的研究提供參考。

4 結(jié)論

1)boule基因包含一個(gè)進(jìn)化上高度保守的RRM結(jié)構(gòu)域，其可能在調(diào)控動(dòng)物生殖細(xì)胞發(fā)育分化過程中發(fā)揮重要作用。

2)boule基因只在光棘球海膽的生殖細(xì)胞中高表達(dá)，且在雄性生殖細(xì)胞中特異表達(dá)，是雄性生殖細(xì)胞的標(biāo)記基因，這為研究其精巢形成和分化、精子發(fā)生等過程提供了數(shù)據(jù)資料。

3) 整個(gè)胚胎發(fā)育時(shí)期均檢測(cè)到boule基因的持續(xù)表達(dá)，boule為母源因子，這為研究光棘球海膽生殖細(xì)胞特化及形成提供了數(shù)據(jù)支撐。