靶向VEGFA調(diào)控MAPK/ERK和PI3K/Akt信號通路在結(jié)直腸癌血管生成中的作用及機制

徐潤強　劉海盛

【摘要】 目的：探究靶向血管內(nèi)皮生長因子A（vascularendothelial growth factor A， VEGFA）調(diào)控促分裂原活化的蛋白激酶/細胞外調(diào)解蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase/extracellular regulated protein kinase， MAPK/ERK）和磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（phosphatidylinositol 3- kinase/protein kinase B， PI3K/Akt）信號通路在結(jié)直腸癌血管生成中的作用及機制。方法：收集本院2015年1月-2019年12月82例結(jié)直腸癌患者癌組織及癌旁正常組織，使用qRT-PCR檢測患者癌組織、癌旁正常組織中VEGFA水平，分析VEGFA水平與患者臨床病理特征的關(guān)系。將SW480細胞分為五組，分別為對照組（正常人結(jié)腸細胞），空白組（無轉(zhuǎn)染質(zhì)粒），pMIR-miR-29b組（轉(zhuǎn)染miR-29b），MAPK/ERK組（轉(zhuǎn)染miR-29b后添加MAPK/ERK信號通路抑制劑PD98059），PI3K/Akt組（轉(zhuǎn)染miR-29b后添加PI3K/Akt信號通路抑制劑wortmanin）。檢測各組細胞中VEGFA、MAPK/ERK及PI3K/Akt信號通路靶蛋白ERK、Akt、mTOR、Bcl-2的表達水平。將各組細胞移植至裸鼠，建立結(jié)直腸癌裸鼠轉(zhuǎn)移瘤模型，觀察各組裸鼠移植瘤生長情況，檢測各組裸鼠腫瘤微血管密度變化情況。結(jié)果：癌組織VEGFA表達水平高于癌旁正常組織（P<0.05）;癌組織內(nèi)Ⅲ、Ⅳ期患者VEGFA mRNA水平高于Ⅰ、Ⅱ期患者（P<0.05），淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者VEGFA表達水平高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者（P<0.05）。與對照組相比，空白組、pMIR-miR-29b組、MAPK/ERK組、PI3K/Akt組VEGFA、ERK、Akt、mTOR、Bcl-2 mRNA及蛋白表達水平均上升（P<0.05）。MAPK/ERK組與PI3K/Akt組腫瘤重量、微血管密度均低于空白組（P<0.05），pMIR-miR-29b組裸鼠微血管密度、腫瘤重量均明顯低于MAPK/ERK組與PI3K/Akt組（P<0.05）。結(jié)論：VEGFA可有效下調(diào)MAPK/ERK及PI3K/Akt信號通路，從而抑制結(jié)腸癌血管新生，為臨床治療結(jié)直腸癌提供了新的臨床依據(jù)。

【關(guān)鍵詞】 VEGFA MAPK/ERK PI3K/Akt 結(jié)直腸癌 血管生成

[Abstract] Objective： To investigate the effect of vascular endothelial growth factor A （VEGFA） on mitogen activated protein kinase/extracellular regulated protein kinase （MAPK/ERK） and the role and mechanism of phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B （PI3K/Akt） signaling pathways in colorectal cancer angiogenesis. Method： A total of 82 patients with colorectal cancer from January of 2015 to December of 2019 in our hospital were collected. The levels of VEGFA in cancer tissue and normal tissue were detected by qRT PCR， and the relationship between VEGFA level and clinicopathological characteristics was analyzed. SW480 cells were divided into five groups： control group （normal colon cells）， blank group （without transfection plasmid）， pMIR-miR-29b group （transfected with miR-29b）， MAPK/ERK group （adding MAPK/ERK signal pathway inhibitor PD98059） and?PI3K/Akt group （adding PI3K/Akt signal pathway inhibitor wortmanin after miR-29b transfection）. The expression levels of VEGFA， MAPK/ERK， ERK， Akt， mTOR and Bcl-2 were detected. The cells were transplanted into nude mice to establish colorectal cancer metastasis model in nude mice. The growth of transplanted tumor and the change of tumor microvessel density were observed. Result： The expression level of VEGFA in cancer tissue was higher than that in the normal tissues （P<0.05）， the level of VEGFA mRNA in stage Ⅲ and Ⅳ patients was higher than that in stage Ⅰ and Ⅱ patients （P<0.05）， and that of patients with lymph node metastasis was higher than that in patients without lymph node metastasis （P<0.05）. Compared with the control group， the expression levels of VEGFA， ERK， Akt， mTOR，?Bcl-2 mRNA and protein in blank group， pMIR-miR-29b group， MAPK/ERK group， PI3K/Akt group were all increased （P<0.05）. The tumor weight and microvessel density of MAPK/ERK group and PI3K/Akt group were lower than that in blank group （P<0.05）， and that of pMIR-miR-29b group was significantly lower than those of

MAPK/ERK group and PI3K/Akt group （P<0.05）. Conclusion： VEGFA can effectively down regulate MAPK/ERK and PI3K/Akt signaling pathways， thus inhibiting angiogenesis of colon cancer， which provides a new clinical basis for clinical treatment of colorectal cancer.

[Key words] VEGFA MAPK/ERK PI3K/Akt Colorectal cancer Angiogenesis

First-authors address： Zengcheng District Peoples Hospital， Guangzhou 511300， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2021.09.008

在腫瘤進展過程中，病理性血管生長處于激活狀態(tài)，從而促進腫瘤組織發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移。腫瘤在生長及轉(zhuǎn)移過程中，血管內(nèi)皮生長因子A（vascularendothelial growth factor A， VEGFA）可有效促進細胞分裂增殖。有臨床研究顯示，結(jié)直腸癌患者血清中VEGFA表達水平與其血管新生狀態(tài)密切相關(guān)，是患者預后的獨立預測因子[1]。促分裂原活化的蛋白激酶/細胞外調(diào)解蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase/extracellular regulated protein kinase，MAPK/ERK）和磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（phosphatidylinositol 3- kinase/protein kinase B，PI3K/Akt）信號通路與腫瘤細胞血管內(nèi)皮細胞生長及血管新生有重要作用[2-3]。有研究表明，VEGFA下降可導致MAPK/ERK、PI3K/Akt信號通路活化抑制，從而發(fā)揮抗血管生成作用[4]。但結(jié)直腸癌腫瘤發(fā)生發(fā)展的過程中血管生成的機制尚不清楚，本研究解釋了VEGFA在結(jié)直腸癌發(fā)生、血管生成中的作用，為直腸癌靶向治療提供依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 收集本院2015年1月-2019年12月

82例結(jié)直腸癌患者癌組織及癌旁2 cm以上正常組織，收集患者臨床病例資料，本研究經(jīng)醫(yī)學倫理會批準，患者均自愿參加。納入病例資料均完整，患者術(shù)前均未經(jīng)放化療或激素治療。結(jié)腸SW480細胞系購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司。BALB/C裸鼠100只，均為雄性，平均鼠齡（2.31±0.14）個月，平均體重（240±50）g。本研究進行的動物實驗均符合當?shù)貙嶒瀯游锸褂弥改稀?/p>

1.2 主要試劑 胎牛血清、質(zhì)粒、氯仿、Trizol、DEPC、PCR引物、Ex Taq DNA聚合酶、PCR試劑盒、RNA提取試劑盒、VEGFA、ERK、Akt、mTOR、Bcl-2引物、GAPDH、山羊血清、miR-29b慢病毒[賽默飛世爾科技（中國）有限公司]。

1.3 主要儀器 SH-523凝膠成像系統(tǒng)（杭州申花科技有限公司）、Microfuge臺式離心機、MR-96A酶聯(lián)免疫檢測儀（美國貝克曼庫爾特有限公司）、HH-US電熱恒溫水浴箱（上海赫田科學儀器有限公司）、PCR儀器、SDS-PAGE蛋白電泳儀、PCS-150型CO2細胞培養(yǎng)箱[賽默飛世爾科技（中國）有限公司]、DM2500熒光顯微鏡（德國徠卡顯微系統(tǒng)）。

1.4 方法

1.4.1 細胞實驗分組 取生長期的結(jié)腸SW480細胞，隨機分為五組，分別為對照組（正常人結(jié)腸細胞），空白組（無轉(zhuǎn)染質(zhì)粒），pMIR-miR-29b組（轉(zhuǎn)染miR-29b），MAPK/ERK組（轉(zhuǎn)染miR-29b后添加MAPK/ERK信號通路抑制劑PD98059），PI3K/Akt組（轉(zhuǎn)染miR-29b后添加PI3K/Akt信號通路抑制劑wortmanin）。

1.4.2 組織及細胞RNA提取 使用Trizol試劑使細胞充分裂解，室溫放置10 min后提取總RNA備用。

1.4.3 qRT-PCR擴增 在實時熒光定量PCR上按照標準操作步驟進行反應(yīng)，循環(huán)條件：95 ℃下4 min;59 ℃，30 s;72 ℃，30 s，共循環(huán)32個周期;72 ℃下退火10 min，4 ℃保存。PCR擴增序列見表1。

1.4.3 Western blot蛋白表達 培養(yǎng)細胞48 h后，棄去上清液，使用PBS清洗2次，加入細胞裂解液，離心后收集上清液。按照標準程序操作SDS-PAGE蛋白電泳儀，停止電泳后取下凝膠，轉(zhuǎn)印后使用含5%脫脂奶粉封閉。按照試劑盒程序進行一抗孵育、二抗孵育，使用電化學發(fā)光法檢測蛋白表達[5]。

1.4.4 裸鼠成瘤實驗、分組、生長狀況 將結(jié)腸SW480細胞接種至BALBC裸鼠右側(cè)腹部皮下，1 mL/只，共分為五組，20只/組，對照組裸鼠不進行任何處理，空白組接種無轉(zhuǎn)染物的SW480細胞，pMIR-miR-29b組接種miR-29b質(zhì)粒的SW480細胞，MAPK/ERK組接種轉(zhuǎn)染miR-29b后添加MAPK/ERK信號通路抑制劑PD98059的細胞，PI3K/Akt組接種轉(zhuǎn)染miR-29b后添加PI3K/Akt信號通路抑制劑wortmanin的細胞。接種6周后，處死裸鼠。處死裸鼠后進行腫瘤稱重，觀察腫瘤轉(zhuǎn)移情況。

1.4.5 免疫組化 將標本進行免疫組化染色[6]，脫蠟切片后使用枸櫞酸鈉緩沖液進行抗原修復。使用兔血清進行封閉，清除血清后加入一抗;使用PBS清洗后加入二抗，按照標準程序進行DAB染色，用自來水沖洗終止。使用高倍鏡（×400）計算染色血管數(shù)，取2個視野微血管數(shù)平均數(shù)進行統(tǒng)計。

1.5 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 22.0統(tǒng)計學軟件進行分析，計量資料使用（x±s）表示，比較采用t檢驗;計數(shù)資料使用率（%）表示，比較采用字2檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 VEGFA表達及其與臨床病理特征的關(guān)系 癌組織VEGFA表達水平高于癌旁正常組織（P<0.05）;癌組織內(nèi)Ⅲ、Ⅳ期患者VEGFA mRNA水平高于Ⅰ、Ⅱ期患者（P<0.05），淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者VEGFA表達水平高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者（P<0.05）。見表2。

2.2 各組細胞VEGFA與ERK、Akt、mTOR、Bcl-2的mRNA及蛋白水平比較 與對照組相比，其余四組VEGFA、ERK、Akt、mTOR、Bcl-2的mRNA及蛋白表達水平均上升（P<0.05），MAPK/ERK組、PI3K/Akt組可在一定程度上緩解上升趨勢。見表3、4和圖1。

2.3 各組裸鼠腫瘤重量、微血管密度比較 MAPK/ERK組與PI3K/Akt組腫瘤重量、微血管密度均低于空白組（P<0.05），pMIR-miR-29b組裸鼠微血管密度、腫瘤重量均明顯低于MAPK/ERK組與PI3K/Akt組（P<0.05）。見表5。

3 討論

血管生成對于腫瘤生長及轉(zhuǎn)移十分重要。有研究指出，VEGF在癌癥患者組織中表達水平明顯高于正常組織[7]。VEGF通過激活Akt/PI3k/MAPK等血管內(nèi)皮細胞增殖及侵襲，從而促進血管生成[8-9]。因此，本研究選取靶向VEGFA基因調(diào)控作用進行探究。

有研究顯示，VEGFA是miR-29b是直接靶基因[10-11]。為進一步研究靶向VEGFA對血管新生的作用機制，本研究結(jié)果顯示癌組織VEGFA表達水平高于癌旁正常組織（P<0.05），癌組織內(nèi)Ⅲ及Ⅳ期患者VEGFA mRNA水平高于Ⅰ、Ⅱ期患者（P<0.05），淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者VEGFA表達水平高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者（P<0.05）。提示在結(jié)直腸癌發(fā)展過程中伴有VEGFA的過表達，從而作用于腫瘤生長及轉(zhuǎn)移[12]。根據(jù)臨床研究，VEGFA是一種二聚糖蛋白，可有效促進血管內(nèi)皮細胞增生和凋亡，進而增加腫瘤血管通透性[13-14]。朱凱旋等[15]研究發(fā)現(xiàn)，VEGFA水平與結(jié)直腸癌患者不良結(jié)果呈正相關(guān)。

本研究通過設(shè)置五組細胞實驗進行探究，結(jié)果顯示過表達miR-29b可抑制VEGFA基因，從而下調(diào)ERK、Akt、mTOR、Bcl-2的表達，從而抑制癌組織血管新生。胡建新等[16]研究顯示，VEGFA可通過MAPK/ERK，PI3K/Akt調(diào)控腫瘤血管新生，與本研究結(jié)果一致。李力等[17]研究指出，VEGFA信號傳導被VEG中和抗體阻斷會導致腫瘤血管生成受損。本研究中與正常裸鼠相比，MAPK/ERK組與PI3K/Akt組腫瘤重量低于空白組（P<0.05），pMIR-miR-29b組裸鼠微血管密度、腫瘤重量明顯減少，MAPK/ERK組與PI3K/Akt組微血管密度均低于空白組（P<0.05）。提示miR-29b可抑制血管生成，VEGFA可有效通過調(diào)節(jié)MAPK/ERK與PI3K/Akt信號通路促進血管生成[18-19]。另閆陶然等[20]發(fā)現(xiàn)，mTOR可刺激血管內(nèi)皮細胞中PI3K并促進細胞遷移。此外，朱曉志等[21]發(fā)現(xiàn)MAPK與PI3K參與到VEGF介導的血管生成中，從而調(diào)控血管新生過程。

綜上所述，靶向VEGFA通過負調(diào)節(jié)MAPK/ERK與PI3K/Akt信號通路抑制結(jié)直腸癌中的血管生成，同時為臨床進一步了解VEGFA低表達治療效果提供依據(jù)。但本研究只檢測了微血管密度這一指標，后期試驗將添加小管生成試驗等體外實驗等證實本研究觀點，進而豐富結(jié)直腸癌腫瘤發(fā)生發(fā)展機制。

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（收稿日期：2020-12-31） （本文編輯：周亞杰）