右美托咪定抑制HMGB1/TLR4/NF-κB信號通路減輕大鼠心肌缺血再灌注損傷研究

金蓮錦　胡春陽　李罡　劉巖　李琳　溫立勇

【摘要】 目的：觀察右美托咪定（Dex）對心肌缺血再灌注損傷大鼠心肌功能、炎癥反應及HMGB1/TLR4/NF-κB信號通路的影響。方法：取75只成年SPF級10周齡雄性SD大鼠。運用可復性結扎LAD法建立心肌缺血再灌注損傷（MIRI）模型。隨機均分為假手術組（Sham組）、Dex預處理+MIRI組（Dex組）、Dex+育亨賓+MIRI組（Dex/Yoh組）、育亨賓預處理+MIRI組（Yoh組）與MIRI組（I/R組），每組15只。比較各組心肌梗死面積（IS/AAR）。運用ELISA檢測并比較各組心肌組織與血清TNF-α、IL-6水平。采用 Western blot檢測并比較心肌組織HMGB1、TLR-4、MyD88、NF-κB蛋白表達情況。結果：Dex組、Dex/Yoh組、Yoh組及I/R組心肌組織與血清TNF-α、IL-6水平均高于Sham組，其中Dex組

【關鍵詞】 右美托咪定 HMGB1/TLR4/NF-κB信號通路 心肌缺血再灌注損傷

[Abstract] Objective： To observe the effects of Dexmedetomidine （Dex） on myocardial function， inflammatory response and HMGB1/TLR4/NF-κB signaling pathway in rats with myocardial ischemia-reperfusion injury. Method： A total of 75 adult SPF 10-week-old male SD rats were selected. The model of myocardial ischemia reperfusion injury （MIRI） was established by using the repeatable ligation LAD method. They were randomly divided into Sham operation group （Sham group）， Dex pretreatment+MIRI group （Dex group）， Dex+Yohimbine+MIRI group （Dex/Yoh group）， Yohimbine pretreatment+MIRI group （Yoh group） and MIRI group （I/R group）， 15 rats in each group. The myocardial infarction area （IS/AAR） was compared in each group. The levels of TNF-α and IL-6 in myocardial tissue and serum were detected and compared by ELISA. The protein expressions of HMGB1， TLR-4，

MyD88 and NF-κB in myocardial tissues were detected and compared by Western blot. Result： The levels of TNF-α and IL-6 in myocardial tissue and serum of the Dex group， Dex/Yoh group， Yoh group and I/R group were higher than those in the Sham group， and Dex group

group

NF-κB in myocardial tissues of Dex group， Dex/Yoh group， Yoh group and I/R group were higher than those in Sham group， and Dex group

[Key words] Dexmedetomidine HMGB1/TLR4/NF-κB signaling pathway Myocardial ischemia-reperfusion injury

First-authors address： Hongqi Hospital Affiliated to Mudanjiang Medical College， Mudanjiang 157011， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2021.09.007

缺血性心肌病（ICM）屬于一類心血管疾病，對人類健康造成了嚴重危害，死亡人數(shù)達到了每年700萬以上，在全球范圍內(nèi)導致患者死亡的疾病中，ICM占有重要地位[1]。缺血心肌在恢復血液再灌注后，可導致心肌細胞出現(xiàn)不可逆損傷加重，即為心肌缺血再灌注損傷（MIRI）。相關研究指出，右美托咪定（Dex）可通過抑制心肌炎癥反應來減輕再灌注損傷[2]。因此，本文研究了MIRI大鼠中Dex對心肌的保護作用及其機制，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 （1）實驗動物：購買蘇州西諾塞生物科技有限公司提供的成年SPF級10周齡雄性SD大鼠75只[使用許可證號：SCXK（蘇）2013-0003]，在恒溫（22.0±2.0）℃的單籠中飼養(yǎng)，所有操作均在光照時間內(nèi)進行，周期光照9：00～21：00，在籠上放置飼料、純凈水，讓大鼠自由食用。（2）造模材料：購買江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司生產(chǎn)的右美托咪定，美國Selleck公司生產(chǎn)的育亨賓，國藥集團化學試劑有限公司生產(chǎn)的水合氯醛，上海奧爾科特生物科技有限公司生產(chǎn)的小動物呼吸機（型號：ALC-V8型），浙江史密斯醫(yī)學儀器有限公司生產(chǎn)的雙通道微量注射泵（型號：WZS-50F6），蘇州碧迪醫(yī)療器械有限公司生產(chǎn)的靜脈留置針（型號：3REF83403直型），BD公司生產(chǎn)的2 mL與5 mL注射器。

1.2 方法

1.2.1 可復性結扎LAD法造模 術前12 h讓SD大鼠禁食，不禁水，給予大鼠腹腔注射0.8～1.0 mL/100 g 4%水合氯醛進行麻醉，然后大鼠取仰臥位，在手術臺上固定，將電極針插入大鼠四肢，對其術中心電圖變化進行持續(xù)監(jiān)測。氣管插管后連接呼吸機，將潮氣量、呼吸頻率分別調(diào)節(jié)為2.0～2.5 mL/100 g、75 次/min。分離大鼠右側頸總動脈后插管，連接實驗動物監(jiān)測系統(tǒng)，記錄平均動脈壓（MAP）、心率（HR）數(shù)值。將胸腔打開，位置為胸骨旁0.5 cm，方向為沿著胸骨左緣3～4肋間，分離心包膜，尋找左冠狀動脈前降支（LAD），用4-0慕絲線結扎LAD中上1/3，缺血成功的標準為心電圖檢查ST段弓背向上抬高，維持30 min后將結扎絲線解開，再持續(xù)灌注2 h。最后可見抬高的ST段回落。提示MIRI模型建立成功。

1.2.2 分組方法及處理 75只大鼠隨機平均分為假手術組（Sham組）、右美托咪定預處理+缺血再灌注組（Dex組）、右美托咪定+育亨賓+缺血再灌注組（Dex/Yoh組）、育亨賓預處理+缺血再灌注組（Yoh組）與心肌缺血再灌注組（I/R組），每組15只。Sham組只穿線不結扎。Dex組右頸靜脈持續(xù)泵注Dex 1μg/kg，10 min+0.7μg/（kg·h），15 min后制備模型。Dex/Yoh組經(jīng)右頸靜脈持續(xù)泵注育亨賓1 mg/kg（kg·h） 15 min+0.5 mg/kg（kg·h）20 min。完成5 min 后給予Dex 1 μg/kg 10 min+0.7 μg/（kg·h） 15 min后制備模型。Yoh組經(jīng)頸靜脈持續(xù)泵注育亨賓1 mg/kg 5 min+0.5 mg/（kg·h）20 min后制備模型。I/R組直接制備MIRI模型。

1.2.3 心肌梗死面積檢測 （1）于再灌注結束時，將左冠狀動脈前降支的結扎線重新結扎，待確定結扎確切后，經(jīng)右頸靜脈快速注射2 mL 2%伊文氏藍，使正常心肌組織（藍色）和缺血危險區(qū)心肌組織（未著色）顯色充分。（2）肉眼觀察缺血危險區(qū)顯示清楚后迅速摘取心臟，用冰凍0.9%氯化鈉溶液在冰上沖洗后剪除心房及多余的結締組織，在-80 ℃冰箱中冰凍15 min，沿左室長軸切成5 片約2 mm厚的薄片。（3）將切好的心肌組織薄片置于裝滿1%氯化三苯基四氮唑（TTC）溶液的6孔板中，使心肌組織充分浸于溶液中。于37 ℃溫箱中孵育15～30 min取出，用4%多聚甲醛溶液固定。（4）用照相機拍照，在圖片中正常的心肌組織為藍色，缺血危險區(qū)的心肌組織呈紅色，梗死的心肌組織呈蒼白色。通過相應軟件計算心肌梗死面積，心肌梗死面積=缺血梗死區(qū)域蒼白色的心肌組織/缺血危險區(qū)紅色的心肌組織（IS/AAR）。

1.2.4 ELISA檢測大鼠心肌組織、血清TNF-α、IL-6濃度 （1）將5 μL 240、120、60、30、15、7.5 ng/mL的標準品依次加入標準品孔中，將50 μL待檢測大鼠心肌組織和血清樣本提取液加入樣品孔中，空白孔加雙蒸水;（2）將50 μL HRP試劑分別加入標準品孔、樣品孔中;（3）以輕柔的動作搖晃，將封板膜蓋上，在37 ℃恒溫箱中進行1 h孵育;（4）將封板膜小心揭掉，將孔內(nèi)液體棄去。甩干后將300 μL洗滌液加入每孔中，30 s靜置后棄去，重復5次后將孔內(nèi)液體拍干;

（5）將50 μL顯色劑A、B加入每孔中，振蕩混勻，在37 ℃恒溫箱中10 min避光孵育;（6）將50 μL終止液加入每孔中;（7）空白孔凋零，在450 nm波長處對各孔OD值進行測量;（8）依據(jù)標準品OD值、濃度將標準曲線繪制出來，進而將樣品濃度計算出來。

1.2.5 Western blot檢測HMGB1、TLR-4、MyD88、NF-κB蛋白表達 組織塊稱重;利用液氮、研缽粉碎組織塊;加入RIPA緩沖液（每克組織3 mL?RIPA），PMSF（每克組織30 μL，10 mg/mL PMSF），利用Polytron進一步勻漿（15 000 r/min，1 min）維持4 ℃;加入PMSF（每克組織30 μL 10 mg/mL PMSF），冰上孵育30 min;移入離心管，4 ℃，

15 000 r/min，15 min離心;上清液為細胞裂解液，分裝-20 ℃保存;取相同質(zhì)量的細胞裂解液（體積×蛋白質(zhì)濃度），并加等體積的2×電泳加樣緩沖液;沸水浴3 min。把聚丙烯酰胺凝膠中的蛋白質(zhì)電泳轉移到硝酸纖維膜上。轉移緩沖液洗滌凝膠和硝酸纖維素膜，將硝酸纖維素膜鋪在凝膠上，用5 mL移液管在凝膠上來回滾動去除所有的氣泡。在凝膠和濾膜外再包一張3 mm濾紙（預先用轉移緩沖液浸濕），將凝膠夾在中間，保持濕潤和沒有氣泡。將濾紙、凝膠、薄膜、濾紙按照廠家建議方法放入電泳裝置中，凝膠面向陰極。將上述裝置放入緩沖液槽中，并灌滿轉移緩沖液以淹沒凝膠。按照廠家所示接通電源開始電泳轉移。轉移結束后，取出薄膜和凝膠，棄去凝膠。將薄膜漂在氨基黑中快速染色，直至分子量標準顯現(xiàn)時取出，記錄下標準位置。用100 mL水洗滌纖維素膜，必要時可用脫色緩沖液。膜置印跡緩沖液中于37 ℃保溫1 h。室溫下，用PBS-Tween緩沖液洗滌薄膜。用封口機將薄膜封入塑料袋中，盡可能不留空氣。5%脫脂奶加在裝薄膜的袋中，于室溫封閉1h。用總體積300 mL PBS-Tween緩沖液，分4次在一淺盤中洗滌薄膜，每次75 mL。將稀釋好的一抗加在袋內(nèi)，于4 ℃孵育過夜。洗滌后加入HRP標記的二抗，于室溫下?lián)u動2 h。洗滌后將等體積A液和B液加在膜蛋白面上并搖晃使其混合，1 min后去盡殘液，將膜蛋白面朝上放入熒光化學發(fā)光成像系統(tǒng)中進行顯影和拍照，用凝膠成像處理系統(tǒng)進行分析。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 21.0軟件對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料用（x±s）表示，比較采用t檢驗;計數(shù)資料以率（%）表示，比較采用字2檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組心肌組織與血清炎性指標比較 Dex組、Dex/Yoh組、Yoh組及I/R組心肌組織與血清TNF-α、IL-6水平均高于Sham組，其中Dex組

2.2 各組心肌梗死面積比較 Dex組（27.2±1.0）%、Dex/Yoh組（43.2±3.3）%、Yoh組（50.5±5.4）%及I/R組（55.3±6.6）%的IS/ARR均高于Sham組（0），其中Dex組

2.3 各組心肌組織HMGB1、TLR-4、MyD88、NF-κB蛋白表達量比較 Dex組、Dex/Yoh組、Yoh組及I/R組心肌組織HMGB1、TLR-4、MyD88、NF-κB蛋白表達量均高于Sham組，其中Dex組

3 討論

Dex為高效、高選擇性的α2腎上腺素能受體激動劑，一方面不會對呼吸造成抑制，另一方面還能夠?qū)⒖菇箲]、鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜作用發(fā)揮出來[3-6]。Dex在重癥監(jiān)護病房圍術期得到了廣泛應用，它能夠?qū)し磻M行有效抑制，促進心率、血壓的降低，對氧供需平衡進行改善，用于冠心病患者圍術期心肌保護[7-12]。通過缺血預處理和缺血后處理可減輕小鼠心肌缺陷再灌注損傷，在MIRI前應用Dex保護心肌的具體機制尚未闡明，有研究指出，可能經(jīng)過預處理將相關促存活信息傳導激活，比如

Ras-MEK1/2、PI3K/Akt等信號通路，促進下游信號蛋白級聯(lián)反應的發(fā)生，發(fā)揮心臟保護作用[13-20]。本研究結果顯示，Dex組、Dex/Yoh組、Yoh組及I/R組心肌組織與血清TNF-α、IL-6水平均高于Sham組，其中Dex組

綜上所述，右美托咪定能夠減輕心肌缺血再灌注損傷大鼠炎癥反應，減少心肌梗死面積，途徑可能為抑制HMGB1/TLR4/NF-κB信號通路。

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（收稿日期：2020-06-22） （本文編輯：田婧）