GC-MS法檢測左卡尼汀中遺傳毒性物質(zhì)S-環(huán)氧氯丙烷

王淋，李雪*，樸惠順，李敏，段成軍（.延邊大學藥學院，吉林 延吉 33000；.吉林省博大偉業(yè)藥物研究有限公司，長春 30000）

左卡尼汀（levocarnitine）于1905年被俄國學者發(fā)現(xiàn)，別名左旋肉毒堿、L-肉堿，化學名為（R）-3-羧基-2-羥基-N，N，N-三甲基-1-丙胺氫氧化物，是人體細胞內(nèi)的一種有效成分。正常人體中左卡尼汀的含量為0.2 ～6 μmol·g－1，其中75%的左卡尼汀來源于食物，食物中羊肉和牛肉的左卡尼汀含量最高，剩下的25%由人體合成，主要合成部位在肝臟和腎臟[1]。大約98%的左卡尼汀分布在心肌細胞和骨骼肌，左卡尼汀在臨床上用于治療慢性腎衰竭、慢性心力衰竭、冠心病，不僅有良好的療效，而且不良反應較少，安全性較高[2-4]。國外多項研究顯示適當補充左卡尼汀可顯著降低冠心病的發(fā)病率、死亡率，并可能改善預后[5-6]。1993年美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）認為其是“安全無毒”的，目前，世界上已有22 個國家在嬰兒食品中加入L-肉堿，并均通過各國安全檢驗認證，可能出現(xiàn)的不良反應就是過量食用會出現(xiàn)暫時性腹瀉，減少劑量會得到緩解[7-8]。

左卡尼汀以S-環(huán)氧氯丙烷為起始原料，經(jīng)氨化、環(huán)氧化、氰基化水解制備，S-環(huán)氧氯丙烷為遺傳毒性物質(zhì)，需嚴格控制其含量。左卡尼汀每日最大日劑量為3 g，根據(jù)歐洲藥物管理局發(fā)布的《遺傳毒性雜質(zhì)限度指導原則》相關規(guī)定，以毒理學關注閾值（TTC）限度（1.5 μg·d－1）作為基因毒性雜質(zhì)的可接受限度[9]，按此計算，S-環(huán)氧氯丙烷的控制限度為0.5 μg·g－1。目前常用的S-環(huán)氧氯丙烷檢測方式有氣相色譜法（GC）[10]和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（GC-MS）[11-12]。左卡尼汀中S-環(huán)氧氯丙烷的控制限度為0.000 05%。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

8890-7010 B 氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國Agilent 公司），BT-125D 電子天平（德國賽多利斯公司，精度：十萬分之一）。

1.2 試藥

左卡尼汀原料藥（吉林省博大偉業(yè)藥物研究有限公司，批號：20200627，純度：98%）；S-環(huán)氧氯丙烷對照品（Toronto Research Chemicals，批號：5-CGS-95-1，供含量測定用）；二氯甲烷（國藥集團化學試劑有限公司，分析純）。

2 方法與結(jié)果

2.1 GC-MS 條件

色譜柱：Agilent HP-5ms 毛細管柱（30 m×0.25 mm×0.25 mm）；柱溫：程序升溫（起始溫度40℃，維持5 min；以45℃·min－1升至300℃，維持3 min）；進樣口溫度200℃；柱流量：1.0 mL·min－1；進樣模式：分流進樣，分流比為5∶1；載氣：高純氦氣；檢測器：質(zhì)譜檢測器；離子化方式：EI；離子化電壓：70 eV；離子源溫度：230℃；傳輸線溫度：260℃；四級桿溫度150℃；溶劑延遲：2.8 min；采集方式：選擇性離子檢測（SIM）；掃描范圍30 ～180 amu。待測成分S-環(huán)氧氯丙烷，相對分子質(zhì)量92，m/z特征離子為57和42，tR為3.744 min，質(zhì)譜圖見圖1。

圖1 S-環(huán)氧氯丙烷質(zhì)譜圖Fig 1 Mass spectrum of S-epichlorohydrin

2.2 溶液制備

2.2.1 空白溶劑 取二氯甲烷作為空白溶劑。

2.2.2 對照品溶液 精密稱取適量S-環(huán)氧氯丙烷對照品，加入二氯甲烷將其稀釋至每1 mL 中約含1 μg，作為對照品儲備液。精密量取對照品儲備液1 mL，置于10 mL 量瓶中，加二氯甲烷稀釋至刻度，搖勻，即得對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液 精密稱取左卡尼汀2 g，置于10 mL 量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取供試品溶液5 mL，加二氯甲烷5 mL，萃取，取下層萃取液為供試品溶液。

2.3 專屬性試驗

取“2.2”項下的空白溶劑、對照品溶液及供試品溶液各1 μL 注入GC-MS 測定，記錄圖譜。由圖2可知，空白溶劑不干擾S-環(huán)氧氯丙烷的檢測。

圖2 S-環(huán)氧氯丙烷測定TIC 圖Fig 2 TIC of S-epichlorohydrin

2.4 檢測限與定量限

取“2.2.2”項下對照品溶液適量，加二氯甲烷逐級稀釋，按“2.1”項下條件進樣，測定S-環(huán)氧氯丙烷的檢測限（信噪比為3∶1）和定量限（信噪比為10∶1）。結(jié)果，S-環(huán)氧氯丙烷的檢測限和定量限分別為0.003 μg·mL－1和0.010 μg·mL－1。

2.5 線性關系考察

精密量取“2.2.2”項下對照品儲備液0.5、0.8、1、1.2、1.4、2 mL，分別置于10 mL 量瓶中，加二氯甲烷稀釋至刻度，搖勻，作為線性系列溶液。精密量取上述溶液各1 μL，進樣測定，以質(zhì)量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標進行線性回歸。結(jié)果回歸方程為Y＝71.91X＋5.552×103（r＝0.996），表明S-環(huán)氧氯丙烷質(zhì)量濃度在55.11 ～220.44 ng·mL－1與峰面積呈良好線性關系。

2.6 精密度試驗

精密量取對照品溶液，按“2.1”項下條件測定，連續(xù)進樣6 次，計算S-環(huán)氧氯丙烷峰面積的RSD值，結(jié)果RSD為5.8%（n＝6），表明該方法儀器精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗

精密量取對照品溶液和供試品溶液，按“2.1”項下條件，分別于0、2、4、6、8、12 h 進樣，記錄峰面積，結(jié)果顯示12 h 內(nèi)S-環(huán)氧氯丙烷對照品峰面積的RSD為4.0%（n＝6），左卡尼汀原料中均未檢出S-環(huán)氧氯丙烷，溶液穩(wěn)定性良好。

2.8 重復性試驗

取左卡尼汀原料（批號：20200627），精密稱定，按“2.2.3”項下方法制備6 份供試品溶液，按“2.1”項下條件進樣分析，記錄色譜圖，結(jié)果顯示6 份供試品均未檢測出S-環(huán)氧氯丙烷。

2.9 回收試驗

精密稱取左卡尼汀原料（批號：20200627）適量，精密稱定9 份，置于10 mL 量瓶中，分別加入“2.2.1”項下對照品儲備液0.8、1、1.2 mL，按“2.2.2”項下方法制備低、中、高3 種濃度的供試品各3 份，按“2.1”項下條件進樣分析，并計算回收率，結(jié)果平均回收率均＞100.0%，RSD＜8.6%（n＝3）。

2.10 樣品中S-環(huán)氧氯丙烷的測定

取左卡尼汀原料藥（批號：20200627、20200628、20200629），精密稱定，按“2.2.2”項下方法制備3 份供試品溶液，按“2.1”項下條件進樣分析，結(jié)果均未檢出S-環(huán)氧氯丙烷。

3 討論

考察甲醇、N，N-二甲基甲酰胺、正己烷及二氯甲烷作為溶劑時S-環(huán)氧氯丙烷的出峰情況，結(jié)果甲醇與S-環(huán)氧氯丙烷在高溫時發(fā)生化學反應，無目標峰；N，N-二甲基甲酰胺溶劑峰出峰時間晚，極易造成管路及樣品污染；正己烷溶劑峰大，與S-環(huán)氧氯丙烷重疊，無法分離；S-環(huán)氧氯丙烷易溶于二氯甲烷，且分離度好，故選用二氯甲烷作為溶劑。

本方法通過各項試驗驗證，結(jié)果均符合要求，靈敏度高、專屬性強、分析時間短、準確度較好，適用于左卡尼汀中S-環(huán)氧氯丙烷的檢測。