基于高效液相色譜法結(jié)合層次分析和正交設(shè)計(jì)法優(yōu)選土茯苓醇提工藝

黃詩淇，武正華，繆文清，周利娟，石文清，范國榮*（.廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，南寧 53000；.上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院臨床藥學(xué)科，上海 00080）

土茯苓為百合科植物光葉菝葜（Smilax glabraRoxb）的干燥根莖。性平，味甘淡，歸肝胃脾經(jīng)，具有清熱除濕、解毒、通利關(guān)節(jié)等功效[1-3]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[4-5]，土茯苓不僅可以通過抑制肝臟中黃嘌呤氫化酶（XDH）mRNA 和黃嘌呤氧化酶（XOD）的活性來達(dá)到降尿酸的作用，還可以通過下調(diào)血清中尿酸和肌酐的水平，對(duì)高尿酸血癥小鼠起到治療作用。張白嘉等[6]發(fā)現(xiàn)土茯苓對(duì)二甲苯所致小鼠耳腫脹、蛋清及角叉菜膠所致小鼠足腫脹均有明顯抑制作用；落新婦苷對(duì)尿酸鈉所致大鼠痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎有治療作用，同時(shí)可明顯增加大鼠的尿量；對(duì)醋酸所致小鼠扭體反應(yīng)有明顯的抑制作用；以及對(duì)熱板法引起的小鼠足痛有對(duì)抗作用，證實(shí)了土茯苓及落新婦苷具有抗炎、鎮(zhèn)痛、利尿等作用。

土茯苓含多種化學(xué)成分，包括糖、有機(jī)酸、苯丙素、黃酮及黃酮苷、甾醇、皂苷和揮發(fā)油等[3]。目前對(duì)土茯苓化學(xué)成分的研究主要集中在黃酮類物質(zhì)。其中黃杞苷作為土茯苓中重要的活性成分；落新婦苷作為土茯苓的指標(biāo)性成分，具有熱不穩(wěn)定性，提取過程中不可避免地會(huì)分解生成新落新婦苷、異落新婦苷和新異落新婦苷3 種同分異構(gòu)體，上述5 種化學(xué)成分均屬于二氫黃酮醇類物質(zhì)。但是這5 種化學(xué)成分的含量在不同的提取工藝下又有顯著的差異，因此，優(yōu)化土茯苓中二氫黃酮醇類物質(zhì)的提取工藝是十分有必要的。通過查閱土茯苓提取工藝的相關(guān)文獻(xiàn)[7-14]，已報(bào)道的提取方法多是對(duì)土茯苓中單一的黃酮類物質(zhì)的含量或者土茯苓總黃酮的含量進(jìn)行評(píng)價(jià)來確定提取工藝，鮮有對(duì)土茯苓中二氫黃酮醇類化合物進(jìn)行多指標(biāo)的綜合評(píng)價(jià)。中藥提取工藝若僅以單一化學(xué)成分的含量高低或有效部位的含量高低來評(píng)價(jià)工藝的優(yōu)劣，則會(huì)忽略多組分之間的協(xié)同或相互作用，因此，以多種化學(xué)成分的含量作為評(píng)價(jià)指標(biāo)更有助于綜合評(píng)價(jià)土茯苓的提取工藝[15]。

本試驗(yàn)通過選取提取時(shí)間、固液比、乙醇濃度為考察因素，以落新婦苷、新落新婦苷、異落新婦苷、新異落新婦苷、黃杞苷5 種二氫黃酮醇類成分的含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)。采用HPLC 法測(cè)定5 種指標(biāo)成分的含量，通過正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)選出最佳的乙醇提取工藝，同時(shí)結(jié)合層次分析法（analytic hierarchy process，AHP）建立指標(biāo)回歸模型，確定各指標(biāo)權(quán)重系數(shù)，以多指標(biāo)綜合評(píng)分法對(duì)提取方法進(jìn)行綜合全面的評(píng)價(jià)。以期為土茯苓的資源開發(fā)、工業(yè)化生產(chǎn)以及新藥研發(fā)提供理論依據(jù)，為中藥材提取工藝的研究提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Thermo U-3000 超高效液相色譜儀、DAD 檢測(cè)器（美國 Thermo Fisher Scientific 公司）；超聲微波協(xié)同萃取/反應(yīng)儀（CW-2000 型；上海新拓微波溶樣測(cè)試技術(shù)有限公司）；SK7200H 超聲儀（上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司）；Sartorius CPA 225D 十萬分之一電子天平（賽多利斯公司，德國）；粉碎機(jī)（上海淀久中藥機(jī)械有限公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海信科科技有限公司）。

1.2 試藥

土茯苓（批號(hào)：191011-2，上海萬仕誠國藥制品有限公司）；落新婦苷對(duì)照品（批號(hào)：111798-201805，含量：93.6%）、黃杞苷對(duì)照品（批號(hào)：111906-201102，含量：93.7%）（中國食品藥品檢定研究院）；新落新婦苷對(duì)照品（批號(hào)：P08N9S74591）、新異落新婦苷對(duì)照品（批號(hào)：P30J11S117034）（含量≥ 98%，上海源葉生物科技有限公司）；異落新婦苷對(duì)照品（批號(hào)：190922-216，含量≥ 98%，江西江藍(lán)純生物試劑有限公司）；甲醇（色譜純，Merck），其他試劑均為分析純，超純化水（Milli-Q 系統(tǒng)）。

2 方法與結(jié)果

2.1 提取液的制備

土茯苓藥材，粉碎，過60 目篩，備用。精密稱取土茯苓粉末5 g，按以下3 種方法，分別進(jìn)行提取試驗(yàn)，每種方法平行3 組。

2.1.1 加熱回流提取法 參照《中國藥典》[1]土茯苓提取方法并作適當(dāng)修改：加60%乙醇100 mL 于樣品中，浸泡8 h，60 ℃回流提取2 次，每次2 h，合并濾液，過濾，放置備用。

2.1.2 超聲提取法 參照《中國藥典》[1]與文獻(xiàn)[12]的方法并改進(jìn)：加60%乙醇 100 mL 于樣品中，浸泡8 h，40℃超聲（53 kHz，350 W）提取2 次，每次1 h，合并濾液，過濾，放置備用。

2.1.3 微波提取法 參照文獻(xiàn)[10]的方法并改進(jìn)：加60%乙醇100 mL 于樣品中，浸泡8 h，80℃微波萃取，功率600 W，提取2 次，每次5 min，合并濾液，過濾，放置備用。

2.2 3 種提取方法的提取得率

按“2.1”項(xiàng)下不同提取方法制備土茯苓提取液，收集濾液，減壓回收溶劑，干燥至恒定質(zhì)量。計(jì)算不同提取方法所得提取物的得率，結(jié)果加熱回流提取法、超聲提取法、微波提取法的平均得率分別為24.51%、27.13%、15.19%，利用超聲提取法制備提取物，能夠更快更高效地將主要成分最大程度地提取出來。因此本試驗(yàn)選擇超聲提取法進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.3 HPLC 法同時(shí)測(cè)定5 種指標(biāo)成分

2.3.1 混合對(duì)照品溶液的制備 分別精密稱取落新婦苷、新落新婦苷、異落新婦苷、新異落新婦苷、黃杞苷對(duì)照品適量，加入甲醇溶解，搖勻，制成每1 mL 含落新婦苷1.0690 mg，新落新婦苷1.0470 mg，異落新婦苷0.8400 mg，新異落新婦苷1.0400 mg，黃杞苷0.8875 mg 的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液。

2.3.2 供試品溶液的制備 取“2.1.2”項(xiàng)下制得的提取液，0.45 μm 微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，放置冰箱4℃儲(chǔ)存，備用。

2.3.3 色譜條件 色譜柱：Ultimate C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相：甲醇（A）-0.1%乙酸水溶液（B），梯度洗脫（0 ～20 min，35%A；20 ～35 min，35% ～40%A；35 ～50 min，40%～45%A）；流速1.0 mL·min－1；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量10 μL；檢測(cè)波長291 nm。在此色譜條件下待測(cè)組分與其他組分分離效果良好，混合對(duì)照品溶液與3 種提取方法所得供試品溶液的HPLC 圖見圖1。

圖1 混合對(duì)照品（A）、加熱回流提取法樣品（B）、超聲提取法樣品（C）和微波提取法樣品（D）HPLC 色譜圖Fig 1 HPLC chromatogram of reference（A），heated reflux extraction（B），ultrasonic extraction（C），and microwave extraction（D）

2.3.4 線性關(guān)系 精密吸取“2.3.1”項(xiàng)下的混合對(duì)照品溶液0.25、0.5、1.0、2.0、2.5、4.0 mL，分別置于25 mL 量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，另取“2.3.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，分別精密吸取10 μL，按“2.3.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。以對(duì)照品質(zhì)量濃度X為橫坐標(biāo)，峰面積Y為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，結(jié)果見表1。5 種化合物在各自質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

表1 5 種指標(biāo)成分的線性關(guān)系Tab 1 Linearity of 5 index components

2.3.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取“2.3.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，加50%甲醇稀釋后，制得含落新婦苷85.56 μg·mL－1、新落新婦苷41.88 μg·mL－1、異落新婦苷33.60 μg·mL－1、新異落新婦苷41.60 μg·mL－1、黃杞苷35.50 μg·mL－1的混合對(duì)照品溶液。按“2.3.3”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6 次，記錄峰面積。結(jié)果落新婦苷、新落新婦苷、異落新婦苷、新異落新婦苷和黃杞苷峰面積的RSD值分別為0.17%、0.36%、1.5%、1.8%、0.58%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.3.6 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取同一批次土茯苓粉末，共6 份，每份5 g，按“2.3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.3.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。落新婦苷、新落新婦苷、異落新婦苷、新異落新婦苷和黃杞苷峰面積的RSD值分別為0.67%、1.4%、1.3%、2.2%、0.48%（n＝6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.3.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.3.2”項(xiàng)下供試品溶液適量，分別于室溫下放置0、2、4、8、12、24、36、48 h，按“2.3.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果表明落新婦苷、新落新婦苷、異落新婦苷、新異落新婦苷和黃杞苷峰面積的RSD值分別為0.31%、0.42%、0.51%、1.6%、0.53%（n＝6），表明供試品溶液于室溫下放置48 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.8 加樣回收試驗(yàn) 精密稱取同一批土茯苓樣品6 份，每份約2.5 g，加入一定量的對(duì)照品溶液，按“2.3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液并測(cè)定峰面積，計(jì)算平均回收率及RSD值。結(jié)果表明，土茯苓中落新婦苷、新落新婦苷、異落新婦苷、新異落新婦苷及黃杞苷的平均回收率分別為94.7%、95.4%、93.2%、102.5%及99.2%，RSD值分別為2.2%、2.2%、1.8%、2.1%及2.0%，表明方法的準(zhǔn)確度良好。

2.4 AHP 確定各指標(biāo)權(quán)重系數(shù)

AHP 是一種將復(fù)雜問題中的各個(gè)因素，劃分為相互聯(lián)系的有序?qū)哟?，再?duì)各項(xiàng)影響因素的重要程度進(jìn)行評(píng)分，確定其權(quán)重系數(shù)的分析方法。該方法將評(píng)價(jià)目標(biāo)分為多個(gè)層次和若干指標(biāo)，依照不同的權(quán)重進(jìn)行綜合的評(píng)價(jià)，利用權(quán)重求出各方案的優(yōu)劣次序[16-18]。本試驗(yàn)結(jié)合正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)將評(píng)價(jià)系統(tǒng)設(shè)計(jì)為三層，如圖2。根據(jù)土茯苓活性成分所占比例，確定各指標(biāo)的優(yōu)先順序?yàn)椋郝湫聥D苷＞異落新婦苷＞黃杞苷＞新落新婦苷＞新異落新婦苷，采用1 ～9 標(biāo)度法對(duì)5 項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行兩兩比較評(píng)判重要性，按照幾何平均法，計(jì)算各指標(biāo)的權(quán)重系數(shù)[19-21]。各指標(biāo)成分的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見表2。5 種評(píng)價(jià)指標(biāo)兩兩比較的判斷優(yōu)選矩陣見表3。

圖2 土茯苓活性成分提取工藝優(yōu)化層次結(jié)構(gòu)模型Fig 2 Hierarchical structure of extraction optimization of bioactive components in Smilacis Glabrae Rhizoma

表2 5 種評(píng)價(jià)指標(biāo)各層次評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Tab 2 Score standards for the 5 evaluation indexes

表3 指標(biāo)層比較判斷優(yōu)選矩陣Tab 3 Judgment matrix

使用AHP 分析軟件進(jìn)行具體計(jì)算，求得落新婦苷、新落新婦苷、異落新婦苷、新異落新婦苷和黃杞苷各指標(biāo)權(quán)重系數(shù)為0.6204、0.0776、0.1673、0.0379 和 0.0968。隨機(jī)一致性比率CR＝CI/RI，當(dāng)CR＜0.1 時(shí)，判斷矩陣具有滿意的一致性及權(quán)重計(jì)算正確性[21-24]。本次試驗(yàn)的一致性比率為CR＝0.0980 ＜0.1，表明權(quán)重計(jì)算正確、合理。

2.5 超聲提取方法的單因素試驗(yàn)

2.5.1 提取時(shí)間對(duì)5 種評(píng)價(jià)指標(biāo)總提取含量的影響 選取固液比為1∶20，乙醇濃度為60%，浸泡8 h，提取2 次，提取溫度40℃，控制提取時(shí)間分別為15、30、60、90、120 min，每組平行3組，得到提取時(shí)間對(duì)5 種評(píng)價(jià)指標(biāo)含量及總提取含量的影響，結(jié)果如圖3所示。

圖3 提取時(shí)間對(duì)5 種評(píng)價(jià)指標(biāo)含量及總提取含量的影響Fig 3 Effect of extraction time on the contents of 5 evaluation indexes and total extraction contents

當(dāng)提取時(shí)間在15 ～60 min 內(nèi)，隨著提取時(shí)間的增加，總提取含量不斷增多；15 ～30 min 內(nèi)，增加迅速；30 ～60 min 內(nèi)總提取含量增長變緩，說明土茯苓藥材內(nèi)外濃度差逐漸達(dá)到平衡。60～120 min 內(nèi)，隨著提取時(shí)間增加，總提取含量略有下降。原因可能是，土茯苓藥材粉末的內(nèi)外濃度差達(dá)到提取平衡，增長提取時(shí)間無法再增加目標(biāo)成分的總提取含量，長時(shí)間提取溫度升高，破壞了土茯苓藥材中一些活性成分，反而導(dǎo)致總提取含量減少。單因素結(jié)果表明，提取時(shí)間在30 ～60 min 內(nèi)，提取效率較好。

2.5.2 固液比對(duì)5 種評(píng)價(jià)指標(biāo)總提取含量的影響 選取提取時(shí)間為30 min，乙醇濃度為60%，浸泡8 h，提取2 次，提取溫度40℃，控制固液比分 別 為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50，每組平行3 組，得到固液比對(duì)5 種評(píng)價(jià)指標(biāo)含量及總提取含量的影響，結(jié)果如圖4所示。隨著固液比的增加，指標(biāo)成分的總提取含量呈下降趨勢(shì)?？梢酝茰y(cè)出，當(dāng)固液比為1∶10 時(shí)，所添加的液體體積與提取物之間的最佳比例達(dá)到峰值，后續(xù)增加液體體積無法再增加提取含量。因此本試驗(yàn)選擇固液比為1∶10 進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

圖4 固液比對(duì)5 種評(píng)價(jià)指標(biāo)含量及總提取含量的影響Fig 4 Effect of solid-liquid ratio on the contents of 5 evaluation indexes and total extraction contents

2.5.3 乙醇濃度對(duì)5 種評(píng)價(jià)指標(biāo)總提取含量的影響 選取提取時(shí)間為30 min，固液比為1∶10，浸泡8 h，提取2 次，提取溫度40℃，控制乙醇濃度分別為40%、50%、60%、70%、80%，每組平行3 組，得到乙醇濃度對(duì)5 種評(píng)價(jià)指標(biāo)含量及總提取含量的影響，結(jié)果如圖5所示。當(dāng)乙醇濃度在40%～60%，總提取物的含量隨乙醇濃度的升高而增加，但增加不顯著，說明乙醇濃度對(duì)土茯苓提取含量影響較小。乙醇濃度在60%～80%時(shí)，總提取含量呈下降趨勢(shì)。

圖5 乙醇濃度對(duì)5 種評(píng)價(jià)指標(biāo)含量及總提取含量的影響Fig 5 Effect of ethanol concentration on the contents of 5 evaluation indexes and total extraction contents

2.6 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

通過單因素試驗(yàn)結(jié)果，確定超聲提取法對(duì)土茯苓有效成分進(jìn)行提取，選擇提取時(shí)間（A）、固液比（B）、乙醇濃度（C）為考察因素，設(shè)計(jì)L9（34）正交試驗(yàn)，因素水平見表4。

表4 正交試驗(yàn)因素水平表Tab 4 Factor and level of the orthogonal test

2.7 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

按正交設(shè)計(jì)表進(jìn)行超聲提取，分別測(cè)定各樣品中落新婦苷、新落新婦苷、異落新婦苷、新異落新婦苷、黃杞苷的含量，結(jié)果見表5。

表5 超聲提取正交試驗(yàn)結(jié)果Tab 5 Orthogonal test for extraction

2.8 提取工藝的確定

利用AHP 得到的權(quán)重系數(shù)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行綜合評(píng)分。極差分析結(jié)果見表5，方差分析結(jié)果見表6。由表5可知，各因素對(duì)土茯苓提取工藝作用主次為B ＞A ＞C，方差分析表明，B 因素對(duì)綜合評(píng)分結(jié)果具有顯著性影響（P＜0.05），A因素對(duì)結(jié)果影響不顯著，從工業(yè)化生產(chǎn)的角度，考慮節(jié)約時(shí)間成本和經(jīng)濟(jì)成本、保護(hù)環(huán)境、生產(chǎn)安全等因素，故選擇最佳提取工藝為A1B1C3。即土茯苓藥材采用60%乙醇，浸泡8 h，固液比為1∶10，40 ℃超聲提取2 次，每次提取30 min 進(jìn)行提取。

表6 正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果Tab 6 Analysis of variance

2.9 提取工藝驗(yàn)證試驗(yàn)

精密稱取土茯苓藥材3 份，按優(yōu)選的最佳工藝A1B1C3條件進(jìn)行提取，測(cè)定落新婦苷、新落新婦苷、異落新婦苷、新異落新婦苷和黃杞苷的含量，結(jié)果見表7。3 批驗(yàn)證試驗(yàn)綜合評(píng)分均值為78.56，RSD值為0.34%，表明該提取方法工藝穩(wěn)定可行，重復(fù)性較好，可用于土茯苓的提取制備。

表7 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果(n ＝3)Tab 7 Verification test (n ＝3)

3 討論

3.1 提取方法及測(cè)定方法的選擇

中藥提取常用的方法有加熱回流提取法、超聲提取法、微波提取法、浸漬法、酶提取法等，本試驗(yàn)采用前3 種提取方法制備土茯苓提取物，通過比較提取物的得率，確定超聲提取法能夠更加快速高效地提取出土茯苓二氫黃酮醇類化合物。

目前對(duì)于土茯苓提取工藝的研究中多采用紫外分光光度法測(cè)定土茯苓中總黃酮的含量，而僅以土茯苓總黃酮的含量難以準(zhǔn)確評(píng)價(jià)藥材的整體質(zhì)量。因此本文采用高效液相色譜法測(cè)定土茯苓中各質(zhì)量標(biāo)志性成分的含量，更加全面準(zhǔn)確地評(píng)價(jià)藥材的質(zhì)量。

3.2 評(píng)價(jià)指標(biāo)及指標(biāo)權(quán)重的確定

落新婦苷和黃杞苷是土茯苓中重要的化學(xué)成分，也是土茯苓藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)的標(biāo)志性化合物，其中落新婦苷為熱不穩(wěn)定化合物，在較高溫度下容易分解成其異構(gòu)體，落新婦苷的異構(gòu)體分別為新落新婦苷、異落新婦苷以及新異落新婦苷。因此，本試驗(yàn)選取落新婦苷及其3 個(gè)異構(gòu)體，以及黃杞苷作為確定土茯苓醇提工藝的含量測(cè)定的評(píng)價(jià)指標(biāo)。

指標(biāo)權(quán)重系數(shù)的確定主要運(yùn)用AHP，AHP在進(jìn)行賦權(quán)時(shí)，通過數(shù)理運(yùn)算將各指標(biāo)的重要性轉(zhuǎn)變?yōu)榭闪炕臋?quán)重系數(shù)，這一過程雖然也存在一定的主觀性，但比起單純憑借經(jīng)驗(yàn)賦值少了盲目性和隨意性[24]，因此，AHP 應(yīng)用于同一種藥材中多種活性成分同時(shí)提取的工藝研究進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，其方法更為科學(xué)合理。

3.3 最佳工藝的篩選

通過對(duì)超聲提取法進(jìn)行單因素試驗(yàn)，根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，并結(jié)合AHP 篩選出對(duì)于土茯苓中5 種二氫黃酮醇類化合物最佳的乙醇提取工藝，即土茯苓藥材過60 目篩，采用60%乙醇，固液比為1∶10，浸泡8 h，40 ℃超聲提取2 次，每次提取30 min。驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果表明，基于AHP 確定的土茯苓中5 種二氫黃酮醇類成分含量的權(quán)重系數(shù)范圍的綜合評(píng)分作為優(yōu)選最佳提取工藝的指標(biāo)是科學(xué)合理的，且該優(yōu)選工藝簡(jiǎn)單易操作、穩(wěn)定可行，為中藥有效成分的提取工藝篩選指標(biāo)的確定提供了新思路。