利培酮治療對(duì)不同性別精神分裂癥發(fā)育模型小鼠行為學(xué)的影響

楊洋，楊靜靜，丁閃，唐亞梅，劉勇*（.中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院檢驗(yàn)科，長(zhǎng)沙 400；.中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院精神衛(wèi)生研究所，長(zhǎng)沙 400）

精神分裂癥（schizophrenia，SZ）是一種嚴(yán)重的精神疾病，臨床上主要以思維、情感和行為的分裂以及精神活動(dòng)與環(huán)境不協(xié)調(diào)為主要特征，發(fā)病率和致殘率高，確切發(fā)病機(jī)制未明。利培酮（risperdone，RIS）是近年來臨床上廣泛使用的一種非典型抗精神病藥物，為多巴胺D2受體和5-羥色胺2A（5-HT2A）受體雙重拮抗劑，長(zhǎng)期用藥可引起血清催乳素的升高，導(dǎo)致骨質(zhì)疏松、泌乳、女性閉經(jīng)或月經(jīng)紊亂等[1]。國(guó)內(nèi)外SZ 動(dòng)物模型研究大多使用雄鼠，而雌鼠的相關(guān)研究報(bào)道較少，可能是因?yàn)榇剖笥猩碇芷?，體內(nèi)激素和酶的水平不穩(wěn)定，對(duì)外界刺激也比較敏感，行為學(xué)不如雄鼠穩(wěn)定等。本研究擬以近交系C57BL/6 小鼠為研究對(duì)象，在神經(jīng)發(fā)育的關(guān)鍵期——圍產(chǎn)期，采用非競(jìng)爭(zhēng)性N-甲基-D-天門冬氨酸（NMDA）受體拮抗劑地卓西平馬來酸鹽（MK-801）重復(fù)處理，建立不同性別的SZ 發(fā)育小鼠模型；并予以RIS 干預(yù)SZ 發(fā)育模型小鼠；初步探討RIS 干預(yù)下不同性別SZ 發(fā)育模型小鼠的自發(fā)活動(dòng)和社會(huì)交往行為變化，為進(jìn)一步在細(xì)胞和分子水平上研究RIS 致血清催乳素升高的病理機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF 級(jí)，新生C57BL/6 小鼠，體質(zhì)量1 ～2 g，共60 只，雌雄各半（湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司），小鼠飼養(yǎng)于動(dòng)物房中，維持室溫在（24±2）℃，濕度50%～60%，采用12 h 晝夜節(jié)律7：00 ～19：00；所有實(shí)驗(yàn)都在8：00 ～17：00 完成。

1.2 試藥

MK-801、利培酮（美國(guó)Sigma Aldrich 公司，純度均＞98%）。冰乙酸、氫氧化鈉（NaOH）（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

MK-801 溶于滅菌生理鹽水（NS）中，配成0.06 mg·mL－1溶液，分裝儲(chǔ)存于－70℃冰箱備用。氫氧化鈉溶解于雙蒸水中配成1 mol·L－1的NaOH 溶液。RIS 溶解于含1 μL·mL－1冰乙酸的雙蒸水中，用1 mol·L－1NaOH 溶液調(diào)節(jié)pH 至6.0，配成0.03 mg·mL－1的溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。所有藥物和生理鹽水均按照10 mL·kg－1腹腔注射。

1.3 儀器

電子天平（SF-400C 貝意克設(shè)備技術(shù)有限公司，安徽），分析天平（METTLER AE240，瑞士），pH 計(jì)（MTTLER TOLEDO De1ta320，瑞士），數(shù)碼攝像機(jī)（Sony DCR-HC40E，日本），曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)測(cè)試系統(tǒng)（ENV 515，Med Associates Inca Vermont，USA），社會(huì)交往實(shí)驗(yàn)測(cè)試箱（自制）。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組及處理

60 只來自15 窩新生C57BL/6 小鼠，雌雄各半，按性別分為兩大組，每大組又隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組（Model）和RIS 治療組，每組10只。各組仔鼠于P7 ～11 d 每日稱重一次，模型組和RIS 治療組于P7 d 腹腔注射0.6 mg·kg－1的MK-801 腹腔注射，對(duì)照組以NS 平行處理，注射體積為10 mL·kg－1，每日8：00 ～9：00注射1 次，連續(xù)注射5 d，仔鼠于P21 d 斷奶。P45 ～59 d 各組小鼠每日稱重一次，RIS 治療組于P45 d 腹腔注射0.3 mg·kg－1RIS，對(duì)照組和模型組小鼠以NS 平行處理，注射體積為10 mL·kg－1，每日1 次，連續(xù)注射15 d。P60 d 開始進(jìn)行曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)和社會(huì)交往實(shí)驗(yàn)。

2.2 自發(fā)活動(dòng)測(cè)試

自發(fā)活動(dòng)測(cè)試是一種用來評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物（主要指大鼠和小鼠）在新環(huán)境中的自發(fā)活動(dòng)水平、緊張焦慮狀態(tài)、刻板行為和探究行為等的實(shí)驗(yàn)方法。自發(fā)活動(dòng)測(cè)試箱為43.2 cm×43.2 cm×30.5 cm 規(guī)格的有機(jī)玻璃敞箱，四周安裝16×16×2的紅外線網(wǎng)絡(luò)跟蹤監(jiān)測(cè)系統(tǒng)。實(shí)驗(yàn)在暗光、安靜的房間內(nèi)進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)開始前30 min 將小鼠連同飼養(yǎng)籠一起轉(zhuǎn)移到行為學(xué)實(shí)驗(yàn)室，使其適應(yīng)實(shí)驗(yàn)環(huán)境，實(shí)驗(yàn)時(shí)讓小鼠自由活動(dòng)10 min，測(cè)試系統(tǒng)自動(dòng)記錄小鼠的活動(dòng)情況和位置信息，通過數(shù)據(jù)采集和分析處理系統(tǒng)在電腦中模擬出小鼠在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中的運(yùn)動(dòng)軌跡，從而進(jìn)行相應(yīng)的分析。每只小鼠實(shí)驗(yàn)結(jié)束后以70%乙醇清洗實(shí)驗(yàn)箱。

2.3 社會(huì)交往測(cè)試

社會(huì)交往測(cè)試用于評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的社交和回避社交功能，社交功能缺陷是SZ 的主要陰性癥狀之一。社會(huì)交往測(cè)試箱為43.2 cm×43.2 cm×30.5 cm 規(guī)格的有機(jī)玻璃敞箱。實(shí)驗(yàn)前各組小鼠單只分籠飼養(yǎng)10 d，在分籠飼養(yǎng)的第9 ～10日，每日將單只小鼠放入社會(huì)交往測(cè)試箱中適應(yīng)10 min，第10日測(cè)試箱適應(yīng)完畢后，將各組小鼠同組內(nèi)兩兩配對(duì)，配對(duì)小鼠的體質(zhì)量差控制在2 g 以內(nèi)，第11日將各組配對(duì)小鼠每次兩只同時(shí)放入社會(huì)交往測(cè)試箱中，每對(duì)小鼠的測(cè)試時(shí)間為10 min，用數(shù)碼相機(jī)記錄配對(duì)小鼠的行為并進(jìn)行分析。小鼠的社會(huì)交往行為主要分為兩種，即攻擊性行為和非攻擊性行為，攻擊性行為包括與配對(duì)小鼠的撕咬、踢打、摔跤和拳擊等行為，非攻擊性行為包括與配對(duì)小鼠的社交性玩耍、聞嗅、理毛和尾隨等行為。評(píng)價(jià)指標(biāo)為非攻擊性行為百分比，非攻擊性行為百分比＝非攻擊性行為時(shí)間/（非攻擊性行為時(shí)間＋攻擊性行為時(shí)間）×100%。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析。曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)和社會(huì)交往實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)不同性別間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），方差分析存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義時(shí)，進(jìn)一步兩兩比較采用Levene 方差齊性檢驗(yàn)，方差齊時(shí)采用LSD-t檢驗(yàn)，方差不齊時(shí)采用Tamhane’sT2檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 RIS 治療對(duì)不同性別SZ 發(fā)育模型小鼠自發(fā)活動(dòng)的影響

如表1所示，與對(duì)照組比較，雄性或雌性模型組小鼠、RIS 治療組小鼠自發(fā)活動(dòng)總路程均顯著增加（P＜0.05）；與模型組比較，雄性或雌性RIS 治療組小鼠自發(fā)活動(dòng)總路程均顯著減少（P＜0.05）。各組組內(nèi)雄性小鼠與雌性比較，自發(fā)活動(dòng)總路程顯著增加（P＜0.05）。

表1 各組不同性別SZ 發(fā)育模型小鼠自發(fā)活動(dòng)總路程的比較Tab 1 Total distance of spontaneous activities in SZ developmental model mice of different sex groups

3.2 RIS 治療對(duì)不同性別SZ 發(fā)育模型小鼠社交功能的影響

如表2所示，與對(duì)照組比較，雄性或雌性模型組小鼠社會(huì)交往時(shí)間、非攻擊性行為百分比均顯著減少（P＜0.05，P＜0.01），雄性或雌性RIS 治療組均無顯著性差異（P＞0.05）；與模型組比較，雄性或雌性RIS 治療組小鼠社會(huì)交往時(shí)間、非攻擊性行為百分比均顯著增加（P＜0.05，P＜0.01）。各組組內(nèi)雄性小鼠與雌性比較，社會(huì)交往時(shí)間無顯著性差異（P＞0.05），而非攻擊性行為百分比顯著增加（P＜0.05）。

表2 各組不同性別SZ 發(fā)育模型小鼠社會(huì)交往功能的比較Tab 2 Social communication function of SZ developmental model mice of different sex groups

4 討論

SZ 的病因及發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，涉及到遺傳、環(huán)境、社會(huì)和心理學(xué)等諸多因素。SZ 的臨床治療及康復(fù)效果并不理想，由于倫理學(xué)、安全性以及SZ 臨床研究手段的局限性，對(duì)SZ 病因和病理機(jī)制的研究一直未取得突破性的進(jìn)展。C57BL/6 小鼠是近交系小鼠，應(yīng)激反應(yīng)均一，實(shí)驗(yàn)結(jié)果精度好，可比性強(qiáng)，被廣泛用于遺傳學(xué)、免疫學(xué)和生理學(xué)等研究，因此本研究選用C57BL/6 近交系小鼠，建立高效度的嚙齒類SZ 動(dòng)物發(fā)育模型，研究SZ 相關(guān)的癥狀學(xué)、病因?qū)W及藥理學(xué)機(jī)制。目前SZ 動(dòng)物模型構(gòu)建多以SZ 的谷氨酸功能紊亂假說為理論依據(jù)，MK-801 是一種非競(jìng)爭(zhēng)性NMDA受體拮抗劑，其對(duì)NMDA 受體的選擇性親和力較苯環(huán)已哌啶（PCP）和氯胺酮更強(qiáng)，被廣泛用于SZ 動(dòng)物模型構(gòu)建[2]。MK-801 處理嚙齒類動(dòng)物可以引起動(dòng)物產(chǎn)生一些類似SZ 的行為學(xué)和神經(jīng)生物學(xué)改變，包括自發(fā)活動(dòng)增加、感覺門控缺陷、社交和學(xué)習(xí)記憶功能缺陷等，并且一些行為學(xué)和神經(jīng)生物學(xué)改變可以被典型或非典型抗精神病藥所改善[3]。RIS 是近年來臨床上使用比較多的非典型抗精神病類藥物，盡管其克服了典型抗精神病藥物的許多不足，但由于其作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的基礎(chǔ)神經(jīng)通路，可能引起女性患者的內(nèi)分泌功能失調(diào)，如血清催乳素升高導(dǎo)致的泌乳、骨質(zhì)疏松、女性月經(jīng)紊亂和閉經(jīng)等不良反應(yīng)[4]。雖然雌鼠有生理周期，體內(nèi)激素和酶的水平波動(dòng)較大，行為學(xué)不如雄鼠穩(wěn)定，建立SZ 動(dòng)物模型存在不足，但鑒于上述與性別相關(guān)的病理改變，有必要開展雌性和雄性SZ 動(dòng)物模型的比較研究，以期為SZ 性別相關(guān)的病理學(xué)研究提供可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)是可觀察自然狀態(tài)下嚙齒類動(dòng)物在新異環(huán)境中的活動(dòng)情況，主要用來評(píng)價(jià)動(dòng)物的中樞興奮狀態(tài)、運(yùn)動(dòng)功能、探索行為、緊張度和情緒反應(yīng)等[5]。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中自發(fā)活動(dòng)總路程增加表示實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中樞興奮性增加。本研究中MK-801 誘導(dǎo)的SZ 發(fā)育模型小鼠（雄性或雌性）自發(fā)活動(dòng)總路程較對(duì)照組均顯著增加，表明SZ 發(fā)育模型組小鼠的中樞興奮性增加，這與既往研究報(bào)道一致[6]。RIS 治療組小鼠自發(fā)活動(dòng)總路程較SZ 發(fā)育模型組顯著減少，表明非典型抗精神病藥物RIS 給藥改善了SZ 發(fā)育模型小鼠的自發(fā)活動(dòng)增加。研究表明MK-801 誘導(dǎo)的小鼠自發(fā)活動(dòng)增加與NMDA 受體阻斷觸發(fā)的中腦邊緣尤其是伏核部多巴胺的釋放增加有關(guān)，然而一些單胺類遞質(zhì)缺乏的SZ 動(dòng)物模型也表現(xiàn)出自發(fā)活動(dòng)增加，因此MK-801 誘導(dǎo)的小鼠自發(fā)活動(dòng)增加可能涉及大腦多個(gè)神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)[7]。有研究表明，自發(fā)活動(dòng)的增加與大腦谷氨酸、γ-氨基丁酸和多巴胺等遞質(zhì)系統(tǒng)的相互作用密切相關(guān)[8]。本研究各組雄性小鼠的自發(fā)活動(dòng)總路程明顯大于同組的雌鼠，表明不同性別小鼠的自發(fā)活動(dòng)能力存在差異，雌性小鼠相對(duì)比較安靜少動(dòng)，而雄性小鼠多動(dòng)，喜歡打斗，活動(dòng)能力較強(qiáng)。雌鼠存在生理周期，其體內(nèi)激素和酶的代謝水平不穩(wěn)定，對(duì)藥物的反應(yīng)性也有不同，這些因素可能導(dǎo)致了自發(fā)活動(dòng)的差異，但究竟哪種機(jī)制發(fā)揮主要作用目前仍不清楚，可能是多種途徑共同作用的結(jié)果，具體原因有待進(jìn)一步深入研究。

社交功能缺陷是SZ 陰性癥狀的主要表現(xiàn)之一，SZ 患者往往有多種社會(huì)功能障礙，社交功能缺陷與SZ 的異質(zhì)性和疾病進(jìn)展有關(guān)[9]。臨床研究表明，NMDA 受體拮抗劑可以誘導(dǎo)嚙齒類、靈長(zhǎng)類和人類出現(xiàn)社交功能損害[10]，并且社交功能損害可以被一些抗精神病藥物所逆轉(zhuǎn)。NMDA 受體拮抗劑誘導(dǎo)的社交功能損害可能與前額葉皮質(zhì)區(qū)的5-HT 和多巴胺遞質(zhì)系統(tǒng)功能紊亂有關(guān)，主要表現(xiàn)為前額葉皮質(zhì)區(qū)5-HT 系統(tǒng)較多巴胺系統(tǒng)功能活動(dòng)增強(qiáng)[11]。本研究社會(huì)交往實(shí)驗(yàn)中，正常對(duì)照組、SZ 發(fā)育模型組及RIS 治療組各組小鼠的總活動(dòng)時(shí)間比較無顯著性差異，表明MK-801 和RIS 處理對(duì)小鼠總體活動(dòng)水平無明顯影響。SZ 發(fā)育模型組小鼠社會(huì)交往時(shí)間較正常對(duì)照組顯著減少，RIS 治療組小鼠社會(huì)交往時(shí)間與正常對(duì)照組比較無顯著性差異，RIS 治療組小鼠社會(huì)交往時(shí)間較SZ 發(fā)育模型組增加，表明SZ 發(fā)育模型組小鼠成年后社交行為明顯減少，0.3 mg·kg－1RIS可以完全逆轉(zhuǎn)MK-801 誘導(dǎo)的小鼠社交行為減少。各組社交行為中非攻擊性行為百分比也不同，SZ發(fā)育模型組小鼠的非攻擊性行為百分比顯著小于正常對(duì)照組，而RIS 治療組小鼠的非攻擊性行為百分比與正常對(duì)照組接近，顯著高于SZ 發(fā)育模型組，表明圍產(chǎn)期MK-801 重復(fù)處理小鼠可致小鼠成年后社交行為中攻擊性行為增加，非典型抗精神病藥RIS 可以逆轉(zhuǎn)MK-801 誘導(dǎo)的小鼠攻擊性行為增加，與Wang 等[12-13]用NMDA 受體拮抗劑PCP 處理動(dòng)物的結(jié)果一致。本研究中各組雄性小鼠的非攻擊性行為百分比均顯著低于同組雌鼠，表明雄性小鼠社會(huì)交往行為中的攻擊性行為較雌性小鼠顯著增加，由于雌性與雄性小鼠激素及代謝水平等的差異，雌性小鼠性情溫和，通常較少發(fā)生打斗現(xiàn)象，而雄性小鼠通常無法和平相處，時(shí)常打斗，所以各組雄性小鼠的攻擊性行為較雌鼠均顯著增多。綜上可見，圍產(chǎn)期MK-801重復(fù)處理誘導(dǎo)的SZ 發(fā)育模型雌性小鼠與雄性模型小鼠比較，雖存在行為學(xué)的顯著差異，但SZ雌性模型小鼠與雄性小鼠類似，存在明顯的自發(fā)活動(dòng)和社交功能損害，可部分模擬SZ 的陽性和陰性癥狀，作為SZ 雄性動(dòng)物模型的有效補(bǔ)充，可用于SZ 性別相關(guān)的病理機(jī)制研究。本研究中RIS 給藥一定程度逆轉(zhuǎn)了MK-801 誘導(dǎo)的小鼠自發(fā)活動(dòng)增加和社交功能損害，這可能與RIS 對(duì)D2受體、5-HT2A受體、腎上腺素α1受體等的拮抗作用有關(guān)，介導(dǎo)這些行為改變的神經(jīng)機(jī)制復(fù)雜，有待進(jìn)一步的研究探索其作用途徑和過程。